全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 17 卷　第 3 期 1997 年　7 月
Vol.17　No.3 July , 　1997
火炬松胚性悬浮细胞原生质体的分离和培养
唐　巍1　欧阳藩1　郭仲琛2
(1.中国科学院化工冶金研究所 ,北京　100080)　(2.中国科学院植物研究所 , 北京　100093)
摘　要　以火炬松(Pinus taeda L.)成熟合子胚的胚性悬浮细胞为材料分离原生质
体 ,研究了酶液组成 、渗透压稳定剂和悬浮细胞生长期对原生质体产量和原生质体
活力的影响 。结果表明:酶液组成为 Cellulase RS 1% + Cellulase R-10 2.5%+
Pectoly ase Y-23 0.2%、渗透压稳定剂为甘露醇 ,在悬浮细胞处于对数生长期时 ,原
生质体的产量和活力均最高。高活力的原生质体在 DCR培养基上培养 6d后完成
第 1次分裂 ,4周后形成胚性细胞团 , 8周后形成胚性胚柄细胞团(ESM :Embryonal
suspenso r mass), 16周后胚性顶端分化出子叶原基 。
关键词　火炬松;原生质体;胚性胚柄细胞团
ISOLATION AND CULTURE OF PROTOPLAST FROM
EMBRYONIC SUSPENSION CELL OF PINUS TAEDA LINN.
Tang Wei1　OuYang Fan1　Guo Zhong-chen2
(1.Institute of Chemical Me tallurgy , Academia Sinica , Beijing , 100080)
(2.Institute of Bo tany , Academia Sinica , Beijing , 100093)
Abstract　The influences of enzyme combination , osmoticum , and suspension cell
grow th phase on bo th protoplast yield and pro toplast viability w ere investigated with
embryonal suspension cell f rom mature zygo tic as materials of isolation protoplast.The
results show that protoplast yield and protoplast viability of suspension cells on linear
phase are the highest under the enzyme combination cellulase RS 1%+cellulase R-10
2.5%+pectolyase Y-23 0.2% and osmoticum mannital.After protoplast were cul-
tured on DCR medium , the f irst division of protoplast appeared on 6th day , embryonic
cell mass appeared on 4th week , embryonal suspensor mass appeared on 8th week , and
somatic embryo wi th primary coty ledonary appeared on 16th week.
国家“ 863”资助课题
　1997年 1月收稿。
Key words　Pinus taeda L.;Protoplast;Embryonal suspenso r mass
火炬松(Pinus taeda L.)属松科松属植物 ,原产北美东南部 ,是一种重要和很有发展前
途的绿化和造林树种 。火炬松的适应性较强 ,生长较迅速。80 年代以来 ,我国广大亚热带
和部分热带地区大面积引种火炬松 ,目前 ,火炬松已成为我国南方植树造林的主要树种〔1〕 。
火炬松原生质体分离和培养的研究在我国尚未见报道 。在国外 , Teasdale 等〔2〕于 1983年首
次对火炬松胚轴的悬浮细胞原生质体进行了分离和培养 ,获得了由数个细胞组成的细胞团。
1987年 Gupta等〔3〕以火炬松未成熟合子胚的胚性悬浮细胞为材料分离原生质体 ,经培养获
得了早期的胚性胚柄细胞团。我们在火炬松成熟合子胚培养形态发生系统研究的基础上 ,
从胚性悬浮细胞的原生质体培养中获得了有子叶原基分化的体细胞胚 ,和前人的工作相比 ,
取得了较大的进展 ,其研究结果如下:
1.材料和方法
1.1　胚性细胞悬浮系的建立
将火炬松成熟合子胚的白色 、半透明 、有光泽的粘性愈伤组织接种于装有 40ml无菌培
养液的100ml三角瓶中 ,接种量为 12.5g·L-1 ～ 25g·L -1。在培养的早期每天用 120目的不
锈钢筛将培养物过滤 1次 ,经 5 ～ 7次过滤后即形成了分散性良好的胚性细胞悬浮培养物。
然后将胚性悬浮细胞于黑暗中培养 ,并每两周继代 1次 。液体培养基的组成为 DCR+2mg·
L-12 , 4-D+1mg·L-1BA+400mg·L-1CH+400mgL-1谷氨酰胺+3%蔗糖。pH 为 5.8。
1.2　原生质体的分离
以火炬松的胚性胞胞悬浮培养物为材料 ,参照 Tautorus等〔4〕的方法分离原生质体。酶
液组成为:A　Cellulase RS 1%+Cellulase R-10 2.5%+Pectolyase Y-23 0.2%, B　Cel-
lulase RS 2%+Cellulase R-10 1%+Pectolyase Y-23 0.5%, C　Hemicellulase 2% +Cel-
lulase R-10 2%+Pectolyase Y-23 0.2%。酶制剂溶解于 CPW 13 溶液中制成酶混合液。
在 21±1℃下酶解 4 ～ 6h 后收集原生质体 。原生质体纯化采用漂浮法 ,上层液为 6%的 Fi-
coll溶液 ,下层液为 9%的 Ficoll溶液 ,在 150g 下离心 5min 后 ,原生质体浮于顶层 。参照
Attree等〔5〕的方法测定原生质体密度 。参照 David等〔6〕的方法测定原生质体的产量。参照
Laine等〔7〕的报道 ,用酚藏花红和伊文斯蓝染色法测定原生质体活力 。
1.3　原生质体培养
参照 Attree等〔8〕的研究报道 ,用液体浅层和固体平板培养法培养原生质体 。原生质体
的培养密度为 7×104 个/ml。培养基为 DCR+1mg·L -12 ,4-D+0.1mg·L-1 IBA+0.5mg
·L-1BA+500mg·L-1CH +500mg·L-1谷氨酰胺+500mg·L-1火炬松种子胚乳粉 ,固体培
养基中添加 0.6%的琼脂。原生质体在黑暗中培养 8周后 ,转移到成分相同但添加 9000mg
·L-1肌醇的 DCR分化培养基上 。并对原生质体培养过程中的形态发生过程用 Opton Ⅰ型
显微镜观察并照相。培养温度为 21±2℃,并对实验结果进行统计分析 。
2.实验结果
2.1　原生质体的分离
2.1.1　酶液组成的影响
3213 期　　　　　　　　　　唐　巍等:火炬松胚性悬浮细胞原生质体的分离和培养
在火炬松胚性细胞悬浮培养的基础上 ,以纤维素酶 Cellulase “Onozuka” RS 、Cellulase
“Onozuka” R-10 , 果胶酶 Pectolyase Y-23 及半纤维素酶 Hemicellulase 组成 3种酶液(A 、
B和 C)分离胚性悬浮细胞的原生质体 。结果表明(表 1):用 A酶液分离的胚性悬浮细胞的
原生质体产量和原生质体活力均最高 ,分别为 7.9×104 个/mg(鲜重)和 63.7%。
表 1 酶液组成对原生质体产率及活力的影响
Table 1　Influences of enzyme combination on protoplast yield and protoplast viability
酶液组成(%w/v)
Enzyme combination
细胞重量(mg)
Weight of cell
原生质体产量
(×104/mg)
P ro toplast yield
原生质体活力(%)
Protoplast viability
A　RS 1%+R10 2.5%+Y23 0.2%
B　RS 2%+R10 1.0%+Y23 0.5%
C　R10 2%+Y23 0.2%+Hemicellulase 2%
50
50
50
7.9±2.03
5.3±1.12
5.1±2.28
63.7±3.15
51.8±2.09
49.2±5.13
2.1.2　渗透压稳定剂的影响
以甘露醇 、山梨醇 、葡萄糖和蔗糖为渗透压稳定剂 ,用 A 酶液分离胚性悬浮细胞的原生
质体 。结果表明(表 2):以 13%的甘露醇作为渗透压稳定剂时 ,原生质体的产量和原生质体
的活力均最高 ,分别为 8.2×104 个/mg(鲜重)和 63.3%。
表 2 渗透压稳定剂对原生质体分离的影响
Table 2 Influences of osmoticum on protoplast isolation
渗透压稳定剂
Osmoticum
细胞重量(mg)
Weight of cell
原生质体产量(×104/ mg)
Protoplast y ield
原生质体活力(%)
P rotoplast viability
甘露醇 Mannitol
山梨醇 Sorbito l
葡萄糖 Glucose
蔗　糖 Sucrose
50
50
50
50
8.2±1.17
3.8±1.09
2.3±0.98
2.9±1.23
63.3±1.19
59.1±2.73
57.4±2.26
51.2±3.85
表 3 悬浮细胞生长期对原生质体产率和活力的影响
Table 3　Influences of the growth phase of suspension cell on protoplast yield and proto-
plast viability
悬浮细胞生长期
Suspension cell grow th phase
细胞重量(mg)
Weight of cell
原生质体产量(×104/ mg)
Protoplast y ield
原生质体活力(%)
Pro toplast viability
延迟期 lag phase
指数生长期 Exponential phase
对数生长期 Linear phase
减慢期 Deccelerative phase
静止期 Stationary phase
50
50
50
50
50
6.2±1.72
8.1±2.08
12.6±1.34
6.7±2.06
5.1±1.27
48±1.08
59±2.13
69±3.19
52±1.05
48±1.16
322 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
2.1.3　悬浮细胞生长期的影响
取火炬松胚性细胞悬浮系中不同生长时期的悬浮细胞 ,用 A酶液分离原生质体。结果
表明(表 3):对数生长期胚性悬浮细胞的原生质体产量和原生质体活力均最高 ,分别是 12.6
×104 个/mg(鲜重)和 69%。
2.2　原生质体培养
图 1　原生质体再生细胞的第 1 次分裂;图 2　胚性细胞团
图 3　胚性胚柄细胞团;图 4　有子叶原基分化的体细胞胚。
F ig.1　First division of pro toplast;Fig.2　Embryonic cell mass;
Fig.3　Embryonal suspensor mass;F ig.4　Somatic embryo with primary coty ledons.
用酶混合液分离获得的悬浮细胞原生质体 ,经纯化后 ,用附加 1mg·L-12 ,4-D 、0.1mg
·L-1 IBA 、0.5mg·L-1BA 、500mg·L-1CH 、500mg·L-1谷氨酰胺和 500mg·L-1火炬松种子胚
乳粉的 DCR原生质体培养基将原生质体密度调整为 7×104 个/ml ,并在黑暗中进行培养。
在培养早期 ,每隔 4h 观察 1次 ,结果表明:在 48 ～ 72h 内大部分原生质体完成细胞壁的再
生;在培养的第 6天 ,原生质体的再生细胞完成第 1次分裂(图 1);在培养的第 8天完成第 2
次分裂;培养 4周后 ,形成了胚性胚细胞团(图 2);培养 8周后 ,形成了胚性胚柄细胞团(图
3)。形成胚性胚柄细胞团后 ,将培养物转移到组成成分相同但添加 9000mg·L-1肌醇的体
细胞胚分化培养基上继续培养 ,在分化培养期间 ,胚性胚柄细胞团的头部明显增大 ,至第 8
周时 ,胚性顶端分化产生了子叶原基(图 4)。具有子叶原基的体细胞胚在分化培养基上继
续培养时 ,生长极为缓慢 。由这种体细胞胚到再生植株的培养过程仍需进一步研究 。
3233 期　　　　　　　　　　唐　巍等:火炬松胚性悬浮细胞原生质体的分离和培养
3.讨　　论
与组织培养和细胞培养相比 ,松柏类植物的原生质体培养难度更大 。目前仅在欧洲落
叶松和白皮云杉两种植物的原生质体培养中获得了再生植物株〔9〕 。在松属植物中 ,仅在加
勒比松的原生质体培养中获得了早期原胚。松属植物原生质体培养研究进展缓慢的原因 ,
主要是没有建立起良好的体细胞胚胎发生体系和器官发生体系 。我们在建立火炬松成熟合
子胚培养体细胞胚胎发生体系及优化悬浮培养体细胞胚胎发生条件的基础上 ,进行了胚性
悬浮细胞原生质体的分离和培养 ,确定了分离火炬松胚性悬浮细胞原生质体的最佳酶液组
成 、渗透压稳定剂及悬浮细胞生长期。火炬松胚性悬浮细胞原生质体分离之所以需要高活
性的纤维素酶和果胶酶 ,可能与其细胞壁的组成有关 ,其细胞壁中除了含有纤维素 、半纤维
素 、果胶质和少量蛋白质外 ,还含有一定量的木质素等次生物质 。对数生长期的悬浮细胞原
生质体产量和活力较高的原因可能是 ,该时期的细胞分裂旺盛 ,用于分离原生质体时大量子
细胞的细胞壁尚未完全形成且果胶质和其它的次生物质积累较少。
分离获得的高活性原生质体在培养过程中经胚性细胞团 、胚性胚柄细胞团等阶段形成
了有子叶原基分化的体细胞胚 。但由这种体细胞胚到再生植株的转化尚未实现 ,其原因可
能是:1.培养基组成已不再适合于这种胚的进一步发育。2.胚的质量较低 ,其胚性头部比
合子胚小 ,对培养环境的适应性差。3.单位体积内胚的数量少 ,没有达到体细胞胚向再生
植株转化所需的最低值。因此 ,在以后的研究中 ,在改进培养基和提高胚的质量及单位体积
内的数量等方面仍需作进一步的探索。
参　　考　　文　　献
1.潘志刚.火炬松 8年种源试验研究.林业科学研究 , 1989 , 2(6):540-545
2.Teasdale , R.D., Rugini , E., High yield preparation of viable protoplast f rom suspension cultured loblolly pine and subse-
quent regeneration to callus.Plant Cell Tiss.Org.Cult., 1983 , 2:253-261
3.Gupta , P.K., Du rzan , D.J., Somatic embryos from protoplast of loblolly pine proembryonal cells.Boi/ Technology ,
1987 , 5:710-712
4.Tautorus T.E., Att ree , S.E., Somatic emb ryogensi s f rom immatu re and mature zygotic embryos and embryos regenera-
tion from protoplast in black spruce.Plant S ci., 1990 , 67:116-124
5.Att ree , S.M., Bekkaoui , F., Regenerat ion of protplast from an embryogenic suspension culture of w hite spruce.Plant Cell
Rep., 1987 , 6:480-483
6.David , A., Laignea , C., Grow th and soluble protein of cell cultures derived f rom explant and protoplast of Pin us pinaster
cotyledons.Tree physiol., 1989 , 5:497-506.
7.Lanine , E., David , A., Somatic embryogenesis in immature emb ryos and protoplast of pinus caribaea.Plant Sci., 1990 ,
69:215-224
8.Att ress , S.M., Fow ke , L.C., Embryogeny of gymnosperms.Plant cell Tiss.Org.Cult., 1993 , 35:1-35.
9.Tautorus , T.E.Fow ke , L.C., Somatic emb ryogenesis in conifer.Can.J.Bot., 1991 , 69:1873-1899
324 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　17 卷