全 文 ：第 源员 卷摇 第 圆 期
圆园员源 年 源 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 圆
粤责则援 摇 圆园员源
摇
基金项目院 国家公益性行业渊农业冤科研专项渊圆园员园园猿园苑源冤袁中央级公益性科研院所基本科研业务费专项渊员远猿园园源圆园员圆园园源冤袁国家自然科
学基金渊猿员猿远园源圆远冤袁江西省自然科学基金渊圆园员猿圆月粤月圆员源园圆园冤袁江西省博士后科研择优资助项目
作者简介院 张岳平袁男袁员怨愿员年生袁助理研究员袁研究方向为芦笋生物工程袁 耘鄄皂葬蚤造院 责葬造泽圆园员员岳 员圆远援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 早藻灶藻遭噪泽澡岳 澡燥贼皂葬蚤造援 糟燥皂曰 收稿日期院 圆园员猿 原 园苑 原 园猿
芦笋茎枯病菌原生质体的制备及再生
张岳平员 摇 罗绍春员 摇 黄燕萍员 摇 汤泳萍员 摇 易克贤圆 摇 谢丙炎猿 摇 陈光宇员鄢
渊员援江西省农业科学院蔬菜花卉研究所袁 南昌 猿猿园圆园园曰 圆援中国热带农业科学院环境与
植物保护研究所袁 海南 海口 缘苑员员园员曰 猿援中国农业科学院蔬菜花卉研究所袁 北京 员园园园愿员冤
摘要院 原生质体的制备是真菌遗传转化的基础袁为了解芦笋茎枯病菌 孕澡燥皂燥责泽蚤泽 葬泽责葬则葬早蚤 的遗传转
化体系袁以芦笋茎枯病菌 孕葬员员园园 为供试菌株袁研究了细胞壁裂解酶尧酶解时间尧稳渗剂等对芦笋茎
枯病菌原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响遥 结果表明可制备芦笋茎枯病菌原生
质体较为适宜的条件是院悦酝液体培养基中培养分生孢子 猿 凿袁以 员援 缘豫裂解酶尧员豫崩溃酶和 员援 缘豫
蜗牛酶为组合酶解液袁猿猿 益水浴酶解 源援 缘 澡袁以 孕月杂渊责匀 远援 怨愿冤与 员 皂燥造 辕 蕴 酝早杂韵源 混合液为酶解稳渗
剂遥 含 园援 远 皂燥造 辕 蕴蔗糖的 孕阅粤培养基较适合于芦笋茎枯病菌原生质体的再生遥
关键词院 芦笋茎枯病菌曰 原生质体曰 制备曰 再生
陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 孕澡燥皂燥责泽蚤泽 葬泽责葬则葬早蚤 责则燥贼燥责造葬泽贼
在澡葬灶早 再怎藻责蚤灶早员 摇 蕴怎燥 杂澡葬燥糟澡怎灶员 摇 匀怎葬灶早 再葬灶责蚤灶早员 摇 栽葬灶早 再燥灶早责蚤灶早员 摇 再蚤 运藻曾蚤葬灶圆 摇
载蚤藻 月蚤灶早赠葬灶猿 摇 悦澡藻灶 郧怎葬灶早赠怎员鄢
渊员援 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 灾藻早藻贼葬遭造藻泽 葬灶凿 云造燥憎藻则泽袁 允蚤葬灶早曾蚤 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 晕葬灶糟澡葬灶早 猿猿园圆园园袁
允蚤葬灶早曾蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼葬造 葬灶凿 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠
燥枣 栽则燥责蚤糟葬造 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 匀葬蚤噪燥怎 缘苑员员园员袁 匀葬蚤灶葬灶 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰 猿援 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣
灾藻早藻贼葬遭造藻泽 葬灶凿 云造燥憎藻则泽袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 月藻蚤躁蚤灶早 员园园园愿员袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 郧藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 枣怎灶早葬造 责则燥贼燥责造葬泽贼 蚤泽 葬灶 藻泽泽藻灶贼蚤葬造 贼燥燥造 枣燥则 早藻灶藻贼蚤糟 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂援 栽燥
藻泽贼葬遭造蚤泽澡 责则燥贼燥责造葬泽贼鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 早藻灶藻贼蚤糟 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 燥枣 孕澡燥皂燥责泽蚤泽 葬泽责葬则葬早蚤袁 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 枣燥则 贼澡藻
责则燥贼燥责造葬泽贼 蚤泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 孕葬员员园园 皂赠糟藻造蚤葬袁 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 增葬则蚤燥怎泽 藻灶扎赠皂藻泽袁 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 贼蚤皂藻袁 葬灶凿
燥泽皂燥贼蚤糟 泽贼葬遭蚤造蚤扎藻则泽袁 憎藻则藻 藻曾葬皂蚤灶藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠援 粤灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼 皂藻贼澡燥凿 枣燥则 责则燥贼燥责造葬泽贼 蚤泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿
则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 孕援 葬泽责葬则葬早蚤 憎葬泽 燥遭贼葬蚤灶藻凿援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 猿鄄凿葬赠鄄燥造凿 皂赠糟藻造蚤葬 糟怎造贼怎则藻凿 蚤灶 造蚤择怎蚤凿
悦酝 皂藻凿蚤怎皂 憎葬泽 葬凿藻择怎葬贼藻 贼燥 责则燥贼燥责造葬泽贼 蚤泽燥造葬贼蚤燥灶援 栽澡藻 藻灶扎赠皂藻 皂蚤曾贼怎则藻 燥枣 员援 缘豫 造赠葬泽藻袁 员豫 凿则蚤泽藻造葬泽藻 葬灶凿
员援 缘豫 泽灶葬蚤造葬泽藻 憎葬泽 皂燥泽贼 遭藻灶藻枣蚤糟蚤葬造 枣燥则 凿蚤早藻泽贼蚤灶早 贼澡藻 皂赠糟藻造蚤葬援 栽澡藻 泽怎蚤贼葬遭造藻 蚤灶糟怎遭葬贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 憎蚤贼澡 藻灶扎赠皂藻
枣燥则 贼澡藻 皂葬曾蚤皂怎皂 则藻造藻葬泽藻 燥枣 责则燥贼燥责造葬泽贼泽 憎葬泽 源援 缘 澡 蚤灶 葬 憎葬贼藻则 遭葬贼澡 葬贼 猿猿 益 援 栽澡藻 皂燥泽贼 藻枣枣藻糟贼蚤增藻 燥泽皂燥贼蚤糟
泽贼葬遭蚤造蚤扎藻则 枣燥则 贼澡藻 责则燥贼燥责造葬泽贼 则藻造藻葬泽藻 憎葬泽 员 皂燥造 辕 蕴 酝早杂韵源 糟燥皂遭蚤灶藻凿 憎蚤贼澡 责澡燥泽责澡葬贼藻 遭怎枣枣藻则 渊 责匀 远援 怨愿冤援
孕援 葬泽责葬则葬早蚤 责则燥贼燥责造葬泽贼 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 责燥贼葬贼燥 凿藻曾贼则燥泽藻 葬早葬则 皂藻凿蚤怎皂 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早
园援 远 皂燥造 辕 蕴 泽怎糟则燥泽藻 憎葬泽 贼澡藻 遭藻泽贼 皂藻凿蚤怎皂 枣燥则 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶援
运藻赠 憎燥则凿泽院 孕澡燥皂燥责泽蚤泽 葬泽责葬则葬早蚤曰 责则燥贼燥责造葬泽贼曰 蚤泽燥造葬贼蚤燥灶曰 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶
摇 摇 芦笋 粤泽责葬则葬早怎泽 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造蚤泽 蕴援是一种具有很高营
养价值的保健型蔬菜遥 芦笋茎枯病是由天门冬拟茎
点霉 孕澡皂燥责泽蚤泽 葬泽责葬则葬早蚤 引起的重要真菌病害袁俗称
芦笋野癌症冶遥 目前袁中国芦笋生产面积居世界第
一袁茎枯病在我国发生特别严重袁近年平均感染率超
过 缘园豫 袁常导致成片绝收袁已成为制约芦笋产业发
展的主要瓶颈之一咱员 原 猿暂 遥 该病重点为害茎杆或嫩
笋袁也可侵染枝梗和拟叶袁病斑初呈水渍状条斑袁后
渐变成暗黑色梭条形袁中部赤褐色凹陷袁大量小黑点
状分生孢子器散生其上袁最终导致整株枯死并迅速
传染至相邻植株咱源暂 遥 该病菌主要以分生孢子器或
菌丝体在田间病残体上越冬袁适宜条件下进行初侵
染和再侵染咱圆 原 猿袁缘暂 遥 目前袁生产上对芦笋茎枯病尚无
有效的化学防治方法袁因为雨水是病害传播的重要
媒介袁一般采用设施避雨栽培进行病害预防遥 国内
外芦笋茎枯病相关报道较多袁但大都集中在病原菌
命名尧生物学特性尧寄主和生物拮抗等方面咱远 原 愿暂 袁尚
未见芦笋茎枯病菌的原生质体制备体系相关报道遥
为了有效地防治该病害袁需对其进行分子生物学方
面的相关探讨袁鉴定致病相关基因袁并分析其功能和
调控机理袁从而深入解析其致病机制遥 目前袁利用原
生质体进行分子转化技术已成为丝状真菌转化和相
关分子克隆技术体系的重要组成部分咱怨 原 员员暂 遥 尽管
近年来有关植物丝状真菌遗传转化方面的研究已有
大量报道袁但由于不同种类丝状真菌细胞结构袁尤其
是细胞壁的结构和组成存在着明显差异袁因此制备
原生质体的最佳条件和体系也存在着很大差异遥 本
研究以芦笋茎枯病菌 孕葬员员园园 菌株为试验材料袁研究
了其原生质体制备及再生的条件袁以期为该病原菌
的分子致病机制研究提供重要的方法基础遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试菌株与培养基院供试菌株 孕葬员员园园袁由本
实验室保存遥 燕麦培养基院缘豫燕麦片尧圆豫的琼脂袁
用于产孢遥 悦酝 液体培养基院圆园 伊 硝酸盐 缘园 皂蕴
渊晕葬晕韵猿 员圆园 早尧运悦造 员园援 源 早尧酝早杂韵源窑苑匀圆韵 员园援 源 早尧运匀圆孕韵源 猿园援 源 早袁加水定容至 员 园园园 皂蕴冤尧微量元素混
合液 员 皂蕴 渊在灶杂韵源窑苑匀圆韵 圆援 圆 早尧匀猿月韵猿 员援 员 早尧酝灶悦造圆窑源匀圆韵 园援 缘 早尧云藻杂韵源窑苑匀圆韵 园援 缘 早尧悦燥悦造圆窑远匀圆韵 园援 员苑 早尧悦怎杂韵源窑缘匀圆韵 园援 员远 早尧晕葬圆酝燥韵源窑圆匀圆韵 园援 员缘 早尧晕葬源耘阅栽粤缘 早袁加水定容至 员园园 皂蕴冤尧复合维生素液 员 皂蕴 渊维生
素 匀 园援 园员 早尧维生素 月远 园援 园员 早尧维生素 月员 园援 园员 早尧维
生素 月圆 园援 园员 早尧对氨基苯甲酸 园援 园员 早尧烟酸 园援 园员 早袁加
水定容至 员园园 皂蕴冤尧阅鄄葡萄糖 员园 早尧蛋白胨 圆 早尧酵母
提取物 员 早尧酪蛋白 员 早袁加水定容至 员 园园园 皂蕴袁责匀
远郾 缘袁用于分生孢子培养并制备新鲜菌丝体遥 再生培
养基院在 孕阅粤培养基渊马铃薯 圆园园 早尧阅鄄葡萄糖 圆园 早尧
琼脂 员愿 早尧加水定容至 员园园园皂蕴冤中分别加入蔗糖尧葡
萄糖尧晕葬悦造尧酝早杂韵源袁终浓度均为 园援 远 皂燥造 辕 蕴袁用于原
生质体再生遥
试剂与裂解酶院用于酶解系统的稳渗剂包括
园郾 苑 皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造尧员 皂燥造 辕 蕴 山梨醇尧园援 远 皂燥造 辕 蕴 蔗糖尧不
同浓度的 酝早杂韵源 渊用 责匀 远援 怨愿 的 员园 皂皂燥造 辕 蕴 孕月杂 配
制冤袁试验所用试剂均为国产分析纯遥 裂解酶中
造赠葬泽藻尧凿则蚤泽藻造葬泽藻购于 杂蚤早皂葬公司曰泽灶葬蚤造葬泽藻 购于北京索
莱宝生物科技有限公司遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 原生质体制备方法
菌株 孕葬员员园园在产孢培养基上 圆缘 益尧光照 员圆 澡 辕 凿
培养 员园 耀员源 凿袁收集孢子并制备成混匀的孢子悬液
渊员 伊 员园愿 个 辕 皂蕴冤遥 取 员 皂蕴 置于 员园园 皂蕴 悦酝 液体培
养基中袁圆缘益 员缘园 则 辕 皂蚤灶摇床培养 猿 凿袁收集新鲜菌丝
体 员援 园 早袁无菌水洗涤 圆 次袁员援 圆 皂燥造 辕 蕴 酝早杂韵源 稳渗剂
洗涤 猿次袁加入 员园 皂蕴 员援 缘豫裂解酶渊造赠葬泽藻冤 垣员郾 缘豫蜗
牛酶渊泽灶葬蚤造葬泽藻冤 垣员援 园豫崩溃酶渊凿则蚤泽藻造葬泽藻冤的裂解酶混
合液渊员援 圆 皂燥造 辕 蕴 酝早杂韵源 稳渗剂配制冤袁猿猿 益水浴酶
解遥 血球计数板监测原生质体的形成数量袁确定酶
解时间遥 用 源 层灭菌擦镜纸将原生质体液过滤袁用
山梨醇溶液渊浓度为 员 皂燥造 辕 蕴冤反复洗涤 圆 耀 猿 次袁取
滤液袁缘 园园园 则 辕 皂蚤灶离心 缘 皂蚤灶袁弃上清袁用预冷山梨醇
溶液重悬沉淀袁离心袁制备的原生质体沉淀重悬于山
梨醇袁置冰浴中备用遥 试验设 猿 次重复袁下同遥
员援 圆援 圆 试验设置
菌龄院试验通过在 悦酝 液体培养基中振荡培养
芦笋茎枯病菌分生孢子以获得新鲜菌丝体袁菌龄分
别设置为 员尧圆尧猿 和 源 凿遥
酶解体系院分别取 员援 缘豫 造赠葬泽藻尧员援 缘豫 泽灶葬蚤造葬泽藻
和 员援 园豫 凿则蚤泽藻造葬泽藻及不同酶体系组合研究裂解酶对
芦笋茎枯病菌原生质体产量的影响遥
酶解时间分析院选用经 悦酝 液体培养基振荡培
养 猿 凿的新鲜菌丝体进行原生质体制备袁猿猿 益水浴
中共酶解 远 澡袁且每隔 猿园 皂蚤灶 定期取样袁显微镜下观
测分析原生质体生成情况遥
稳渗剂分析院在酶解体系中袁稳渗剂是保持生成
的原生质体正常形态必需的环境条件袁本试验分别
选择 园援 苑 皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造尧员 皂燥造 辕 蕴 山梨醇尧园援 远 皂燥造 辕 蕴 蔗
糖尧酝早杂韵源渊用 责匀 远援 怨愿 的 员园 皂燥造 辕 蕴 孕月杂 配制袁体积
比为 酝早杂韵源 颐 孕月杂 越 猿颐 员袁酝早杂韵源 浓度分别设为 员援 园尧园援 缘 和 园援 圆 皂燥造 辕 蕴冤等不同的稳渗剂以分析其对芦笋
茎枯病菌原生质体产量的影响遥
员援 圆援 猿 原生质体再生过程
将原生质体用稳渗剂适当稀释后涂布于再生培
猿愿员圆 期 张岳平等院芦笋茎枯病菌原生质体的制备及再生
养基袁在 圆缘 益下培养 猿 耀 缘 凿袁调查再生情况袁对形成
的菌落记数渊粤冤曰以不含稳渗剂的 孕阅粤 培养基作对
照渊月冤袁计算再生率袁再生率渊豫 冤 越 渊粤 原 月冤 辕总原生
质体数 伊员园园遥
员援 圆援 源 原生质体再生菌株的致病性鉴定
以浓度为 员援 园 伊 员园苑 个 辕 皂蕴 的原生质体再生菌
株分生孢子悬浮液喷雾接种芦笋嫩茎袁圆缘 益尧员圆 澡院
员圆 澡光照培养袁苑 耀 员园 凿 内检查症状反应袁以原菌株
孕葬员员园园 为对照遥
员援 猿 数据分析
数据统计采用 耘曾糟藻造 圆园园苑 软件分析袁利用
杂孕杂杂员猿援 园 软件中 韵灶藻鄄宰葬赠 粤晕韵灾粤方法进行方差分
析袁蕴杂阅法进行多重比较遥
圆 结果与分析
圆援 员 原生质体的制备
圆援 员援 员 菌龄
试验表明袁培养 猿 凿 的新鲜菌丝体产生的原生
质体相对最多袁当菌龄增加时袁获得的原生质体产量
反而下降遥 说明不同菌龄对酶解作用过程中原生质
体的产量影响明显袁分生孢子培养时间过短袁菌丝体
过于幼嫩袁酶解后形成的原生质体在释放后更易破
裂曰菌丝培养时间过长袁菌丝细胞壁成分和结构改变袁
老化增厚袁较难被成功酶解袁造成原生质体产量减少遥
圆援 员援 圆 裂解酶
芦笋茎枯病菌原生质体的产量受不同的裂解酶
种类作用较大袁且复合酶组合酶解效率高于单种酶遥
在单种酶作用下袁酶解菌株 孕葬员员园园 新鲜菌丝体时袁
员援 园豫裂解酶解释放的原生质体产量较高袁为 苑郾 园 伊
员园远 个 辕 皂蕴袁员援 缘豫蜗牛酶产量最少袁为 圆援 员 伊 员园远 辕 皂蕴遥
当这几种裂解酶以不同的方式组合时袁原生质体产量
均能不同程度地得到提高袁其中以 猿种酶同时存在的
组合下效率最高袁原生质体产量可达圆援 远 伊 员园苑 辕 皂蕴
渊表 员冤遥
圆援 员援 猿 酶解时间
在酶解初期袁随着酶解时间的增加袁原生质体不
断从菌丝体中被释放袁酶解 员援 缘 澡 时原生质体产量
为 园援 缘 伊 员园苑 个 辕 皂蕴遥 当酶解 源援 缘 澡时新鲜菌丝体已
基本被酶解完成袁此时原生质体产量达最高袁为
圆援 愿 伊 员园苑 个 辕 皂蕴遥 继续延长酶解时间袁原生质体产
量出现下降袁缘援 缘 澡 时产量为 圆援 园 伊 员园苑 个 辕 皂蕴遥 说
明袁适当的酶解时间有利于芦笋茎枯病菌新鲜菌丝
体的原生质体释放袁但酶解时间过长则一方面酶的
裂解效率会受到影响袁另一方面会造成不断释放的
原生质体较长时间暴露在酶解液中袁原生质体膜会
受到一定的破坏袁从而不利于原生质体的总产量
提高遥
圆援 员援 源 稳渗剂类型
不同稳渗剂对原生质体的生成作用不同袁用
孕月杂 配制的 员援 园 皂燥造 辕 蕴 酝早杂韵源 是 孕葬员员园园 菌株释放原
生质体较好的稳渗剂袁产量为 圆援 缘 伊 员园苑 辕 皂蕴曰其次是
员援 园 皂燥造 辕 蕴山梨醇袁为 怨援 员 伊 员园远 个 辕 皂蕴渊表 圆冤遥 低浓
度的 酝早杂韵源 不利于菌丝体充分释放原生质体袁当酝早杂韵源 浓度降到 园援 圆 皂燥造 辕 蕴时原生质体显著下降遥
表 员 不同裂解酶组合对芦笋茎枯病菌新鲜菌丝体原生质体产量的影响
栽葬遭造藻 员 陨灶枣造怎藻灶糟藻泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟燥皂皂藻则糟蚤葬造 藻灶扎赠皂藻 糟燥皂遭蚤灶葬贼蚤燥灶泽 燥灶 贼澡藻 则藻造藻葬泽藻凿 责则燥贼燥责造葬泽贼 燥枣 枣则藻泽澡 皂赠糟藻造蚤葬
燥枣 孕澡燥皂燥责泽蚤泽 葬泽责葬则葬早蚤 孕葬员员园园
裂解酶 耘灶扎赠皂藻 原生质体产量 孕则燥贼燥责造葬泽贼 渊 伊 员园远 辕 皂蕴冤
员援 缘豫 裂解酶 员援 缘豫 蕴赠葬泽藻 猿援 愿 依 园援 圆 凿
员援 缘豫 蜗牛酶 员援 缘豫 杂灶葬蚤造葬泽藻 圆援 员 依 园援 员 凿
员援 园豫 崩溃酶 员援 园豫 阅则蚤泽藻造葬泽藻 苑援 园 依 园援 缘 糟
员援 缘豫 裂解酶 垣员援 缘豫 蜗牛酶
员援 缘豫 蕴赠葬泽藻 垣 员援 缘豫 杂灶葬蚤造葬泽藻 苑援 缘 依 园援 圆 糟
员援 缘豫 裂解酶 垣员援 园豫 崩溃酶
员援 缘豫 蕴赠葬泽藻 垣 员援 园豫 阅则蚤泽藻造葬泽藻
员缘援 远 依 园援 苑 遭
员援 缘豫 蜗牛酶 垣员援 园豫 崩溃酶
员援 缘豫 杂灶葬蚤造葬泽藻 垣 员援 园豫 阅则蚤泽藻造葬泽藻
员圆援 缘 依 园援 源 遭
员援 缘豫 裂解酶 垣 员援 缘豫 蜗牛酶 垣员援 园豫 崩溃酶
员援 缘豫 蕴赠葬泽藻 垣 员援 缘豫 杂灶葬蚤造葬泽藻 垣 员援 园豫 阅则蚤泽藻造葬泽藻
圆远援 园 依 园援 员 葬
摇 摇 表中数据为平均数 依标准误袁不同小写字母分别表示经 蕴杂阅法检验差异显著渊孕 约 园援 园缘冤遥 阅葬贼葬 蚤灶 贼澡藻 贼葬遭造藻 葬则藻 皂藻葬灶 依 杂阅援 阅蚤枣枣藻则藻灶贼
造燥憎藻则糟葬泽藻 造藻贼贼藻则泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 葬贼 孕 约 园援 园缘 造藻增藻造 遭赠 蕴杂阅 贼藻泽贼援
源愿员 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
表 圆 不同稳渗剂对芦笋茎枯病菌原生质体产量的影响
栽葬遭造藻 圆 陨灶枣造怎藻灶糟藻泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 燥泽皂燥贼蚤糟 泽贼葬遭蚤造蚤扎藻则泽 燥灶 贼澡藻 则藻造藻葬泽藻凿 责则燥贼燥责造葬泽贼 燥枣 枣则藻泽澡 皂赠糟藻造蚤葬 燥枣 孕澡燥皂燥责泽蚤泽 葬泽责葬则葬早蚤 孕葬员员园园
稳渗剂 韵泽皂燥贼蚤糟 泽贼葬遭蚤造蚤扎藻则 原生质体产量 孕则燥贼燥责造葬泽贼 渊 伊 员园远 辕 皂蕴冤
园援 苑 皂燥造 辕 蕴 氯化钠 园援 苑 皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造 缘援 苑 依 园援 缘 糟
员援 园 皂燥造 辕 蕴 山梨醇 员援 园 皂燥造 辕 蕴 杂燥则遭蚤贼葬造 怨援 员 依 园援 员 遭
园援 远 皂燥造 辕 蕴 蔗糖 园援 远 皂燥造 辕 蕴 杂怎糟则燥泽藻 远援 愿 依 园援 猿 糟
员援 园 皂燥造 辕 蕴 硫酸镁 员援 园 皂燥造 辕 蕴 酝早杂韵源 圆缘援 园 依 园援 远 葬园援 缘 皂燥造 辕 蕴 硫酸镁 园援 缘 皂燥造 辕 蕴 酝早杂韵源 缘援 圆 依 园援 员 糟园援 圆 皂燥造 辕 蕴 硫酸镁 园援 圆 皂燥造 辕 蕴 酝早杂韵源 园援 远 依 园援 园 凿
摇 摇 表中数据为平均数 依标准误袁不同小写字母分别表示经 蕴杂阅法检验差异显著渊孕 约 园援 园缘冤遥 阅葬贼葬 蚤灶 贼澡藻 贼葬遭造藻 葬则藻 皂藻葬灶 依 杂阅援 阅蚤枣枣藻则藻灶贼
造燥憎藻则糟葬泽藻 造藻贼贼藻则泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 葬贼 孕 约 园援 园缘 造藻增藻造 遭赠 蕴杂阅 贼藻泽贼援
圆援 员援 缘 原生质体的形态观测
芦笋茎枯病菌原生质体的形态呈圆形袁相对比
较规则袁释放后原生质体的体积具有较为明显的变
化袁初释放时体积较小袁随着在等渗液中时间的延
长袁体积有加大的趋势袁部分原生质体出现较大的液
泡遥 原生质体直径大小为 源援 园 耀 员员援 园 滋皂袁平均约为
苑援 园 滋皂渊图 员冤遥
图 员 芦笋茎枯病菌原生质体形态
云蚤早援 员 孕则燥贼燥责造葬泽贼 皂燥则责澡燥造燥早赠 燥枣 孕澡燥皂燥责泽蚤泽 葬泽责葬则葬早蚤 孕葬员员园园
圆援 圆 原生质体的再生
圆援 圆援 员 稳渗剂对原生质体再生的影响
园援 远 皂燥造 辕 蕴的蔗糖作为稳渗剂时袁菌株原生质体
的再生率最高袁为 圆源援 园豫 袁园援 苑 皂燥造 辕 蕴 晕葬悦造 作为稳渗
剂时再生率较低渊图 圆冤遥
圆援 圆援 圆 酶解时间对原生质体再生的影响
酶解 猿 耀 缘 澡原生质体再生率差别不大袁源援 缘 澡时
最高袁为 圆圆援 园豫 袁酶解时间过长不利于原生质体的
再生渊图 圆冤遥 这说明裂解酶对生成的原生质体质膜
系统具有一定的破坏作用袁原生质体的再生效率受
到酶解时间长短的影响遥
圆援 猿 原生质体再生菌株的致病性鉴定
芦笋茎枯病菌原生质体再生菌株在 韵粤产孢培
图 圆 不同稳渗剂和酶解时间对原生质体再生的影响
云蚤早援 圆 陨灶枣造怎藻灶糟藻泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 燥泽皂燥贼蚤糟 泽贼葬遭蚤造蚤扎藻则泽 葬灶凿
凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 燥灶 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 责则燥贼燥责造葬泽贼
养基上培养获得的分生孢子与原菌株 孕葬员员园园 分生
孢子的形态学特征经比较袁无明显差异遥 进一步利
用分生孢子进行了致病接种分析袁当分别以 员援 园 伊
员园苑 浓度的再生菌株和原菌株分生孢子喷雾接种感
病芦笋品种后袁再生菌株与原菌株表现出相同的致
病力和致病症状袁表明原生质体再生菌株的致病力
并没有发生改变遥
猿 讨论
生长时间较短的新鲜菌丝体是制备真菌原生质
缘愿员圆 期 张岳平等院芦笋茎枯病菌原生质体的制备及再生
体的重要材料袁本研究表明袁由芦笋茎枯病菌的分生
孢子在 悦酝液体培养基中振荡培养 猿 凿 后获得的新
鲜菌丝体比较适合原生质体的制备袁进一步延长培
养时间会造成原生质体产量下降袁这与前人研究结
果一致咱员圆 原 员猿暂 袁可能的原因是过长的培养时间导致菌
丝体细胞壁成分改变袁不利于裂解酶的破壁和原生
质体的形成和释放遥 徐齐君等咱怨暂 尧卢明锋和张月
杰咱员园暂 尧周礼红等咱员员暂报道袁丝状真菌细胞壁结构复
杂袁主要由几丁质尧半纤维素和蛋白质等多成分构
成袁单种酶只能降解其中的一种或几种成分袁从而造
成破壁效果较差袁不利于获得较高产量的原生质体遥
本试验表明袁单种酶中袁崩溃酶裂解获得的原生质体
产量最多袁这可能与其是一种复合酶袁内含昆布多糖
酶尧木聚糖酶和纤维素酶袁破壁能力强有关咱员圆暂 曰蜗牛
酶和裂解酶也是复合酶袁但效果不及崩溃酶曰当上述
猿 种酶复合组配使用后袁相同条件下原生质体产量
显著增加遥 本试验结果还表明袁除裂解酶种类外袁不
同酶浓度的选择也是影响原生质体制备的重要因素
之一袁过低浓度会造成破壁不理想从而影响产量袁过
高的酶液则造成浪费且对生成的原生质体不利袁本
试验中使用 员豫 耀 员援 缘豫的 猿 种酶的混合使用酶解
效果较好遥 此外袁酶解 源援 缘 澡 后新鲜菌丝体已基本
被酶解完成袁原生质体产量可达 圆援 愿 伊 员园苑 个 辕 皂蕴袁
继续酶解则会对已释放的原生质体产生一定的破
坏袁反而导致产量下降遥 稳渗剂的选择与不同菌种
特性有关袁合适的稳渗剂对获得高产原生质体至关
重要袁本试验表明袁孕月杂 配制的员援 园 皂燥造 辕 蕴 酝早杂韵源 可
作为菌株 孕葬员员园园 制备原生质体较理想的稳渗剂袁可
能的原因是过低浓度的稳渗剂造成酶解体系的渗透
压过低袁不利于酶解液渗透并破坏菌丝体细胞壁袁也
不利于生成的原生质体保持正常形态袁这充分表明
在酶解体系中袁稳渗剂的合理选择对芦笋茎枯病菌
原生质体的形成非常重要遥
原生质体的高效再生是后期深入研究其致病分
子机制的必需条件袁本试验明确了适合于芦笋茎枯
病菌原生质体再生的酶解时间及稳渗剂种类袁酶解
猿 耀 缘 澡 原生质体可获得较高的再生率袁酶解时间过
长不利于原生质体的再生曰以 园援 远 皂燥造 辕 蕴 的蔗糖作
为稳渗剂时袁菌株原生质体的再生率最高遥 相对于
无机盐袁山梨醇和蔗糖等作为稳渗剂时可获得较高
的原生质体再生率袁这与周礼红等咱员员暂 和宋庆涛
等咱员源暂的研究结果一致遥 此外袁通过原生质体再生获
得的芦笋茎枯病菌菌株的致病力变化是后续研究的
重要基础袁本研究进一步分析了再生菌株的致病力
特征袁结果表明袁再生菌株保持了与原菌株相同的致
病特征和致病力遥 本研究构建了芦笋茎枯病菌原生
质体制备与再生体系袁探明了相关因素对体系构建
的影响袁为进一步建立病原菌的分子转化体系尧致病
相关基因研究和致病机制解析提供了重要的材料
基础遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 张岳平袁 陈光宇袁 罗绍春袁 等援 芦笋重要真菌病害研究进
展援 中国农学通报袁 圆园员圆袁 圆愿渊猿员冤院 员员源 原 员员怨
咱圆暂 陈光宇援 中国芦笋研究与产业发展援 北京院 中国农业出版
社袁 圆园员园
咱猿暂 陈光宇援 芦笋无公害生产技术援 北京院 中国农业出版社袁
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咱苑暂 刘克均袁 张凤如袁 陈永萱援 芦笋茎枯病病原菌的订正援 真菌
学报袁 员怨怨员袁 员园渊源冤院 猿圆怨 原 猿猿园
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生及其遗传转化系统援 遗传袁 圆园园缘袁 圆苑渊猿冤院 源圆猿 原 源圆愿
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