全 文 ：第24 卷　第 4期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　10月
Vol.24　No.4　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2004
基金项目:黑龙江省教育厅一般项目(项目编号:10531071)资助;黑龙江省自然基金攻关课题(项目编号:23010339052239)资助
第一作者简介:徐淑红(1971—),女 ,博士 ,主要从事生物工程研究工作。
＊　通讯作者 Author for correspondence
收稿日期:2004-01-07
植物遗传转化中抑菌剂的选择
徐淑红　徐香玲＊
(哈尔滨师范大学生物系 , 哈尔滨　150080)
摘　要　农杆菌介导法进行植物遗传转化 ,在农杆菌和外植体共培养后 ,为使转化的外植体正常生
长 ,必须选择适宜的抑菌剂进行除菌。本文通过抑菌圈试验和稀释法试验测试了发根农杆菌
pRi15834、pRiA4b 、pRi1724 、pRiA13 对三种头孢霉素的敏感性 ,其中头孢曲松钠的抑菌效果最好 ,最适
宜浓度为100 ～ 300 mg/L。
关键词　发根农杆菌;抑菌剂;转化
Bacteriostatic agent selection in plant genetic transformation
XU Shu-Hong　XU Xiang-Ling＊
(Biology Department of Harbin Normal University , Harbin , 　150080)
Abstract　As plant genetic transformation is being carried on by Agrobacterium-mediated , a proper bacterio-
static agent must be selected to eliminate bacteria in order to make transformed explant grow in normal way after
co-culturing Agrobacterium and explant.We have studied sensitivities of Agrobacterium rhizogene pRi15834 、
pRiA4b 、pRi1724、pRiA13 to three kinds of cephalosporin by bioactivity and dilution tests.Ceftriaxone sodium
has the best bactericidal effect of them , the proper concentration is 100 ～ 300 mg/L.
Key words　Agrobacterium rhizogene;bacteriostatic agent;transformation
土壤农杆菌是一种革兰氏阴性菌 ,分为发根农
杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和根癌农杆菌(A-
grobacterium rhizogenes),由于它们具有感染植物体
的生物学特性 ,人们对其进行改造 ,成为植物基因
工程中把外源基因导入到植物的天然工程载
体[ 1 ,2] 。在遗传转化实验中 , 农杆菌感染植物体
后 ,其 T-DNA 发生转移 ,并整和到植物的基因组
中 ,但外植体的表面及浅层组织中的农杆菌过度生
长会阻碍外植体的生长发育。因此 ,遗传转化中一
个很重要的环节就是抑制农杆菌的增殖 。为此 ,常
在培养基中添加对植物无毒害的抑菌剂来实现这
个目的。常用的抑菌剂有羧苄青霉素(Carbeni-
cilin ,Carb)和头孢霉素(Cefotaxine , Cef)等 ,这些抑
菌剂不仅对农杆菌的生长有抑制作用 ,对植物细胞
也有一定的生物效应。因而 ,根据不同植物及不同
外植体应选用不同种类 、不同浓度的抑菌剂 ,在进
行植物遗传转化中确定抑菌剂的种类及其适宜的
浓度具有重要意义。我们对多种植物进行多年遗
传转化的研究 ,认为发根农杆菌介导植物的遗传转
化具有易于获得再生植株的独特优点。所以本文
重点以四种发根农杆菌 pRi15834 、pRiA4b 、pRi1724 、
pRiA13为材料 ,测试三种头孢类抑菌剂的效果 ,以
筛选最佳抑菌剂及确定最适抑菌浓度 。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料
小麦品种:东农 7742 ,由东北农业大学农学系
小麦生理生物技术室提供 。
1.1.2　菌种
发根农杆菌 pRi15834 、pRiA4b 、pRi1724 、pRiA13
由日本筑波大学遗传研究中心镰田博先生惠赠 。
1.1.3　培养基
YEB培养基:(牛肉膏 5 g/L ,酵母粉 1 g/L ,蔗
糖 5 g/L , 蛋白胨 5 g/L , 硫酸镁 494.94 mg/L ,
pH7.2)
1.1.4　抑菌剂
头孢曲松钠(上海先锋药业生产);头孢噻肟钠
和头孢唑林钠(哈尔滨制药总厂生产)
1.2　方法
1.2.1　抑菌圈试验测定抑菌剂的敏感性
从发根农杆菌 pRi15834 、pRiA4b 、pRi1724 、pRi-
A13固体平板上分别挑取一个菌落 ,分别接种于
YEB液体培养基中 。28℃, 200 r/min振荡培养过
夜 ,待长到对数生长期时 ,涂布在 YEB 固体平板
上[ 7] 。
配制头孢曲松钠 、头孢噻肟钠和头孢唑林钠三
种不同抑菌剂 , 浓度分别为 0 、300 、500 、1 000 、
3 000 、5 000 mg/L。在灭菌的圆形滤纸片(直径为
1.5 cm)上分别滴加30 μL上述不同浓度的抑菌剂 ,
晾干后 ,将圆形滤纸片按抑菌剂的种类摆在已准备
好的 3个 YEB 固体平板上 ,28℃恒温培养 ,观察抑
菌圈的大小。
1.2.2　稀释法测定抑菌剂敏感性
将活化四种农杆菌接种于含有三种不同抑菌
剂 ,浓度分别为0(ck)、100 、300 、500 、700 mg/L的
20mL YEB 液体培养基中 , 接种后 OD600 =0.008 ,
200 r/min ,28℃振荡培养 ,分别培养12 、24 、36 、48 h
时测定菌液OD600值 ,记录数据取三次重复的平均
值。确定能完全抑制农杆菌生长的抑菌剂最适宜
浓度 。
1.2.3　小麦愈伤组织的获得
取适量东农 7742小麦的成熟种子 ,70%酒精
消毒1 min ,无菌水洗3次 ,0.1%HgCl2消毒15 min ,
无菌水洗 5 ～ 6次 ,26℃±1℃浸种 30 ～ 40 h[ 3] 。剥
出成熟胚接种于愈伤组织诱导培养基上 , 26℃±
1℃暗培养 3 ～ 4周 ,成熟胚形成愈伤组织后 ,用发
根农杆菌进行转化 。
1.2.2　抑菌剂对小麦愈伤组织继代及分化[ 4～ 6]的
影响
将愈伤组织分别接种于含有头孢曲松钠 0 、
100 、300 、500 、700 mg/L的愈伤组织诱导培养基上 ,
每皿接种 50个愈伤组织 ,每个处理 2皿 ,每 2周继
代一次 ,4 ～ 6周后将愈伤组织转至分化培养基上
(头孢曲松钠的浓度同上)。观察不同浓度头孢曲
松钠对愈伤组织生长及分化的影响。
2　结果与分析
2.1　抑菌圈实验测定抑菌剂的敏感性
发根农杆菌28℃恒温培养12 h后观察 ,结果见
图1。图中所示含有头孢唑林钠的滤纸片不论多
大浓度其周围都不出现抑菌圈 ,证明头孢唑林钠抑
菌效果是最差的一种抑菌剂 。在抑菌剂的浓度为
0 、300 、500 mg/L时头孢噻肟钠和头孢曲松钠的滤
纸片周围也没有出现抑菌圈 ,而在高浓度(1 000 、
3 000 、5 000 mg/L)的滤纸片周围都出现了一些大
小不等的抑菌圈 ,其直径随浓度的升高而加大。在
相同的浓度下 ,比较头孢曲松钠和头孢噻肟钠的抑
菌圈 ,头孢曲松钠的略大 。
2.2　稀释法测定抑菌剂的敏感性
抑菌圈的实验只能初步证明这三种抑菌剂的
图 1　抑菌剂浓度为 1 000 mg/ L时抑菌圈实验
Fig.1　Test of bioactivity when concentration of bateriostatic agent is 1 000 mg/ L
492 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24卷
表 1　抑菌剂及其浓度对农杆菌 pRi1724 、pRi15834、pRiA4b 、pRiA13 的影响
Table 1　Bacteriostatic Agent and its concentration on pRi1724、pRi15834、pRiA4b、pRiA13
农
杆
菌
类型
抑
菌
剂
种类
浓度 Concentration(mg/ L)
100 300 500 700 100 300 500 700 100 300 500 700 100 300 500 700
培养 12 h的OD值 培养 24 h的OD值 培养 36 h的OD值 培养 48 h的 OD值
pRi1724
Ck 0.503 2.007 2.267 2.280
Q 0.022 0.016 0.009 0.007 0.126 0.034 0.033 0.030 0.145 0.019 0.013 0.012 1.445 0.020 0.011 0.009
S 0.038 0.009 0.008 0.006 0.834 0.043 0.029 0.028 1.662 0.035 0.028 0.017 2.081 0.066 0.017 0.014
Z 0.029 0.003 0.002 0.002 1.781 0.218 0.063 0.033 2.284 1.954 0.963 0.097 2.376 2.290 2.159 1.666
pRi15834
Ck 0.907 2.114 2.151 2.161
Q 0.028 0.026 0.023 0.022 0.136 0.092 0.078 0.062 0.379 0.219 0.203 0.199 0.989 0.886 0.867 0.602
S 0.032 0.029 0.028 0.023 0.138 0.097 0.081 0.072 0.895 0.765 0.721 0.717 1.968 1.032 0.961 7 0.014
Z 0.038 0.034 0.034 0.026 0.154 0.118 0.103 0.133 0.913 0.904 0.901 0.907 1.676 1.190 1.119 1.011
pRiA4b
Ck 0.487 1.095 1.846 2.093
Q 0.043 0.007 0.008 0.008 0.745 0.007 0.009 0.008 1.086 0.009 0.008 0.007 1.328 0.011 0.009 0.008
S 0.056 0.017 0.013 0.008 1.041 0.043 0.039 0.028 1.662 0.065 0.047 0.036 2.132 0.092 0.063 0.054
Z 1.029 0.973 0.897 0.810 1.881 1.218 1.036 1.013 2.184 1.954 1.779 1.491 2.376 2.290 2.159 1.936
pRiA13
Ck 0.665 1.917 2.070 2.114
Q 0.011 0.029 0.019 0.007 0.806 0.761 0.687 0.651 0.951 0.882 0.795 0.742 1.515 0.956 0.903 0.857
S 0.021 0.028 0.022 0.010 0.921 0.903 0.874 0.796 1.862 1.535 1.228 1.002 2.171 2.002 2.005 1.994
Z 0.029 0.023 0.030 0.016 1.035 1.002 0.986 0.952 1.986 1.864 1.853 1.483 2.298 2.285 2.154 1.785
　注:Ck 代表未加抑菌剂;Q 代表头孢曲松钠;Z 代表头孢唑林钠;S 代表头孢噻肟钠
抑菌效果 ,为了进一步说明抑菌剂的效果 ,又进一
步做了“稀释法测定抑菌剂的敏感性”实验。
由表 1可以看出 ,无论多大浓度的头孢唑林钠
对四种农杆菌的生长都没有抑制作用 ,说明头孢唑
林钠对四种农杆菌是无效抑菌剂 。头孢曲松钠和
头孢噻肟钠在 12 h内抑菌效果相差不明显 ,在24 h
以后头孢曲松钠的效果渐渐优于头孢噻肟钠 ,到
48 h头孢曲松钠的效果明显优于头孢噻肟钠。
100 mg/L的浓度下抑菌效果不明显 ,当头孢曲松钠
的浓度达到300 mg/L时 ,即可完全抑制农杆菌的生
长 ,而头孢噻肟钠在1 000 mg/L时仅能达到头孢曲
松钠300 mg/L时的抑菌效果 ,说明三种抑菌剂中的
头孢曲松钠抑菌效果最好 , 最适抑菌浓度为
300 mg/L。
2.3　头孢曲松钠对小麦愈伤组织继代和分化的影
响
本文观察了头孢曲松钠对小麦愈伤组织生长
和诱导分化的影响。研究结果表明 ,头孢曲松钠浓
度为100 mg/L时 ,愈伤组织的生长及芽分化与对照
无明显差异 ,不影响其生长 ,可以认为此浓度为安
全浓度 。当头孢曲松钠浓度达到300 mg/L时 ,愈伤
组织的颜色稍变黄 ,且随头孢曲松钠浓度的升高其
分化率也显著降低(图 2)。而且 ,在实验中还观察
到 ,愈伤组织的生长也随头孢曲松钠浓度的升高而
减慢。在植物转化中使用的抑菌剂:头孢曲松钠的
适宜浓度在100 ～ 300 mg/L之间 ,即可起到抑菌的
表 2　头孢曲松钠对小麦愈伤组织继代和分化的影响
Table 2　Effects of Cef on growth and differentiation of wheat callus
头孢曲松钠
Cef(mg/ L)
接种愈伤数
Number of callus Inoculated
愈伤组织颜色c
Color of callus
愈伤分化 Callus differentiation
数目(Number)a 频率(%)
0 100 正常 64 64.0 ab
100 100 正常 66 66.0 a
300 100 稍发黄 57 57.0 b
500 100 黄色 49 49.0 c
700 100 黄色 21 21.0 d
注:a数值表示三次重复的平均数;b字母表示在α=0.05水平上差异显著;c 表示继代 4周后愈伤组织的颜色;d分化培养基为
东农 7742的最适培养基
4934期　　　　　　　　　　　　徐淑红等:植物遗传转化中抑菌剂的选择
图 2　不同浓度的头孢曲松钠对愈伤组织诱导分化的影响
Fig.2　Effects of different concentrations of cef on callus differentiation
作用 ,又不影响愈伤组织的生长。
3　讨论
植物的遗传转化中常选择羧苄青霉素(Car-
benicilin Carb)作为抑菌剂 ,但近年来 ,随着羧苄青
霉素停止生产 ,抑菌剂已被多种头孢霉素所代替 。
而本试验的结果表明其中头孢曲松钠可抑制发根
农杆菌生长 ,适宜浓度为 100 ～ 300 mg/L。当抑菌
剂的浓度增加时到700 mg/L时 ,抑菌效果更好 ,但
高浓度的抑菌剂同时会抑制愈伤组织的分化及植
物的生长。因此 ,只有选择适当种类的抑菌剂 ,定
量确定其浓度才能起到既抑制农杆菌的生长又不
影响植物的正常生长 。
在利用抑菌圈试验测定抑菌剂的敏感性时 ,应
注意含有抑菌剂灭菌后的滤纸片要完全晾干再摆
放到固体平板上 ,以避免滤纸片上的药品渗透进培
养基 ,造成抑菌剂抑菌效果出现错误 ,严重影响实
验结果与分析。
农杆菌生长中培养基的最适 pH值为 7 ,而植
物遗传转化外植体生长所用培养基的 pH 值为
5.8 ,当把农杆菌涂布于 pH5.8的 MS 培养基上培
养后发现 ,低 pH 值具有一定抑菌作用 ,但不能完
全抑制农杆菌的生长 。因此 ,农杆菌介导植物的遗
传转化中 ,必须使用相应的抑菌剂来抑制农杆菌的
生长 。
本文研究了三种抑菌剂对四种发根农杆菌的
抑菌效果 ,但这三种抑菌剂对根癌农杆菌是否具有
抑菌作用还应测试 ,发根农杆菌和根癌农杆菌的抑
菌剂是否相同尚待研究 。
综上 ,农杆菌介导的植物遗传转化 ,选择适宜
的抑菌剂和确定适宜的抑菌剂浓度是植物遗传转
化成功的关键问题 。
参　考　文　献
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