全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 19 卷　第 2 期 1999 年　4 月
Vol.19　No.2 April , 　1999
高寒藏药———抱茎獐牙菜组织培养研究
及其愈伤组织有效成分的测定
向凤宁1　邢梅青1＊＊　夏光敏1　胡风祖2　李　毅2
(1.山东大学 ,济南　250100)　(2.中科院西北高原生物研究所 ,西宁　810001)
摘　要　从抱茎獐牙菜的胚轴 、幼叶及未成熟种子诱导出愈伤组织并再生植株 ,试
验选用 MS 、B5 和 N6三种培养基 ,其中以附加 2.4-D3.0mg/L +6-BA0.5mg/L
的 MS培养基诱导率最高;以附加 6-BA0.5mg/L +NAA 0.2mg/L 的 MS 培养基
分化苗频率最高;以附加 2.4-D2.0mg/ L+6-BA0.5mg/L 的 MS培养基愈伤组
织的生长最好 。结果表明 ,外植体 ,培养基 ,激素等对愈伤组织诱导 、继代和分化均
有明显影响 。采用高压液相色谱法(HPLC)测定抱茎獐牙菜愈伤组织中齐墩果酸
含量的结果表明 ,愈伤组织中齐果墩酸含量因培养基 、继代培养时间的不同而有所
差异 。
关键词　抱茎獐牙菜;组织培养;齐墩果酸
TISSUE CULTURE AND ANTIHEPATITIS CONSTITUENT
IN CALLI OF SWERTIA FRANCHETIANA H.SMITH
Xiang Feng-ning1　Xing Mei-qing1＊＊　Xia Guang-min1　Hu Feng-zu2　Li Yi2
(1.Shangdong University , Jinan 250100)
(2.Nor thwest Plateau Institute of Biolog y , Academia Sinica , Xining 810001)
Abstract　Calli and the regenerative plants w ere induced from young leaves , immature
seeds and hypocoty l of Swert ia franchetiana H.Smith.Three kinds of media , MS ,
B5 and N6 were set up in the experiment.Calli were established with the highest fre-
quency onto M S medeium containing 3mg/L 2 ,4-D and 0.5mg/ L 6BA.The regen-
erat ive plants are obtained w ith the highest f requency onto M S medeium , Containing
0.5mg/L 6-BA and 0.2mg/ L NAA.The induction and maintenence and differentia-
山东大学微生物技术国家重点实验室资助课题＊＊　现工作单位山东省实验中学
tion of the calli w ere affected markly by the basic media and compound 2 ,4-D and 6
-BA in the media etc.The Oleanolic acid content in calli of Swertia franchetiana H.
Smith were determined by HPLC method.
Key words　Swertia franchetiana H .Smith;Tissue culture;Oleanolic acid
藏药植物———抱茎獐牙菜(Swert ia franchetiana H.Smith),别名藏茵陈 ,藏名斗大 ,系
龙胆科植物(Gentianaceae),在青海省生于海拔 2200-3600 米的高寒地区 ,一年生草本 ,全
草入药 ,有清热解毒 ,舒肝利胆之功效 ,与同科植物川西獐牙菜(Swertia mussoti i Franch)同
等入药〔1〕 。专治黄胆型肝炎 ,病毒型肝炎。目前 ,其野生资源不能满足医药生产的需要 ,抱
茎獐牙菜的组织培养国内外尚无报道。因此 ,我们对其进行组织培养 ,以期探索其无性快速
繁殖的新路子 ,解决其药量不足的问题 。
前人报道 ,川西獐牙菜和抱茎獐牙菜的抗肝炎有效成分为齐果墩酸和芒果甙〔2 ,3〕 ,为探
索抱茎獐牙菜诱导的愈伤组织是否含有抗肝炎有效成分 ,我们采用高压液相色谱法测定了
其愈伤组织的齐果墩酸含量。
1　材料和方法
1.1　愈伤组织诱导:供试材料为野生品种抱茎獐牙菜 ,采自青海省西宁市和大通县。外植
体为未成熟种子(未形成种皮 、1mm 左右 、淡黄色),幼叶和胚轴 ,接种时 ,将未成熟种子浸入
0.1%升汞溶液中 5 ～ 7min ,无菌水冲洗 3次 ,用吸管分别吸入备好的诱导培养基中和无激
素MS培养基上萌发出苗 ,待种子出苗后 ,截取 4 ～ 5mm 小段的胚轴和 0.5mm2 小块幼叶于
诱导培养基上。
培养基以 MS 为基本培养基 ,还试用了 B5 、N6两种培养基 ,附加生长素和 6-苄基腺嘌
呤 ,其浓度组合见下文 。蔗糖 3%,琼脂 0.6%, PH 调至 5.8 , 在 137.3kPa 压力下灭菌
20min ,在温度 25±2℃,光强 1000 ～ 1200Lux ,每日光照 10hr或无光下培养。
1.2　愈伤组织继代　愈伤组织继代 6次日龄为 30d时 ,转至 MS和 B5培养基上 ,激素组合
为 2.4-D2.0mg/ L+6-BA1.0mg/L ,每种接种 10瓶 ,培养 30d后 ,测定愈伤组织鲜重 。其
他不同激素组合的愈伤组织鲜重按同法测定 ,培养条件同上 。愈伤组织每月继代一次 ,进行
转移培养 。培养细胞生长量以细胞鲜重的增长倍数表示。即接种后若干天细胞鲜重与接种
时细胞鲜重之比 。
1.3　愈伤组织分化　将诱导的愈伤组织继代培养 6次后转入分化培养基上 ,分化培养基为
附加 6-BA0.5mg/ L +NAA0.2mg/L 的 MS 培养基 , 壮苗培养基为 1/2MS +0.1mg/L
NAA ,培养条件同上。
1.4　抱茎獐牙菜原植物和愈伤组织中齐墩果酸含量测定　(1)样品提取:先将抱茎獐牙菜
原植物研磨成细粉 ,称取 100mg;然后分别取已继代培养 1 、3 、6 、12个月的愈伤组织(未成熟
种子所诱导 100mg ,置索氏提取器中 ,加 10ml氯仿回流提取 3hr ,过滤 ,残渣用氯仿洗涤 2
次 ,合并后蒸去氯仿 ,残留物用甲醇溶解后转至 10ml容量瓶中定溶。(2)HPLC 法:仪器
Waters 600E 高压液相色谱仪 、C18柱 、UV 检测 、λ220nm 、746 数据处理机。移动相:甲醇
———水(80%)。标准品溶液:齐墩果酸配制成 0.013mg/ml甲醇溶液。样品溶液:上述各提
取液 ,制成 10mg/ml甲醇液。齐墩果酸标准品由中国药品生物制品检定所提供 ,样品分析:
1732 期　　　　　向凤宁等:高寒藏药———抱茎獐牙菜组织培养研究及其愈伤组织有效成分的测定
取样品 10ul重复进样 ,记录谱峰及积分值 ,并分别根据响应因子计算含量(μg/g 鲜重)。取
标准品液 5μl ,记录标准图谱及积分值 ,重复进样 5次 ,至获得的谱峰积分值(r%<5%),计
算其响应因子。
2　实验结果
2.1　愈伤组织的诱导　培养 1周后 ,胚轴两端切口处膨大;2周左右 ,未成熟种子整体膨胀
或先出苗再从幼叶和胚轴处整体膨胀(图版 Ⅰ , 1);4周左右 ,幼叶从叶脉周围处膨胀 ,开始
形成愈伤组织。
2.1.1　影响愈伤组织诱导率的因素
培养基:在同样附加 2.4-D3mg/ L+6-BA0.5mg/L 的 MS 、B5 、N6三种培养基上 ,未
成熟种子 、幼叶和胚轴均诱导出愈伤组织 ,但三种培养基对不同外植体诱导愈伤组织的频率
有一定差异 。从表 1可见 ,培养基中 ,以 MS 表现最好 ,B5次之 ,N6较差。表明不同培养基
对不同外植体愈伤组织诱导有明显影响 。
表 1 不同培养基愈伤组织的诱导率
Table 1 Frequency of call i induced from different media
　　　　培养基 medium
　　　　　　　　外植体
项　目　　　　　　explant
　　it em
MS B5 N 6
胚轴
hypocotyl
未熟种
immatu re
seed
幼叶
young
leaves
胚轴
hypocotyl
末熟种
immature
seed
幼叶
young
leaves
胚轴
hypocotyl
末熟种
immature
seed
幼叶
young
leaves
接种数
No.of inoculat ion 21 72 14 16 65 19 18 45 15
成愈数
No.of calli formed 21 70 4 16 61 4 13 32 1
诱导率%
freq.of induct ion 100 97.2 28.6 100 93.8 21.1 72.2 68.9 6.6
外植体:抱茎獐牙菜的未成熟种子 、幼叶和胚轴在 MS+2.4-D3mg/L+6-BA0.5mg/
L 的同一种培养基上 ,愈伤组织诱导率见表 2。结果表明 ,胚轴最易诱导 ,其次是未成熟种
子 ,叶片最难诱导。
激素组合:以 MS基本培养基添加不同激素组合 ,胚轴 、未成熟种子和幼叶都诱导出愈
伤组织 。单加生长素(2.4-D)的培养基 I 形成愈伤组织较少 ,兼用生长素加 6-苄基腺嘌
呤的培养基 II 、III 、IV 、V 不但愈伤组织诱导率高 ,生长也较快 ,其中以培养基 IV 诱导率最
高。同时添加 NAA和 6-BA ,愈伤组织易长出不定根(表Ⅱ)。
2.2　愈伤组织的继代培养
2.2.1　培养基　在抱茎獐牙菜愈伤组织继代培养半年后 ,观察了其在 MS 和 B5 培养基上
生长的情况 ,结果(表 3)表明 ,MS 培养基比 B5培养基更适于其愈伤组织的生长。在两种培
养基上生长的愈伤组织 ,仔细比较发现既使同一外植体诱导的愈伤组织 ,在继代培养过程中
也有变化。长势有强有弱 ,颜色有深有浅 。培养半年时 ,愈伤组织颜色多为黄色 ,少数为浅
黄色或白色质地变硬(图版Ⅰ ,2)。
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　　表 2 不同激素愈伤组织的诱导率
Table 2 Frequency of call i induced from different hormone
代号
培养基
附加激素
medium
(mg/ L)
培　　养　　材　　料 material of culture
胚轴 hypocotyl 幼叶 young leaves 未成熟种子 immature seed
接种数
No.of
inoculation
成愈数
No.of calli
formed
诱导率%
Freq.of
induction
接种数
No.of
inoculat ion
成愈数
No.of calli
formed
诱导率%
Freq.of
induct ion
接种数
No.of
inoculation
成愈数
No.of calli
f ormed
诱导率%
Freq.of
induction
I 2.4-D3.0 18 11 61.1 5 1 20.0 41 24 58.5
II
2.4-D1.0
+6-BA1.5 38 35 92.1 36 4 11.1 51 41 80.4
III
2.4-D2.0
+6-BA1.0 40 40 100 38 10 26.3 60 57 95.0
IV
2.4-D3.0
+6-BA0.5 21 21 100 14 4 28.6 72 70 97.2
V
NAA 0.4+
6-BA0.5 35 35 100 31 4 12.9 53 51 96.2
表 3 培养基对愈伤组织生长的影响
Table 3 Effect of different media on growth call i
培养基
medium
接种量(克/瓶)
ammount of inoculation
月增殖量(克/瓶)
amount of prolif eration/month
增殖倍数(倍/月)
proliferation times
MS 0.4 3.2 8.0
B5 0.4 1.7 4.25
为 10瓶平均数
2.2.2　激素组合　不同处理下培养一个月的愈伤组织称重(表 4),可以看出 ,在 2.4-2.
0mg/L +6-BA0.5mg/L 的处理下 ,愈伤组织增殖最差;在 2.4-D2.0mg/L +6-BA1.
0mg/L 时愈伤组织的增殖最快 ,同时瘤状愈伤组织的增殖效果也最好。表明在相同的 2.4
-D浓度下 , 6-BA 浓度增加到 1.0mg/ L 时 ,愈伤组织的生长速度和生长状况均最好。当
0.2mg/L 的 NAA分别同 0.4mg/ L 的 6-BA 和 0.2mg/ L 的 KT 组合时 ,生长速度均明显
降低 ,分化出大量不定根 。
2.3　愈伤组织的分化　在 6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L 的 MS培养基上 ,未成熟种子 ,
幼胚和胚轴所诱导的愈伤组织的均可产生小苗(图版Ⅰ ,3),但再生苗频率明显不同(表 5)。
结果表明 ,愈伤组织分化苗频率与其外植体有关 ,未成熟种子的分化苗频率最高(73.0%),
而幼叶仅为 49.3%。另外 ,继代培养时间对愈伤组织分化苗频率也有影响。从表 5 可见 ,
随着继代时间的增加 ,分化苗频率也逐渐降低 ,并且畸形苗(图版Ⅰ ,4)比例增高 。及时把 1
～ 2cm 高的小苗转移到壮苗培养基上 ,可获得健壮小苗。小苗长至 6 ～ 7cm 高时 ,便可移栽
于花盆。
1752 期　　　　　向凤宁等:高寒藏药———抱茎獐牙菜组织培养研究及其愈伤组织有效成分的测定
表 4 不同激素组合对愈伤组织生长的影响
Table 4 Effect of different hormone on growth call i
培养基(m g/ L)
medium
增殖倍数
proli feration
times
愈伤组织生长情况
Condit ion of grow th calli
MS+2.4-d1.0+6-BA0.5 4.57 多数浅黄色 ,少数白色或褐色 ,较疏松
light yellow (most), w hite and brown(some), more sof t
MS+2.4-D1.0+6-BA1.0 9.1
多数浅黄色 ,少数白色 ,较紧密。有颗粒状结构
light yellow(most), whi te(some), more compact , granu-
lated st ructure
MS+2.4-D2.0+6-BA0.5 1.11 多数灰白色 ,有粘稠物分泌 ,非常疏松
grey and w hi te(most), very sof t
MS+2.4=D2.0+6-BA1.0 10.8 浅黄色,多为颗粒状结构 ,较紧密
light yellow , granulated st ructure(most), more compact
MS+NAA0.2+6-BA0.4 2.4 浅黄色,有粒根分化(平均 4.4条/瓶),疏松
light yellow , some root , soft
MS+NAA0.2+KT 0.2 2.2 浅黄色,有粒根分化(平均 1.6条/瓶),疏松
light yellow , some root , soft
表 5 外植体和继代时间对愈伤组织分化苗的影响
Table 5 Effect of different explant and subculture on differentiated calli
　　　外植体
　　explant
继代时
间(月)
未成熟种子愈伤组织
calli of imature seeds
胚轴愈伤组织
calli of hypocotyl
幼叶愈伤组织
calli of young leaves
转移块数
No.of
subcultured
分化苗块数
No.of calli
regenerated
分化苗频率
Freq.of
regenerated
seedling
转移块数
No.of
subcultured
分化苗块数
No.of calli
regenerated
分化苗频率
Freq.of
regenerated
seedling
转移块数
No.of
subcultured
分化苗块数
No.of calli
regenerated
分化苗频率
Freq.of
regenerated
seedling
1 141 103 73.0 138 92 66.7 83 41 49.3
6 158 102 64.6 149 83 55.7 75 24 32.0
12 144 60 41.7 122 41 33.6 84 19 22.6
表 6 培养基对齐果墩酸含量的影响
Table 6 Effect of different media on Oleanolic acid content in calli
培养基medium MS B5 原植物(对照)
species(cont rol)
齐果墩酸含量(μg/ g)
percontent of oleanolic acid(μg/ g) 0.34 0.27 0.40
2.5　愈伤组织中齐墩果酸含量的变化 ,未成熟种子诱导的愈伤组织在 MS 和 B5 培养基上
培养 1个月时 ,愈伤组织中齐墩果酸的含量见表 6 ,结果表明 ,在 MS 培养基上 ,愈伤组织中
齐墩果酸含量比 B5培养基上稍高。愈伤组织在两种培养基上的齐墩果酸含量均低于原植
176 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　19 卷
物(对照),看来 ,在继代初期 ,愈伤组织合成齐墩果酸的能力较弱 。在不同继代培养时间中 ,
未成熟种子诱导的愈伤组织中齐墩果酸含量的变化见表 7。愈伤组织在 MS继代培养基上
继代到 3个月和 6个月时 ,齐墩果酸含量比继代 1个月时有所增高 ,同对照原植物相比 ,含
量略高 ,但到 12个月时 ,其含量又稍减 ,且低于原植物 。结果表明抱茎獐牙菜愈伤组织中齐
墩果酸含量在继代过程中有差异 ,与对照原植物相比 ,含量有所变化 。可见 ,愈伤组织在继
代培养过程中均具有合成齐果墩酸的能力 ,只是程度上有所差异 。
表 7 继代时间对愈伤组织中齐果墩酸含量的影响
Table 7　　Effect of different subculture time on Oleanol ic acid content in calli
愈伤组织继代时间
t ime of subculture calli
齐果墩酸含量(μg/ g)
percontent of oleanolic acid(μg/ g)
1
3
6
12
0.34
0.44
0.43
0.28
原植物(对照)Species(cont rol) 0.40
3　讨　　论
抱茎獐牙菜愈伤组织诱导受外植体 、培养基 、激素组合的影响。不同外植体接种在相同
或不同培养基上 ,愈伤组织的诱导差异明显 。总的情况是 ,容易产生愈伤组织的部位 ,无论
在哪一中培养基上诱导率都较高 ,如胚轴。及之则较低 ,如幼叶 。在 MS 、B5和 N6 三种培养
基中 ,以 MS附加 2.4-D3.0mg/L +6-BA0.5mg/ L 的诱导效果最好 。本实验观察到 ,生
长素对诱导抱茎獐牙菜愈伤组织是必需的。6-BA不仅能提高愈伤组织诱导频率 ,而且可
改善愈伤组织质量 ,有利于致密愈伤组织的形成 。可见 ,兼用生长素和 6-BA增效作用很
明显 。这一结果与一些报道不一致〔4〕 ,但与 Flick 等的报道一致〔5〕。
抱茎獐牙菜愈伤组织的生长速度受培养基和激素的影响。MS 和 B5 培养基相比 ,MS
更适于抱茎獐牙菜愈伤组织生长。在不同激素组合处理下 ,愈伤组织生长速度不同 ,在相同
2.4-D下 ,6-BA对愈伤组织生长起主要作用 , 6-BA浓度低时 ,愈伤组织生长差 ,较高时
则促进其生长。在愈伤组织继代培养中 ,一小部分愈伤组织易变为黄褐色 ,黄褐色愈伤组织
生活力较弱 ,继代转移时必须将其剔除 。
断代培养时间对愈伤组织分化再生能力有明显影响 。实验表明随着继代时间的延长 ,
分化苗频率逐渐下长 。关于分化问题 , Gautheret〔6〕认为分化是受特殊质质决定的 ,分化能
力的丧失是由于在培养过程中耗尽了在原有母体组织中存在的与分化有关的物质。也有的
认为在继代过程中分化能力的逐渐丧失 ,只是遗传潜能表现的丧失 。许智宏〔7〕认为植物激
素在分化中有着明显的调节作用 ,它们以直接或间接的方式影响基因的活性。分析抱茎獐
牙菜愈伤组织分化再生能力的降低 ,似乎与外源激素的种类和浓度有关。同时 ,内源激素是
否平衡也可能直接影响到愈伤组织的分化。
抱茎獐牙菜愈伤组织中测定出抗肝炎有效成分齐墩果酸 ,并且齐果墩酸的含量同川西
獐牙菜愈伤组织相近 ,从而确证了抱茎獐牙菜抗肝炎的特性 ,对进一步开发其中药品种提供
1772 期　　　　　向凤宁等:高寒藏药———抱茎獐牙菜组织培养研究及其愈伤组织有效成分的测定
了科学依据。同时可以作为川西獐牙菜的代用品同等入药 。因此其愈伤组织中齐墩果酸含
量的测定具有一定的实践意义 。
参　　考　　文　　献
1.邹寒雁 ,高承仁等.青海中药资源和开发利用研究.北京:东方出版社 , 1990
2.丁径发等.藏茵陈抗肝炎有效成分的研究.中草药 , 1980 , 11(9):391～ 392
3.孙洪发 ,樊淑芬 ,丁径业等.青海产六种“藏菌陈”生物中齐墩果酸含量测定.高原生物学集刊 , 1987 , 6(6):243～ 244
4.陈惠民等.小麦幼叶愈伤组织的诱导及器官形成.植物学报 , 1980 , 22(2):112～ 114
5.Flick C.E.Organogenesis.In:Handbook of plant cell cultu re Macmillam co , New York , 1983
6.Gautheret RJ.In:Cell diff erent iat ion anaad morphogenesi s.North Holland publ.Co Amsterdam , 1966
7.许智宏.植物的细胞分化.植物生理学通讯 , 1979 ,(3):66～ 75
图　　版　　说　　明
图版Ⅰ 　1.示未成熟种子诱导下整体愈伤化;2.示继代培养的愈伤组织(颗粒状 ,黄色或黄绿色);3.再生植株;4.丛生
苗。
Explanation of Plate
Plate Ⅰ 　1.Calli were induced f rom immature seeds;2.Subcultu ral calli;3.Regenerated plants;4.Clump plan t.
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向凤宁等:高寒藏药———抱茎獐牙菜组织培养研究及其愈伤组织有效成分的测定 图版Ⅰ
Xiang Feng-ning et al.:Tissue Culture and Antihepatitis constituent in Calli of S wertia franchetiana H.Smith
Plate Ⅰ
See explanation at the end of text