全 文 ：第 21 卷　第 4 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2001 年　10 月
Vol.21　No.4　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2001
基于 SOD和 EST 同工酶的 19种苔藓植物种间关系排序分析
邵邻相　郭水良　陈吉娟
(浙江师范大学生命与环境科学学院 ,金华　321004)
摘　要　采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法 ,获得了金华北山苔藓植物 19个种之间酯酶(EST)、超
氧化物歧化酶(SOD)的同工酶酶谱。将 19 个种苔藓植物的酶谱进行量化后 ,采用主成分分析
(PCA)方法 ,比较了 19个种种间关系的差异特点。研究表明 ,苔藓植物具有很高的遗传多样性 ,
以同工酶酶谱资料为基础 ,应用主成分分析方法能够比较直观和有效地反映出苔藓植物分类群间
的系统关系。
关键词　苔藓植物;脂酶(ES T);超氧化物歧化酶(SOD);同工酶;主成分分析(PCA)
ORDINATION ANALYSES OF 19 SPECIES OF BRYOPHYTA
BASEDON SOD AND EST ISOZYMES
SHAO Lin-xiang 　GUO Shui-liang 　CHENG Ji-juan
(College of Life &Environmental Sciences , Zhejiang Normal University , Jinhua, 321004)
Abstract　By poly acyacrylamide get electrpho resis , two isozymes:Esterase(EST)and Superode dis-
mutase(SOD)of 15 species of M usci and 4 species of Hepaticae w ere studied.Zymog ramatic differ-
ences of two isozymes in 19 species were numerically revealed by Principal Component Analy sis
(PCA).The results show ed as follow :1)Bryophy tes are of high genetic diversity;2)Based on
isozyme data , PCA could be applied to reveal the systematic relationships among dif ferent bryophyte
species in genetic level.
Key words　Bryophy tes;Esterase(EST);Superode dismutase(SOD);Isozyme;Principal Compo-
nent Analy sis(PCA)
　　苔藓植物是一类重要的高等植物 ,它们在地质
勘探 、土壤调查 、植被演替 、监测大气 、园林绿化等方
面都有着很重要的作用 ,因此 ,苔藓植物的系统分类
正日益受到人们的重视 。相对于维管植物而言 ,苔
藓植物用于分类的性状相对较少 ,这需要探索其它
途径来直观有效地反映不同类群间的系统演化关
系。
植物体内具各种不同代谢功能的酶类是由遗传
决定的。同工酶就是控制这些酶的等位基因的变异
产物[ 1] 。Go tt lieb 自 70 年代开始把同工酶引入植
物的系统和进化研究中 ,并且认为同工酶分析为估
计分类群间的遗传距离提供了更为快速的途径 ,它
具有方便地分析分类群间的总体遗传学差异和相似
性的优点。国内 ,已有较多的关于同工酶资料用于
维管植物分类的报道 。但将同工酶分析用于以配子
体占优势的苔藓植物 ,国内这方面的工作还很少见
有报道;其次 ,国内在对同工酶资料的描述上 ,一般
应用聚类分析的方法 ,还没有见有应用象主成分分
析这类排序方法来反映不同种酶谱间差异的研究报
道;目前 ,国内植物多样性的研究绝大多数限于维管
植物 ,关于苔藓植物的遗传多样性程度的研究 ,还尚
未见有文献报道。
第一作者简介:邵邻相(1962-),男 ,副教授 ,主要从事植物细胞生物学研究。
收稿日期:2001-07-19
本项目工作的目的是:1)将同工酶分析引入到
国内苔藓植物系统分类学领域;2)探讨主成分分析
在比较酶谱差异上的效果;3)初步了解苔藓植物在
SOD及 EST 两种酶的多样性程度 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
共分析 19种苔藓植物 ,其中苔纲 4种 ,藓纲 15
种 ,试验材料(见表 1)全部材料均采自金华北山 ,标
本存查。由于单株苔藓植物的个体生物量难以满足
同工酶分析所需要的样品数量 ,因此取样以群体为
单位 。
1.2　样品制备
称取茎叶 1 ～ 3克 ,剪碎。脂酶(EST)同工酶分
析按 1:1的比例在 0.2mol/ l的磷酸缓冲液(pH7.0)
中研磨成匀浆。超氧化物歧化酶(SOD)同工酶分析
按1:3 的比例在磷酸缓冲液(pH7.0)中研磨成匀
浆。1 , 2000rpm ,离心 15 分钟 ,取上清夜与 40%蔗
糖按 1:1混合 ,滴加 2%溴酚蓝后置于青霉素瓶中 ,
立即进行点样及电泳 ,多余样品置于-20℃冰箱中
备用 。19个样品一次制样 。
1.3　电泳方法
采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶 ,
浓缩胶为 2.5%,分离胶为 7.5%。按常规方法制
备。EST 每个加样孔每次进样 60μl , SOD 加样
50μl。电极缓冲液为 Tris-甘氨酸(PH8.3)。稳
压 ,电泳置于 4℃冰箱中进行 ,起始电压 80 ～ 100V ,
电流 12 ～ 20mA ,电泳至分离胶时 ,电压调至 200V 。
电泳 3 ～ 4小时 。
1.4　染色
EST 、SOD同工酶染色法见参[ 2] 。胶板显色后
用蒸馏水冲洗 ,用 7%的乙酸固定 , 通过 GDS8000
实验室图像分析系统输出酶谱图。
1.5　酶谱分析
根据酶谱特征 ,采用二态性状编码 ,列出二态性
状矩阵 ,以此为基础 ,采用主成分析方法 ,将 19个种
间的谱带差异进行排序展示 ,以更清楚直观地分析
19个种在 SOD和 EST 同工酶上的差异。主成分分
析采用钟杨等所编的程序 [ 3]。
　　表 1 19种苔藓植物名录
Table 1 19 Species of Bryophyta Name
编号 No.纲 Class 类 Clan 亚类 Subclan 科名 Family 种名 Species 学　名 Scientific names
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
藓纲
Musci
藓纲
Musci
苔纲
Hepa ticae
金发藓类
真藓类
Bryidae
侧蒴亚类
P leurocarpi
顶蒴亚类
Acrocarpi
金发藓科
灰藓科
青藓科
柳叶藓科
羽藓叶
缩叶藓科
凤尾藓科
珠藓科
提灯藓科
牛毛藓科
地钱科
羽苔科
齿萼苔科
绿片苔科
东亚金发藓
灰藓
回叶毛灰藓
鳞叶藓
金灰藓
青藓
小青藓
细湿藓
羽藓
牛舌藓
金枝缩叶藓
二形凤尾藓
泽藓
提灯藓
角齿藓
地钱
羽苔
齿萼苔
片叶苔
Polytrichum commune Hedw
Hypnum cupressi forme L.ex Hedw , spw cMusc.
Homomallium incurvatum(Brid.)Loesk.
Taxiphyllum giradii(C.Mull.)Fleisch
Pyaisiella polyantha (Hedw .)Grout.
Brachythecium albirans(Hedw.)B.S.G
Brachythecium phynaeum Tak
Campy lium polygaum (B.S.G)C.Jens
Thuidium cymbifolium (Dozzzy &Molk.)Dozy &Molk
Anomodon minor(Hedw .)Fuernr
Ptychomitrium gardneri Lesq.
Fissidens gemini florus Doz.et Molk.
philonotis fontana (Hedw .)Brid.
Mnium marginatum (with.)P.Beauv.
Ceratodon purpurens(Hedw .)Bird
Machantia polymorpha L.
Plagiochila polymorpha L.
Lophocolea compacta Mitt.
Riccardia palmata (Hedw .)Carr.
5754 期　　　　　　　　　邵邻相等:基于 SOD 和 ES T 同工酶的 19 种苔藓植物种间关系排序分析
2　结果与分析
2.1　脂酶同工酶分析
作为生化分类最常用的工具酶 ,酯酶在物种分
类 、遗传上的应用已经十分广泛 ,相关报导也非常
多[ 4] 。由图 1a可见 ,供试材料的 EST 同工酶共显
示 40条 Rf值不同的酶带 ,从负极到正极分布于慢
(0.4Rf<0.81)三个区中 。在慢区中 , EST -1在藓类出
现的频率为 100%,在快区中 , EST36 ,37 ,38 , 39 , 40
在藓类中出现的频率相当高 ,分别为 73.3%、80%、
60%、86.7%、66.7%。故可认为这些酶带是藓纲的
特征性酶带。在 19个种中 ,同属于羽藓科的羽藓和
牛舌藓酶谱相似性很高 ,在总共 22 条酶带中有 18
条相同酶带;同属于灰藓科的灰藓 、凹叶毛灰藓 、鳞
叶藓 、金灰藓 ES T -1 , 24 , 36 , 37 , 39为相同酶带 。
同属于青藓科的青藓 、小青藓 EST1 , 3 , 13 , 20 , 30 ,
39 ,40为相同酶带 ,这些均说明应用同工酶资料能
够反映苔藓植物种间的分类关系。
本文研究中采用的是配子体材料 ,脂酶一般又
是单聚体酶 ,仅存在于细胞液中 ,因此图谱中每一条
带代表了一个等位基因 。图 1a中共有 40 条酶谱 ,
说明酶脂在藓类群中是高度多态性的。当然 ,在不
同的类群 ,这种多态性有差异 。在金发藓中 ,仅出现
4条谱带 ,而在羽藓科中出现 20余条带。
由 PCA 排序(图 1b)清楚可见 ,苔纲与藓纲有
明显界限。金发藓在藓纲中的位置也特殊 ,总体上
讲 ,真藓类中的侧蒴藓类与顶蒴藓类差异也明显 , 19
个种在排序图上的位置与它们的系统分类关系基本
一致 。
图 1a　金华北山产 19 种苔藓植物
脂酶同工酶图谱
Fig.1a ES T isozymes of 19 bry ophyles
from Jinhua Baishan
2.2　SOD同工酶酶谱分析
由图 2a可见 ,全部试验材料的 SOD同工酶共
检测出22条带 。在藓纲中 , SOD-14 , 17出现频率
图 1b　基于脂酶同工酶酶谱的 19 种苔藓
植物 PCA 排序
Fig.1b PCA ordinaction plot of 19 bryophy tes
based on their EST isozymes
较高 ,分别为 80%,73.3%,可认为是藓纲的特征性
酶带 。羽藓 、牛舌藓的 SOD-11 , 14 , 17 为相同酶
带 ,灰藓 、凹叶毛灰藓 、鳞叶藓的 SOD-11 , 14 为相
同酶带 ,这可能分别是羽藓科 、灰藓科的特征性酶
带。青藓科的青藓 、小青藓有相同的 SOD谱带 ,说
明SOD在青藓属种间差异不大。由 PCA 排序(图
2b)清楚可见 ,苔纲与藓纲有明显的分界线 ,苔纲的
四个种(16 , 17 , 18 , 19)聚在一起 。侧蒴藓类的九个
种(2 ～ 10)与顶蒴类(11 ～ 15)也有一定的界限 。从
图中还可以看出金发藓(1)在藓纲的位置也比较特
殊。2与 3 、6与 7在排序图上相距很近 ,这结果与
传统的分类结果是一致的 。
SOD 是二聚体或四聚体酶 , 19个种中仅出现
22条谱带 ,比脂酶的谱带少得多 ,说明在苔藓植物
中 ,SOD的多态性远小于脂酶。
576 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　21 卷
图 2a　金华北山产 19 种苔藓植物超氧化物
歧化酶同工酶图谱
Fig.2a SOD isozymes of 19 bry ophytes
from Jilshua Baishan
图 2b　基于超氧化物歧化酶同工酶酶谱
的 19 种苔藓植物 PCA排序
F ig.2b PCA o rdinarion plot of 19 bry ophytes
based on their SOD iso zymes
2.3　基于 EST 和 SOD两种同工酶的 PCA 排序
图 3a综合了 SOD 和 EST 二种同工酶的酶谱
数据 ,因此排序图更清楚地反映出 19个种间的分类
关系。在排序图 3a 中 ,苔纲(16-19)与藓纲(1-
15)界线明显 ,藓纲中金发藓(1)位置也特殊 ,也反映
出顶蒴藓类(11-15)与侧蒴藓类(1-10)的在酶谱
上的差异(除 8号材料外)。从图上还可看到 ,同一
科间的物种比不同科间的物种距离更近 。
3　讨论
同工酶分析是植物系统分类研究的重要工具 。
严格地讲 ,应该应用等位酶分析的角度来判断分析
分类群的系统演化关系[ 4] 。但是 ,由于苔藓植物个
图 3a　基于脂酶和超氧化物歧化酶酶谱的 19 种
苔藓植物 PCA 排序
F ig.3a PCA ordinain plo t of 19 bryophy tes
baseion their ES T and poiszymes
体小 ,特别是顶蒴藓类植物和一些小型的苔类植物 ,
难以以个体为分析单位 。本次研究中 ,以群体为取
样单位(均取配子体材料),因此 ,所得的结果反映了
种群水平上的同工酶差异 。其次 ,苔藓植物是以配
子体占优势的高等植物 ,这对于同工酶分析来讲 ,比
其它高等植物更容易对酶谱进行遗传学上的解释 ,
本文中SOD和 EST 酶谱上的差异在一定程度上反
映出种间分类学的关系。
目前 ,同工酶谱的差异比较上 ,一般应用聚类分
析方法 ,事实上 ,以同工酶资料为基础 ,通过主成分
分析 ,将图谱的差异直接应用二维 、三维图 ,能够更
直观地将种间关系反映出来。
一般认为 ,以配子体占优势的苔藓植物在进化
上是盲枝 ,但本文研究说明苔藓植物的遗传变异水
平非常高 。
参考文献
1.Stuessy TF.Plant taxonomy:The sy stema tic evaluation of
comparative data.New York Columbia university , 1990
2.何忠效 ,张树政.电泳.北京;科学出版社 , 1999
3.钟杨 ,陈家宽 , 黄德世.数量分类学的方法与程序.武
汉:武汉大学出版社 , 1991
4.王中仁.植物等位酶分析.北京:科学出版社 , 1996
5774 期　　　　　　　　　邵邻相等:基于 SOD 和 ES T 同工酶的 19 种苔藓植物种间关系排序分析