全 文 ：BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 16 卷　第 1 期 1996 年　1 月
Vol.16　No.1 Jan., 　1996
烟草花粉原生质体与叶肉原
生质体的融合及培养早期变化①
卢　萍　周　嫦　杨弘远
FUSION BETWEEN POLLEN PROTOPLASTS AND
MESOPHYLL PROTOPLASTSOF NICOTIANA
AND EARLY CHANGES OF CULTURE
Lu Ping　Zhou Chang　Yang Hong-yuan
〔摘　要〕　用 PEG —高 Ca 高 PH 法诱导抗卡那霉素的烟草(Nicotiana
tabacum)品系 N364+Km+花粉原生质体和黄花烟草(Nicot ia rust ica)叶肉原生质
体融合。幼嫩花粉原生质体和叶肉原生质体之间的融合体培养启动胚胎发生分
裂 ,经卡那霉素筛选后 ,少数多细胞团存活并形成小愈伤组织。成熟花粉原生质体
与叶肉原生质体之间的融合体则仅产生管状结构。这一结果表明 ,作为融合一方
的花粉原生质体的发育时期对融合产物的发育途径有重要影响 。
关键词　花粉原生质体;原生质体融合;原生质体培养;烟草;黄花烟草
二十多年来 ,花粉原生质体的研究一直受到广泛的重视 。Tanaka 等(1987)〔10〕和周嫦
(1988)〔1〕用酶法从花粉粒中分离出大量生活的原生质体 ,促进了花粉粒原生质体的研究 。
Ueda等(1990)〔11〕首次尝试麝香百合近成熟花粉原生质体之间及其与分离的生殖细胞
原生质体间的融合和培养;两个花粉原生质体融合后 ,经短期培养 ,其中来自双方的 2个生
殖细胞分别分裂 ,产生 2对精细胞;花粉原生质体与生殖细胞原生质体的融合体培养后 ,前
者的生殖细胞分裂为精细胞 ,而后者的生殖核则不分裂。莫永胜与杨弘远(1992)〔3〕也进行
了黄花菜小孢子原生质体与同种精细胞之间 、萱草小孢子原生质体与朱顶红精细胞之间的
融合 ,获得了异核体 ,但未作融合体的培养实验 。最近 ,李昌功等(1994)〔4〕将青菜幼嫩花粉
原生质与甘蓝型油菜下胚轴原生质体融合 ,经培养再生了种间杂种小植株 ,首次由游离时期
的花粉原生质体进行“配子—体细胞杂交”成功。为了探索这一方法在其它植物材料中的可
行性 ,我们在烟草属中开展了花粉粒原生质体与体细胞原生质体的种间融合实验 ,并观察了
① 本文作者单位:湖北 ,武汉 ,武汉大学(Wuhan University , Wuhan , 430072 Hubei)。＊国家自然科学基金资助的课题。承中国科学院微生物研究所方荣祥先生馈赠抗卡霉素烟草品系 ,谨致谢忱。
1995年 6月收到本文。
融合后培养早期的细胞学变化 。
材料与方法
一 、供试材料为烟草(Nicot iana tabacum)抗卡那霉素品系 N364 K+m 和黄花烟草(Nico-
riana rustica)
二 、幼嫩花粉原生质体的分离
用夏惠君等的花粉饥饿处理法分离幼嫩花粉原生质体(待发表):取含二核早 、中期花粉
的花药 ,在含 0.3mol/l甘露醇的 Kyo 与Harada培养基〔5〕中轻压出花粉 ,以 1×105 密度 ,在
25℃黑暗条件下进行饥饿处理 2 —3 天 ,然后将花粉置于含 Cellulase R—10 、Pectinase 与
Pectoly ase Y—23与渗透压调节剂的酶液中酶解 2—3 小时 ,尼龙筛网过滤除去花粉外壁残
渣 ,离心收集花粉原生质体。
三 、成熟花粉原生质体的分离
按汪泳与周嫦(1994)〔5〕的方法分离成熟花粉原生质体 ,用过滤离心法收集花粉原生质
体。
四 、叶肉原生质体的分离
取苗龄 2—3月的大田苗叶片 ,按常规方法用 Cellulase R—10与 Pectinase 分离原生质
体。
五 、融合
将 Nicot iana tabacum 品系 N364 K+m 的花粉原生质体(1×106)和 Nicot iana rustica 的
叶肉原生质体(1 ×106)等量混合 , 滴 3—4 滴于小培养皿中 ,随即加入 2 滴 20%PEG
(polyethylene g lycol , MW6000)溶液(附加 0.3mol/l葡萄糖 , 3.5m mol/ l CaCl2·2H2O , 0.
7m mol/ l KH2 PO4), 静置 5分钟 ,每隔 5分钟依次加入 0.5ml , 1ml , 1ml的高 Ca高 pH 溶
液(50m mol/ l CaCl2·2H2O , 50m mol/ l甘氨酸钠 , pH10.5),最后加入 2ml含 13%甘露醇的
CPW 洗液 ,静置 1小时 ,用微吸管吸取上清液 ,再用 KM8P 培养基〔7〕(附加有 0.5mol/ l甘露
醇 、0.1mol/ l葡萄糖 、2%蔗糖 、0.4mg/ l6—BA 、0.4mg/ l2 , 4—D ,0.6mg/ l NAA ,pH5 、8)洗 2
次。
六 、培养与筛选
融合后的原生质体 ,以 1×105的密度于上述培养基中进行液体浅层培养。培养条件为
25℃、黑暗 。2周后 ,加入渗透压降低的新鲜培养基。筛选处理则在该培养基中加入 50μg/
ml的卡那霉素(kanamycin)。
七 、细胞学观察
用 FPA固定培养物 ,用 50μg/ml的DAPI 染色观察细胞核 ,用 0.2%的荧光增白剂染色
鉴定细胞壁。显微摄影在 Olympus IM T—2倒置显微镜下进行 。
结　　果
一 、幼嫩花粉原生质体与叶肉原生质体的融合与培养
幼嫩花粉原生质体和叶肉原生质体大小相近 ,但后者含叶绿体而与前者明显区别(图版
Ⅰ ,1 ,2)。融合体培养 2—3天开始由圆形变为椭圆形 , 5—6天后发生第一次细胞分裂 ,产
生二个等大的子细胞(图版Ⅰ ,3)随后发生第二次分裂及多次细胞分裂形成多细胞团(图版
971 期　　　　卢萍等:烟草花粉原生质体与叶肉原生质体的融合及培养早期变化
Ⅰ ,4)。培养 2周后加入 50μg/ml卡那霉素进行抗性细胞团的筛选 ,少数多细胞团存活 ,继
续分裂形成小愈伤组织。植株再生和杂种鉴定工作有待继续进行。
由于烟草花粉原生质体迄今尚不能独自分裂形成愈伤组织 ,而黄花烟草叶肉原生质体
不抗卡那霉素 ,故经卡那霉素筛选而存活的多细胞团与愈伤组织有可能来源于二者融合后
的产物。
二 、成熟花粉原生体与叶肉原生质体的融合与培养
成熟花粉原生质体与叶肉原生质体融合(图版 Ⅰ , 5),融合体培养后很快产生管状结构 ,
来源于叶肉原生质体的叶绿体或分散于管中或在管内聚集成团(图版 Ⅰ ,6)。图版Ⅰ , 7示
二个花粉原生质体与一个叶肉原生质体融合后产生的管状结构 ,图版 Ⅰ , 8示同一管状结构
经 DAPI染色后的荧光图象 , a示叶肉原生质体核和花粉原生质体生殖核分裂产生的二个精
核 ,b示另一个花粉原生质体的生殖核分裂产生的一对精核。
三 、成熟花粉原生质体之间的融合与培养
成熟花粉原生质体一经粘连即很快完成融合(图版Ⅰ , 10)。由于参加融合的花粉原生
质体数目不同 ,融合产生了二核 、三核(图版Ⅰ ,9)或四核。这些融合体培养后均产生管状结
构 ,生殖细胞在管内分裂产生一对 、二对或三对精子(图版Ⅰ ,11 、12)。管状结构经荧光增白
剂鉴定具有管壁 。随着培养时间的延长 ,融合体产生的管状结构的尖端几乎都破裂(图版
Ⅰ ,12)。
讨　　论
花粉原生质体两条发育途径(分化与脱分化)机理是值得深究的问题。 Tanaka 等
(1987)〔10〕和周嫦(1988)〔1〕分别培养麝香百合和萱草成熟花粉原生质体均产生管状结构 ,并
观察到生殖核分裂产生精子 ,即继续花粉在体内原有的配子体发育途径 。周嫦(1989)〔2〕培
养萱草幼嫩花粉原生质体 ,启动胚胎发生分裂形成多细胞团 ,即转向孢子体发育途径 。
那么 ,当不同发育时期的花粉原生质体分别和体细胞原生质体融合时 ,对融合体的发育
有何影响呢?本实验培养烟草属花粉原生质体和叶肉原生质体的融合体 ,也观察到“两条发
育途径”的现象:幼嫩花粉原生质体的分化程度不如成熟花粉原生质体高 ,与叶肉原生质体
融合后 ,融合体能够发生细胞分裂形成细胞团 。这种分裂能力应该主要来自叶肉原生质体 ,
但至少幼嫩花粉原生质体的脱分化潜能并不阻碍叶肉原生质体的分裂。成熟花粉花粉原生
质体由于已呈高度分化状态 ,其与叶肉原生质体融合的产物经培养后很快产生管状结构 ,表
明前者的配子体发育能力超过并抑制了后者的分裂能力。
花粉粒原生质体与体细胞原生质体融合是“配子 —体细胞杂交”(gameto -somatic hy-
bridization)的一种新方法。以往的配子一体细胞杂交是以小孢子四分体原生质体与体细胞
原生质融合〔8 ,9〕 。四分体时期短暂 、体积很小 、取材不甚方便 ,而游离花粉时期分离原生质
体的成功 ,为此提供了更广泛的选择。继芸苔属花粉粒原生质体与体细胞原生质体融合再
生杂种植物株以后〔4〕 ,本实验在烟草属中也作了类似试验 ,并增加了卡那霉素筛选系统 ,从
而为下一步的植株再生与杂种鉴定奠定了基础。
ABSTRACT
Isolated pollen pro toplasts of Nicotiana tabacum N364 K+m were fused w ith mesophyll
98 植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
protoplasts of Nicotiana rust ica using PEG-high Ca/pH method.The cells resulted form fus-
tion between immature (early -middle bicellular)pollen protoplast and mesophyll protoplast
could divide to produce multicellular structures and microcalli when being cultured in a selection
KM 8p ,medium containing 50μg/ml kanamycin.The cells derived f rom fusion of mature pollen
protoplast w ith mesophyll Protoplastant only formed tube-like st ructures instead of cell divi-
sion.The results of the experiment indicated that the developmental stage of pollen protoplasts
involved in fusion played an improtant role in deciding the developmental pathw ay s of the fusion
products:The mature pollen protoplast w hen fused w ith somatic one exhibited strong influence
of gametophy tic deveolpmental trends tow ards tube g row th , whereas the younger pollen proto-
plast had some potential of sporophy tic development w hich did no t negatively af fect division a-
bility of its somatic partner.Regeneration and genetic characterizat ion of plants f rom the micro-
calli are underw ay.
Key words　Pollen pro toplast;Protoplast fusion;Protoplast culture;Nicat iana tabacum ;
Nicntiana rustica
参　　考　　文　　献
〔1〕 李昌功 、周嫦 、杨弘远 , 1994:芸苔属花粉-下胚轴原生质体融合再生杂种植株。植物学报 , 36(12):905-910。
〔2〕 汪泳 、周嫦 , 1995:烟草粉原生质体的分离。植物学报 , 37(5):413-416。
〔3〕 周嫦 , 1988:三种植物花粉原生质体的大量分离与初步培养。植物学报 , 30(4):362-367。
〔4〕 周嫦 , 1989:萱草花粉原生质体培养启动胚胎胎发生分裂 ,植物学报 , 31(6):409-413。
〔5〕 莫永胜 、杨弘远 , 1992:几种具有二细胞型花粉植物精细胞的分离和融合。植物学报 , 34(9):688-697。
〔6〕 Kyo , M., and Harada , H., 1986:Cont rol of the developmental pathway of tobacco pollen in Vit ro , Planta , 168:427-
432.
〔7〕 Kao.K.N.and Michayluk.M.R., 1975:Nutri tional requirements for growth of vicia haiastana cell and protoplast at very
low population in density liquid medium planta 126:105-110.
〔8〕 Lee , C.H.and Pow er , J.B., 1988:Intra-and interspecific gametosomatic hybridi sation within thd genus Petunia.Plant
cell , Tisue and Organ Culture , 12:197-200.
〔9〕 Pental , D., Mukbopadhyay , A., Grover , A.and Pradhan , A.K., 1988:A selection method for the synthesis of triploid
bybrids by fusion of microspore protoplast s(n)wi th somatic cell protoplasts(2n).Theor , Appl.Genet., 76:48-52.
〔10〕 Tanaka , I., Kitazumc , C.and Ito , M., 1987:The isolation and culture of lily pollen protoplast s , Plant Science , 50:205
-211.
〔11〕 Ueda.K., Miyamoto.Y.and Tanaka.I., 1990:Fusion studies of pollen protoplast s and generative cell protoplasts in Lil-
ium longifu rum.Plant Science , 72:259-266.
图　　版　　说　　明
1.一对融合前的幼嫩花粉原生质体与叶肉原生质体。 ×590;2.正在融合的幼嫩花粉原生质体与叶肉原生质体。 ×
590;3.融合体培养第 6天 ,分裂一次形成二个大小相等的细胞。 ×500;4.融合体继续分裂形成多细胞团。 ×500;5.
成熟花粉原生质体与叶肉原生质体融合群体。 ×300;6.成熟花粉原生质体与叶肉原生质体的融合体 ,培养 5小时形成
管状结构。 ×100;7.二个花粉原生质体与一个叶肉原生质体融合 ,培养 3天后形成管状结构。 ×100;8.图 7的 DAPI
荧光照片 ,示管内细胞核。 a为一个花粉原生质体核和一个体细胞核的部位 , b为另一个花粉原生质体的生殖核分裂产生
的一对精核。 ×300;9.由三个成熟花粉原生质体融合形成的融合体 ,示其中含有三个生殖核。 ×130;10.正在融合的
二个成熟花粉原生质体。 ×180;11.三个成熟花粉原生质体之间的融合体 ,培养 3天后形成的管状结构。 ×100;12.图
11的 DAPI 荧光照片, a 、b 、c示管内相应部位的三对精核。 ×300;
991 期　　　　卢萍等:烟草花粉原生质体与叶肉原生质体的融合及培养早期变化