全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTAN ICAL RESEARCH
第 18卷　第 3期 1998年　 7月
Vol. 18　 No. 3 July , 　 1998
烟草中央细胞体内与离体发育中的细胞化学变化
傅　缨　孙蒙祥　杨弘远　周　嫦
(武汉大学生命科学学院植物生殖生物学研究室 ,武汉 430072)
摘　要　应用金霉素 ( C TC)、 fluphena zine ( FPZ)、荧光增白剂 ( CW)、 DAPI等荧光
探针 ,标记由大叶烟草体内直接分离和经过离体培养的中央细胞及卵器细胞 ,观察
膜结合钙及钙调素的分布与细胞壁和细胞核的动态。用碘 - 碘化钾、苏丹Ⅲ等染色
鉴定中央细胞与胚乳细胞内的淀粉与油脂。探讨了中央细胞等在受精前后与培养前
后的细胞化学变化。
关键词　烟草 ;中央细胞 ;离体培养 ;膜结合钙 ;钙调素
THE CYTOCHEMICAL CHANGES OF IN VIVO
AND IN VITRO DEVELOPED UNFERTILIZED
CENTRAL CELLS IN NICOTIANA TABACUM
Fu Ying　 Sun M eng- xiang　 Yang Hong- yuan　 Zhou Chang
( Labo ra to ry o f Plant Reproductiv e Biolog y , Colleg e of Life Science, Wuhan Univ e rsity , Wuhan 430072)
Abstract　We used chlo ro tet racycline ( CTC) , fluphena zine( FPZ) , calco fluo r w hi te
ST( CW) , DAPI and o ther probes to label the membrane- bound calcium , calmod-
ulin( CaM) , cell w all, nucleus and o ther components respectiv ely w hich dist ributed
in the isolated central cells befo re and af ter fertiliza tion and in vi tro cultured unfer-
ti li zed central cells of N icot iana tabacum var. macrophylla. Cell w all o f the isola t-
ed central cells could be detected even when the cells turned to spherical shape.
After a period of cul ture, tw o po la r nuclei sepera ted, then moved to the micropy-
la r and the chalazal par t o f the central cel l respectiv ely. Undergone one o r several
times of division, the nuclei show ed va rious sizes and shapes. Stained wi th I- KI
and SudanⅢ , unferti li zed central cells contained a few of sta rch g rains a round the
polar nuclei , but no lipid component was detected. When the central cell divided
国家自然科学基金与欧洲委员会国际合作项目 ( ERBIC 18CT960072)资助课题。　收稿日期: 1997- 9- 10
into small cell clusters in vit ro , s tarch g rains accumula ted abundantly in sha rp
contrast to the endosperm cel ls at the elongated- zygo te stag e, which were rich o f
pro tein but lack of starch. M embrane- bound calcium and CaM were mainly loca t-
ed at the cy toplasm and cy toplasmic st rands in either the in vivo or the in v itro de-
veloped central cells. Unfer ti li zed egg appa ra tus w as studied by the w ay. The cel ls
had plenti ful pro tein but few starch g rains and lipid component. The dist ribution
o f membrane ca lcium and CaM show ed no dif ference betw een tw o synergids befo re
fertili za tion; w hi le af ter fertiliza tion, the degenerated synergid show ed higher CTC
f luorescence but w eaker FPZ fluo rescence than the persistent synergiddid. The zy-
gotes w ere observ ed to contain a lo t o f protein and lipid.
Key words　N icotiana tabacum; Central cell; In vitro cul ture; M embrane- calci-
um; Calmodulin
Huang与 Russell( 1992)综述了应用电镜技术、荧光标记、免疫细胞化学和 X射线微区
分析等多项技术对被子植物雌配子体细胞壁、细胞器、 DNA、细胞骨架以及钙的研究结
果〔 7〕。但对于在众多生理过程中起重要调节作用的钙调素 ( CaM )在雌性细胞中定位的研究
目前仅限于对矮牵牛、烟草和玉米的初步观察〔 9, 10〕。至于离体培养的中央细胞的细胞学研究
则仍属空白。本文在已建立的诱导未受精中央细胞离体分裂实验系统的基础上〔4〕 ,进一步研
究了体内与离体发育的中央细胞的细胞核行为、膜结合钙和钙调素分布以及细胞内含物的
变化。同时也观察了卵器细胞的相应细胞化学变化。
1. 材料和方法
取大叶烟草 ( Nicotiana tabacum L. va rmacrophylla)开花前一天的胚珠 ,按前文所述方
法〔 4〕 ,用含 1. 5% cellulase R- 10、 1% macero zyme R- 10、 10%甘露醇、 10mmol /L CaCl2、
20mg /L 2, 4- D的酶液处理 3h,以不含酶和 2, 4- D的上述基液清洗 ,在 Olympus CK- 2倒
置显微镜下 ,用自制微吸管轻压胚珠 ,挑取逸出的中央细胞转入附加 0. 1mo l /L甘露醇、 0.
1mol / L山梨醇、 0. 25mol /L蔗糖、 0. 1%的葡萄糖、 1mg /L BA、 6- 10%椰乳 ( Sigma )、 0.
15%低熔点琼脂糖 ( Sigma ) , pH5. 8的 KM8p培养基中〔8〕 ,在微室 ( Millicell- CM PLCM
01250, M ILLIPORE)中培养。饲养细胞采用大量培养的黄花烟草 (N icotiana rustica L. )叶
肉原生质体。用不含 2, 4- D的上述酶液分离观察体内受精前的中央细胞与授粉后 1- 3d的
材料。参照傅春梅等的方法〔3〕分离受精后 4- 6d的材料。
以 5μg /ml diamidino phenylindo le( DAPI)染色 1h观察细胞核 ;以 1x10-4mo l /L chlo ro te-
tracycline( CTC)染色 15min观察膜结合钙: 以 2x10-5mo l /L f luphenazine ( FPZ)染色 15min
观察活化钙调素 ;以 I- KI染色观察淀粉兼蛋白质 ;以苏丹Ⅲ染色观察油脂 ;以荧光增白剂
calco fluor w hi te S T( CW )、脱色水溶性苯胺蓝 ( DAB)和钌红染色分别观察细胞壁的纤维
素、胼胝质与果胶质。用 Olympus IM T- 2倒置显微镜和 Olympus BH2- RFCA顺置显微
镜的荧光、明视野与微分干涉差装置观察和摄影。
2. 结　　果
2. 1　未受精中央细胞的细胞化学特征
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在分离的胚囊中 ,中央细胞除与卵器细胞一起为共同的胚囊壁所包裹外 ,本身亦具有细
胞壁 ,一般情况下二者紧贴在一起 ,光镜下难以区别 ,若分离过程中适当改变溶液渗透压可
使两层壁分开 (图版 I, 1) ,略微延长酶解时间使中央细胞呈球形逸出胚囊 ,经 CW ,钌红及脱
色苯胺蓝染色显示两层壁都具有纤维素与果胶质成分而无胼胝质积累 (图版 I, 2)。中央细
胞的大部分体积为一个大液泡所占据 ,细胞质被挤压在细胞边缘 ,两极核互相紧贴位于靠近
卵器细胞处 ,围绕极核常分布一些可被 I- KI染成蓝色的淀粉粒 ,有的中央细胞中可见清晰
的细胞质索由核向周围辐射 ,将大液泡分隔成较小的几部分。CTC和 FPZ染色显示 ,膜钙
和钙调素在中央细胞内主要分布于细胞质和细胞质索中 ,并常绕核形成亮圈 ,而液泡内检测
不到荧光 (图版 I, 3- 5)。在未受精的中央细胞中无明显的油脂分布。
2. 2　中央细胞在离体培养与体内受精后的细胞学比较
未受精的中央细胞离体培养 28h后 ,即看到富含钙调素的细胞质裹着两个极核分别移
向珠孔端与合点端 (图版 I, 6、 7) ,在胞质分裂前 ,两核已完全分开 (图版Ⅱ , 10)。培养 48-
72h后 ,完成第一次细胞分裂 ,两个子细胞体积大致均等 ,但子核有的呈球形 (图版 I, 8, 9) ,
有的却呈梨形 (图版Ⅱ , 11)且大小不一。4- 8d后 ,中央细胞分裂成小的细胞团 ,此时各子细
胞间形状大小以及核的差异极为显著。此后细胞内大量积累淀粉 ,生长停滞 ,最终淀粉粒充
满细胞 ,细胞团死亡。从授粉后 1- 6天的胚珠中分离出体内发育的中央细胞 ,染色观察发现 ,
刚受精的中央细胞内仍可看到少许淀粉粒 ,而处于合子拉长时期的多细胞胚乳中无淀粉的
积累 ,此时的胚乳细胞彼此在细胞与核的体积上也存在差异 ,但不如离体分裂的细胞那样悬
殊 ,细胞中含有较多蛋白质和油脂。
无论是培养的中央细胞还是由体内直接分离的胚乳细胞 , CTC和 FPZ的荧光均与未
受精的中央细胞一样分布于细胞质和细胞质索中 ,而在液泡与细胞核内检测不到 ,但有时核
为浓厚的细胞质包裹 ,此时 ,细胞核的部位仍能看到荧光 (图版 I, 7;图版Ⅱ , 10、 12、 16)。通
常 ,胚乳细胞的荧光强度比同期合子的为弱。
2. 3　卵器细胞受精前后的细胞化学变化
未受精的卵与两个助细胞各有一个大液泡 ,助细胞的液泡位于合点端而卵细胞则位于
珠孔端 ,卵细胞的液泡体积略小。三个细胞的壁均包含纤维素和果胶质成分 ,且一般近珠孔
端比近合点端的 CW荧光为强 (图版Ⅱ , 13)。在分离过程中因渗透压变化可出现卵器细胞
间的原位融合现象〔1〕 ,尚未完全融合的卵器细胞原位融合体局部已有强烈的 CW荧光 (图版
Ⅱ , 14、 15)。卵器三个细胞中膜钙和钙调素亦主要分布于细胞质区域 ,细胞间 CTC荧光强度
无明显差异 (图版 Ⅱ , 17) ,两个助细胞间的 FPZ荧光强度比较一致 (图版Ⅱ , 18)但比卵细
胞中的略弱。卵器细胞的原位融合体在刚融合时 ,各细胞的胞质间还存在界限 ,然后逐渐汇
集 , CTC和 FPZ荧光也趋于彼此融合 ,有时可见围绕三个核形成亮圈 (图版 I, 4)。
授粉后 24h,两个助细胞在膜钙和钙调素的分布上出现差异 ,一般退化助细胞 CTC荧
光强于宿存助细胞 (图版Ⅱ , 19) ,而 FPZ荧光却明显低于后者 (图版Ⅱ , 22)。刚受精的合子
中 , C TC与 FPZ荧光在珠孔端略强 ,而合点端的核周围则有一较暗的区域 (图版Ⅱ , 20-
22)。合子伸长后 ,珠孔端的荧光仍然较强 ,但合点端的暗圈却趋于不明显 (图版Ⅱ , 23)。卵器
细胞无论受精与否 ,均不积累淀粉、油脂 ,但富含蛋白质。此外 ,分离的受精前后的胚囊在分
离过程中 ,其丝状器常拖曳在外 ,经鉴定含油脂与纤维素成分。
348 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　 18卷
3. 讨　　论
3. 1　未受精中央细胞离体培养条件下极核的行为
傅缨等 ( 1997)曾诱导了未受精中央细胞在离体条件下的细胞分裂〔 4〕 ,但其极核在细胞
分裂中的行为不明。在本实验中所分离的中央细胞 ,二个极核均未融合成次生核 ,因此 ,对其
培养后的行为可有三种推测: ( 1)两极核先融合成一个次生核 ,经有丝分裂后的两个子细胞
中各有一个二倍体核 ; ( 2)两极核不融合而只是简单的分向两极 ,两个子细胞中的核仍为单
倍体 ; ( 3)两极核经无丝分裂形成大小不等、倍性复杂的子核。本文结果未证实第一种推测 ,
只观察到第二种情况 ,而第三种假设同样是可能存在的。DAPI染色显示 ,中央细胞第一次
分裂后外形均等的两子细胞 ,核的形态大小却存在较明显的区别 ;当形成多细胞团时 ,细胞
间和细胞核间的差异更加显著。钙与钙调素信使系统现已被普遍认为在细胞分裂的调控中
担负重要角色 ,它与核被膜的崩溃和重组、细胞骨架的解聚、染色体运动等有关〔5, 6〕。在纵贯
中央细胞两极牵引细胞核运动的细胞质索中存在强烈的 FPZ荧光 ,表明这一信使系统可能
参与极核的运动与分裂中的行为。
3. 2　中央细胞离体培养发育前途的探讨
CW荧光表明中央细胞变成球形从胚囊中逸出后仍具有细胞壁成分 ,这说明本实验所
采用的分离方法较少酶的伤害 ,而且壁的存在通常是细胞分裂的前提 ,因此这可能是中央细
胞在离体条件下能很快分裂的原因之一。但中央细胞分裂数次后即停止生长 ,开始大量积累
淀粉 ,这与分裂次数相仿的体内发育的早期胚乳细胞的行为不同 ,后者富含蛋白质而少有淀
粉。这说明中央细胞的离体发育出现了障碍 ,所采取的培养条件虽能启动其分裂却不利于持
续发育。但鉴于未传粉子房和胚珠培养〔 12〕以及胚乳培养〔 2〕的成功 ,在改进培养技术后 ,中央
细胞离体再生植株仍然是有希望的。
3. 3　助细胞受精前后膜钙与活化钙调素的变化
Tirlapur等用 CTC与 FPZ观察矮牵牛未受精的分离胚囊和烟草徒手切片的胚囊 ,显
示矮牵牛、烟草的 CTC与矮牵牛的 FPZ荧光在两助细胞间有明显差异 ,并认为 ,助细胞的
退化不是随机的 ,而是受精前即已确定了的〔9〕。但我们的观察显示烟草未受精助细胞之间
CTC或 FPZ的荧光基本一致 ,而受精后退化助细胞中 CTC荧光明显强于宿存助细胞 , FPZ
荧光的变化则正好相反。膜钙在一个助细胞中的积累似乎与助细胞的退化及其行使的功能
有关 ,这与 Huang等的观察结果一致〔 7〕。受精前后助细胞中活化钙调素的变化与膜钙的变
化并不保持一致的现象 ,在胡萝卜体细胞胚中亦有报道〔1 1〕 ,这可能是因为激活钙调素的并
不全是膜钙 ,而钙调节植物生理过程也并非仅通过钙调素介导的缘故。
参　　考　　文　　献
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3. 傅春梅、孙蒙祥、周嫦、杨弘远 . 烟草受精后胚囊和合子的分离及合子的离体分裂 . 植物学报 , 1996, 38( 4): 262- 267
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图　　版　　说　　明
C.中央细胞　 DS.退化助细胞　 E.卵细胞　 EA.卵器细胞原位融合体　 EN. 胚乳细胞　 PN.极核　 PS.宿存助细胞　
S.助细胞　 Z.合子
图版 I　 1. 分离的未受精胚囊 ,示中央细胞与胚囊壁脱离 ,× 400; 2. 与图 1同一胚囊示中央细胞变圆后其壁仍具 CW荧
光 ,× 400; 3. 中央细胞胞质中 FPZ荧光 ,× 450; 4. 中央细胞与卵器细胞原位融合体胞质中 FPZ荧光 ,× 400; 5. 中央细
胞胞质中 FPZ荧光 ,× 400; 6. 培养后中央细胞中两个极核在细胞质索牵引下分开 ,× 330; 7. 与图 6同一胚囊 ,示中央细
胞细胞质索中的 FPZ荧光 ,× 330; 8. 中央细胞一次分裂后产生的两个子细胞 ,箭头示细胞核 ,× 500; 9. 同图 8,箭头示细
胞核的 DAPI荧光 ,× 500。
图版Ⅱ 　 10. FPZ荧光 ,示培养后中央细胞在胞质分裂前极核已完全分开 ,× 400; 11. 中央细胞分裂产生的子细胞的
DAPI荧光 (箭头示梨形子核 ,其余亮点为附着物的荧光 ) ,× 500; 12. 胚乳细胞胞质中 FPZ荧光 ,× 150; 13. 受精前卵器
三个细胞的细胞壁 ,× 540; 14. 尚未完成原位融合的卵器三个细胞 ,× 540; 15. 同图 14,示局部的 CW荧光 ,× 540; 16. 胚
乳细胞胞质中 CT C荧光 ,× 540; 17. 受精前卵器三个细胞胞质中 CTC荧光 ,× 750; 18. 受精前两助细胞的 FPZ荧光 ,×
400; 19. 受精后两助细胞的 CTC荧光差异 ,× 750; 20. 椭圆形合子 CTC荧光 ,× 990; 21. 梨形合子 CTC荧光 ,× 750;
22. 椭圆形合子 FPZ荧光 ,× 400; 23. 合子伸长后 FPZ荧光 ,× 750。
Explanation of plates
C. Cent ral cell　 DS. Degenerated s ynergid　 E. Egg cell　 EA. Fusion product of egg apparatus　 EN. End osperm cell
　 PN. Polar nucleus　 PS. Persi sten t syn ergid　 S. Synergid　 Z. Zygote
Plate I　 1. An isolated u nferti lized em bryo s ac, show ing it s cent ral cel l detach ed f rom th e embryo sac w al l,× 400; 2.
Th e same as in Fig. 1 s tained w ith calcof luor whi te( CW ) , show ing th e cel l w all of th e cent ral cell even af ter i t h ad turned
to spherical shape,× 400; 3. Th e cy toplasmic C TC fluores cence of cent ral cell,× 450; 4. Th e cytoplasmic FPZ f luores-
cence of th e cent ral cell and of th e in situ fu sion p rod uct of egg ap paratus p rotoplas ts ,× 400; 5. Th e cytoplasmic FPZ f lu-
orescence of an isolated cent ral cell ,× 400; 6. The tw o polar n uclei s eperated f rom each oth er along the cytoplasmic
st rand af ter in vitro cu lture,× 330; 7. FPZ f luorescence of the same em bryo sac as in Fig. 6,× 330; 8. Tw o daugh ter cel ls
divided f rom a cen tral cel l,× 500; 9. Th e same as in Fig. 8, sh owing the nuclei of tw o daugh ter cell s s tained by DAPI( ar-
rows ) ,× 500.
PlateⅡ　 10. FPZ f luo rescence of an isolated cent ral cell, s howing tw o polar nuclei completely seperated f rom each oth er
af ter in vitro cul ture,× 400; 11. A daugh ter cell divided fo rm cul tured cen t ral cel l. Ar row indicates a pear- formed nucle-
us s tained by DAPI,× 500; 12. Cytoplasmic FPZ f luorescence of i solated endosperm cells ,× 150; 13. Th e cell wall of the
egg apparatus cell s stained wi th CW ,× 540; 14. In situ fusion product of egg apparatus protoplas t s,× 540; 15. Th e same
350 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　 18卷
product as in Fig. 14 show ing th e partially s tained CW fluo rescence,× 540; 16. Th e cytoplasmic C TC f luo rescence of an
endosperm cel l,× 540; 17. C TC f luorescence in th e egg apparatus cel ls before ferti lization,× 750; 18. FPZ f luorescence in
th e tw o synergid s before fertili zation ,× 400; 19. The di fference of CTC f luores cence betw een two syn ergids af ter fer til-
i zation,× 750; 20. C TC fluores cence in an el lipt ical zygote,× 990; 21. C TC f lu orescence in the pear- sh aped zygote,×
750; 22. FPZ f luorescence in a zygote and tw o synergids,× 400; 23. FPZ f luorescence in an elongated zygote,× 750 .
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