全 文 ：第 源员 卷摇 第 圆 期
圆园员源 年 源 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 圆
粤责则援 摇 圆园员源
摇
基金项目院 安徽省农业科学院院长青年创新基金项目渊员圆月员员圆圆冤
作者简介院 周凤艳袁女袁员怨愿圆年生袁助理研究员袁研究方向为杂草抗性机制与生物防治袁 耘鄄皂葬蚤造院 扎澡燥怎枣赠员怨愿圆岳 员远猿援 糟燥皂
收稿日期院 圆园员猿 原 园怨 原 园猿
空心莲子草致病菌假隔链格孢菌原生
质体的制备与再生
周凤艳员 摇 张摇 勇员 摇 周振荣圆 摇 刘小林员
渊员援安徽省农业科学院袁植物保护与农产品质量安全研究所袁 合肥 圆猿园园猿员曰
圆援当涂县农业技术推广中心袁 安徽 当涂 圆源猿员园园冤
摘要院 为建立空心莲子草致病菌假隔链格孢菌 晕蚤皂遭赠葬 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻 的原生质体提取体系袁以其强
致病性野生型菌株 晕援 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻 员员鄄圆 为供试菌株袁研究了不同菌龄尧酶系统尧酶解时间及稳渗剂
等对假隔链格孢菌原生质体制备及再生的影响袁并采用聚乙二醇 孕耘郧 介导转化法袁构建了随机插
入突变体库遥 结果表明袁在酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中培养 圆 凿 的假隔链格孢菌丝体袁以
园郾 苑 酝山梨醇为稳渗剂袁同时使用 圆豫裂解酶尧圆豫崩溃酶和 圆豫蜗牛酶 猿 种酶的混合液袁在 猿园 益下
酶解 猿 澡能获得足量的原生质体袁且其再生率也可满足后继转化试验的要求遥
关键词院 假隔链格孢菌曰 原生质体曰 突变体
孕则藻责葬则葬贼蚤燥灶 葬灶凿 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 责则燥贼燥责造葬泽贼泽 枣燥则 葬造造蚤早葬贼燥则 憎藻藻凿
责葬贼澡燥早藻灶 晕蚤皂遭赠葬 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻
在澡燥怎 云藻灶早赠葬灶员 摇 在澡葬灶早 再燥灶早员 摇 在澡燥怎 在澡藻灶则燥灶早圆 摇 蕴蚤怎 载蚤葬燥造蚤灶员
渊员援 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶 葬灶凿 粤则燥鄄孕则燥凿怎糟贼 杂葬枣藻贼赠袁 粤灶澡怎蚤 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁
匀藻枣藻蚤 圆猿园园猿员袁 粤灶澡怎蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 阅葬灶早贼怎 悦燥怎灶贼赠 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻 栽藻糟澡灶燥造燥早赠 葬灶凿
孕燥责怎造葬则蚤扎葬贼蚤燥灶 悦藻灶贼藻则袁 阅葬灶早贼怎 圆源猿员园园袁 粤灶澡怎蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 晕蚤皂遭赠葬 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻 蚤泽 葬 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟 枣怎灶早怎泽 燥枣 贼澡藻 蚤灶增葬泽蚤增藻 葬造造蚤早葬贼燥则 憎藻藻凿袁 粤造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬
责澡蚤造燥曾藻则燥蚤凿藻泽 渊酝葬则贼援 冤 郧则蚤泽藻遭援 陨灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠袁 葬 澡蚤早澡造赠 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟 葬灶凿 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 泽贼则葬蚤灶 燥枣 晕援 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻
员员鄄圆 憎葬泽 泽藻造藻糟贼藻凿 贼燥 藻泽贼葬遭造蚤泽澡 葬 责则燥贼燥责造葬泽贼 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂援 栽澡藻 蚤灶枣造怎藻灶糟藻泽 燥枣 葬早藻袁 藻灶扎赠皂藻 泽赠泽贼藻皂袁
藻灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽 贼蚤皂藻 葬灶凿 燥泽皂燥贼蚤糟 泽贼葬遭蚤造蚤扎藻则 燥灶 贼澡藻 责则藻责葬则葬贼蚤燥灶 葬灶凿 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 枣怎灶早葬造 责则燥贼燥责造葬泽贼泽 憎藻则藻
藻曾葬皂蚤灶藻凿援 陨灶 葬凿凿蚤贼蚤燥灶袁 贼澡藻 责燥造赠藻贼澡赠造藻灶藻 早造赠糟燥造鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿 憎葬泽 怎泽藻凿 贼燥 藻泽贼葬遭造蚤泽澡 葬
则葬灶凿燥皂造赠 蚤灶泽藻则贼藻凿 皂怎贼葬灶贼 造蚤遭则葬则赠援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 泽怎枣枣蚤糟蚤藻灶贼 责则燥贼燥责造葬泽贼泽 糟燥怎造凿 遭藻 责则燥凿怎糟藻凿 憎澡藻灶
晕援 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻 澡赠责澡燥泽贼则燥皂葬 憎藻则藻 糟怎造贼蚤增葬贼藻凿 蚤灶 葬 造蚤择怎蚤凿 皂藻凿蚤怎皂 燥枣 赠藻葬泽贼 藻曾贼则葬糟贼 责藻责贼燥灶藻 凿藻曾贼则燥泽藻 枣燥则 圆
凿葬赠泽 葬灶凿 贼澡藻灶 怎灶凿藻则憎藻灶贼 猿 澡燥怎则泽 燥枣 藻灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽 葬贼 猿园 益袁 憎蚤贼澡 园援 苑 酝 泽燥则遭蚤藻则蚤贼藻 葬泽 贼澡藻 燥泽皂燥贼蚤糟 泽贼葬遭蚤造蚤扎藻则
葬造燥灶早 憎蚤贼澡 葬 皂蚤曾贼怎则藻 燥枣 圆豫 造赠葬泽藻袁 圆豫 凿则蚤泽藻造葬泽藻袁 葬灶凿 圆豫 泽灶葬蚤造葬泽藻援 云怎则贼澡藻则皂燥则藻袁 贼澡藻 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 则葬贼藻 燥枣
晕援 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻 责则燥贼燥责造葬泽贼泽 糟燥怎造凿 葬造泽燥 皂藻藻贼 贼澡藻 则藻择怎蚤则藻皂藻灶贼泽 燥枣 泽怎遭泽藻择怎藻灶贼 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院 晕蚤皂遭赠葬 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻曰 责则燥贼燥责造葬泽贼曰 皂怎贼葬灶贼
摇 摇 空心莲子草 粤造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬 责澡蚤造燥曾藻则燥蚤凿藻泽因其具有
繁殖迅速尧适应性强等特点袁于 圆园 世纪 缘园 年代被引
入我国江苏和浙江等地作为牲畜饲料植物栽培袁随
后相继传入全国各地并引起草害袁与农作物争夺水
分尧肥料尧阳光和生长空间袁导致农作物严重减产袁同
时还会对水产尧水利尧航运尧物种资源尧生态环境等产
生极为不利的影响袁成为全国大部分省区和水域的
恶性杂草之一咱员暂 遥 目前我国对空心莲子草以化学
防治为主袁有几种除草剂如水花生净袁对防除空心莲
子草效果比较显著袁但因其残留期较长而受到限制遥
许多真菌毒素由于具有特异性生理活性和高度专化
性作用位点袁即使在很低的浓度下也能引起寄主植
物的特异性反应袁而且和传统的化学农药相比袁往往
具有化学结构新颖尧低毒尧低残留等特点袁因此成为
开发生物除草剂优先和重点考虑的对象遥 国内外近
十年来对于空心莲子草的生物防治研究也逐渐开展
了起来袁其中以对假隔链格孢菌 晕蚤皂遭赠葬 葬造贼藻则灶葬灶鄄
贼澡藻则葬藻的研究居多遥
月葬则则藻贼燥 驭 栽燥则则藻泽咱圆暂在上世纪 怨园 年代末从巴西
的空心莲子草上分离获得了 圆 个致病菌袁假隔链格
孢菌和莲子草尾孢菌 悦藻则糟燥泽责燥则葬 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻袁并发
现前者的致病力显著高于后者袁具有生物防治潜力遥
此后袁假隔链格孢菌对空心莲子草具有致病力的报
道陆续在中国咱猿暂 尧澳大利亚咱源暂以及美国咱缘暂等国家出
现遥 田间试验表明袁假隔链格孢菌 杂云员怨猿 菌株防除
空心莲子草的最适合浓度配比为 员颐 缘 耀 员 颐 员园袁其原
液 苑 凿后对空心莲子草的鲜重防效高于化学除草剂
氯氟吡氧乙酸咱远暂 遥 在自然界中袁许多致病真菌尤其
是腐生性真菌都能够产生毒素袁毒素对于致病真菌
成功侵染寄主是必需的或者是兼容性的因子咱苑暂 遥
在对假隔链格孢菌分泌的毒素进行分离尧纯化以及
鉴定后袁发现该物质为 圆鄄乙酰基鄄猿袁源鄄二羟基鄄缘鄄甲氧
基苯乙酸渊增怎造糟怎造蚤糟 葬糟蚤凿冤咱愿暂 遥 该物质是非寄主专一
性毒素袁能够引起空心莲子草根尖组织防御酶活性
发生变化咱怨暂 遥 用不同浓度的假隔链格孢菌毒素处
理空心莲子草叶片和根尖袁发现叶绿体和线粒体可
能是莲子草假隔链格孢毒素作用的初始位点咱员园暂 遥
此外袁还发现假隔链格孢菌在入侵空心莲子草时会
导致植物细胞内活性氧的迅速上升袁从而对叶片造
成严重破坏咱员员暂 遥
综上所述袁目前国内外主要侧重于假隔链格孢
菌对空心莲子草防治的生理生化研究袁但在其毒素
合成路径的分子作用机制方面还未开展相关工作遥
而不同变异菌株的致病性尧产毒能力和遗传稳定性
往往存在较大差异袁会给未来生产带来障碍遥 因此袁
研究致病菌产毒的相关基因尧毒素合成的分子调控
机制和致病机理袁将会为这些毒素开发成为新的生
物除草剂提供坚实的理论依据和技术支撑遥 近年
来袁分子遗传学研究极大地推动了对植物致病真菌
产毒机制和侵染相关基因的认识遥 利用现代分子生
物学技术产生新的基因敲除突变体和缺毒突变体袁
研究毒素生物合成的相关基因尧以及哪些基因的改
变有助于提高病原体的致病性袁对于揭示真菌的致
病机理是至关重要的咱员圆暂 遥 而若想获得真菌产毒突
变体袁首先需要获得具有再生能力的原生质体袁它是
遗传操作的基础遥
因此袁针对不同真菌袁建立合适的原生质体提取
体系对后继试验至关重要遥 目前国内已经探索出多
个真菌的原生质体提取体系袁如禾谷镰孢菌 云怎泽葬则蚤鄄
怎皂 早则葬皂蚤灶藻葬则怎皂咱员猿暂 尧黑曲霉 粤泽责藻则早蚤造造怎泽 灶蚤早藻则咱员源暂和刺
孢吸水链霉菌 杂贼则藻责贼燥皂赠糟藻泽 澡赠早则燥泽责蚤灶燥糟怎泽 等咱员缘暂 遥 但
截至目前袁还没有假隔链格孢菌原生质体提取方法
的报道遥 本研究旨在建立假隔链格孢菌原生质体的
提取与再生体系袁并通过随机插入 孕耘郧 介导转化
法袁建立假隔链格孢菌产毒突变体库袁为后期探索其
毒素合成路径搭建平台遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试菌株院空心莲子草假隔链格孢菌 晕援 葬造贼藻则鄄
灶葬灶贼澡藻则葬藻 员员鄄圆 菌株由染病空心莲子草上分离鉴定
获得渊郧藻灶月葬灶噪登录号 允匝怨园缘圆缘愿冤袁本实验室保存遥
质粒院质粒 责悦月员远猿远 由美国弗吉尼亚生物信息
研究所 悦澡则蚤泽贼燥责澡藻则 月援 蕴葬憎则藻灶糟藻教授赠送遥
培养基院菌丝生长培养基院孕阅 培养基渊马铃薯
圆园园 早尧蔗糖 圆园 早袁加水定容至 员 蕴冤尧孕阅粤 培养基渊取
圆园园 皂蕴 孕阅培养基袁加入 圆援 远 早琼脂粉冤尧酵母浸出粉
胨葡萄糖渊赠藻葬泽贼 藻曾贼则葬糟贼 责藻责贼燥灶藻 凿藻曾贼则燥泽藻袁再耘孕阅冤培养
基渊员豫蛋白胨尧园援 猿豫酵母浸出物尧圆豫葡萄糖冤尧酵
母浸出葡萄糖渊 赠藻葬泽贼 藻曾贼则葬糟贼 凿藻曾贼则燥泽藻袁再耘阅冤培养基
渊园援 缘豫酵母提取物尧员豫葡萄糖冤尧原生质体再生培
养基渊园援 员豫酵母提取物尧员酝 蔗糖尧员豫琼脂尧园援 员豫
蛋白胨冤遥
试剂院蜗牛酶渊 泽灶葬蚤造葬泽藻冤袁购自上海经科化学科
技有限公司曰崩溃酶 渊 凿则蚤泽藻造葬泽藻冤尧裂解酶 渊 造赠葬泽藻冤尧
纤维素酶 渊 糟藻造造怎造葬泽藻冤袁购自 杂蚤早皂葬 公司曰稳渗剂院
晕葬悦造尧运悦造尧山梨醇尧蔗糖尧酝早杂韵源 各 园援 苑 酝遥 其它试
剂院杂栽悦渊员 酝 泽燥则遭蚤贼燥造尧员园 皂酝 悦葬悦造圆尧员园 皂酝 栽则蚤泽鄄悦造袁责匀苑援 缘冤尧源园豫 孕耘郧源园园园渊用 杂栽悦配制冤均为国产分析
纯袁购自合肥欣乐生物有限公司曰栽葬噪葬则葬 孕则蚤皂藻杂栽粤砸
酝葬载 阅晕粤 孕燥造赠皂藻则葬泽藻袁购自宝生物工程渊大连冤有限
公司遥
圆缘员 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
仪器院孕悦砸仪 月陨韵鄄砸粤阅 杂员园园园袁购自深圳市宇德
立生物科技有限公司曰凝胶成像系统 栽葬灶燥灶鄄猿缘园园袁购
自上海天能科技有限公司遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 原生质体的制备与再生方法
参考 栽葬灶葬噪葬等咱员远暂和 悦澡燥 等咱员苑暂方法袁并做适当
修改遥 菌丝培养 圆 凿后袁用装有 圆 层无菌擦镜纸的漏
斗过滤袁收集菌丝袁用无菌水冲洗后再用稳渗剂冲洗
员 次曰取 园援 圆 早 湿菌丝加入 员园 皂蕴 酶组合液中裂解袁
酶解若干小时曰将酶解好含原生质体的酶解液用 猿
层无菌擦镜纸过滤后袁用稳渗剂冲洗 员 次收集于
缘园 皂蕴离心管中曰室温 猿 园园园 则 辕 皂蚤灶 离心 员园 皂蚤灶袁弃上
清袁加入 员园 皂蕴 杂栽悦 溶液重新悬浮和离心 员 耀 圆 次袁
最后用 杂栽悦 溶液悬浮原生质体至所需浓度遥 将酶
切渊 匀蚤灶凿陨陨陨冤后含有潮霉素基因的质粒 责悦月员远猿远
员园 滋蕴袁加入到 愿园 滋蕴原生质体悬浮液中袁轻轻混匀袁
冰浴 猿园 皂蚤灶曰分两次加入 源园豫 孕耘郧源园园园袁轻轻混匀袁
室温下静置 圆园 皂蚤灶曰将 员 皂蕴 的转化混合物加入
员园 皂蕴再生液体培养基中袁圆愿 益 员园园 则 辕 皂蚤灶 过夜培
养袁圆源 澡 后加入含潮霉素的固体再生培养基袁倒板
圆远 益倒置培养袁猿 凿后获得再生菌株遥
员援 圆援 圆 不同条件对原生质体的制备与再生的影响
菌丝培养基及菌龄院取 孕阅粤培养基上生长旺盛
的菌落边缘菌丝袁接种于 猿 种液体菌丝生长培养基
中袁圆远 益尧员园园 则 辕 皂蚤灶分别培养 员 耀 圆 凿遥
不同酶系统院采用以下两种酶系统院淤员豫 咱蜗
牛酶渊杂冤 垣裂解酶渊蕴冤 垣崩溃酶渊阅冤暂曰于圆豫 咱蜗牛
酶渊杂冤 垣裂解酶渊蕴冤 垣崩溃酶渊阅冤暂分别制备原生质
体袁其它操作步骤同上遥
不同酶解时间院于酶溶液中 猿园益分别酶解 员尧圆尧
猿尧源 澡袁其它操作步骤同上遥
不同稳渗剂院由于不同菌的适合稳渗剂不同袁用
浓度均为 园援 苑酝的 晕葬悦造尧运悦造尧山梨醇尧蔗糖和酝早杂韵源
分别配制酶溶液袁再用 员远 伊 圆缘 格血球计数板分别记
录上述 缘 种稳渗剂对 圆豫的崩溃酶 垣蜗牛酶 垣裂解
酶组合酶解 员 澡时原生质体数量以及再生数量的影
响遥 洗涤菌丝时所用的稳渗剂与酶解时的稳渗剂保
持一致袁收集到的原生质体也悬浮在相同的稳渗液
中袁其它操作同上遥
员援 圆援 猿 不同潮霉素浓度对突变体筛选的影响
将再生的原生质体分别接入到含有 圆缘尧缘园尧苑缘尧
员园园尧员圆缘尧员缘园 滋早 辕 皂蕴 潮霉素固体培养基中袁观察突
变体的再生情况遥
员援 圆援 源 插入突变体的鉴定
选择野生型菌株和若干个在含 圆缘 滋早 辕 皂蕴 潮霉
素培养基上稳定生长的突变株袁分别提取 阅晕粤袁使
用 栽葬噪葬则葬 孕则蚤皂藻杂栽粤砸 酝葬载 阅晕粤 孕燥造赠皂藻则葬泽藻 采用如
下反应体系进行 孕悦砸扩增渊圆缘 滋蕴反应体系冤院孕则蚤皂鄄
藻杂栽粤砸 酝葬载 孕则藻皂蚤曾 员圆援 缘 滋蕴尧酝员猿云 员滋蕴尧酝员猿砸 员滋蕴尧
阅晕粤 圆园 灶早尧无菌水 怨援 缘 滋蕴袁进行如下反应院怨愿 益
员园 泽藻糟曰缘缘 益 缘 泽藻糟曰苑圆益 缘 泽藻糟曰猿缘 个循环袁之后在 员豫
凝胶电泳上检测目的片段大小遥 其中 酝员猿云 和
酝员猿砸为扩增质粒 责悦月员远猿远 中潮霉素基因的引物袁
序列分别为 缘忆鄄郧栽粤粤粤粤悦郧粤悦郧郧悦悦粤郧栽鄄猿忆和 酝员猿砸
缘忆鄄粤粤粤悦粤郧悦栽粤栽郧粤悦悦粤栽郧鄄猿忆遥
圆 结果与分析
圆援 员 菌丝培养基及菌龄对原生质体制备的影响
试验中发现袁用 孕阅培养基培养菌丝效果不好袁
菌丝生长量在即使培养 圆 凿后仍略显不足曰猿 种培养
基 圆远益 员园园 则 辕 皂蚤灶培养 员 凿袁所培养的菌丝在裂解 缘 澡
后袁用显微镜观察原生质体量仍不足袁因此后期以
再耘孕阅培养基和 再耘阅 培养基袁在 圆愿 益 员园园 则 辕 皂蚤灶 条
件下袁培养 圆 凿获得的菌丝为研究材料遥
圆援 圆 酶系统对原生质体制备的影响
当使用 员豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤酶系统时袁在 再耘孕阅 培
养基中最多可获得 圆援 远 伊 员园苑 个原生质体渊源 澡冤袁在
再耘阅培养基中则最多可获得 园援 远 伊 员园苑 个原生质体
渊源 澡冤曰而当使用 圆豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤酶系统时袁在 再耘孕阅
培养基中最多可获得 缘 伊 员园苑 个原生质体渊猿 澡冤袁在
再耘阅培养基中则最多可获得 员援 远 伊 员园苑 个原生质体
渊猿 澡冤渊图 员冤遥 因此袁选用 圆豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤酶解体系
可以快速获得符合转化要求数量的原生质体遥
圆援 猿 酶解时间对原生质体制备的影响
由于 猿 种酶的酶解适宜温度均为 猿园 益袁因此本
试验采用 猿园 益作为酶解温度遥 酶解 员 澡 后袁菌丝无
明显变化曰酶解 圆 澡 后袁再耘孕阅员 菌体已部分软化袁
再耘孕阅圆 菌体已明显软化尧菌丝已断裂袁而 再耘阅员 辕
再耘阅圆 菌体无明显软化曰酶解 猿 澡 后袁再耘孕阅员 菌体已
完全软化但还有明显菌丝袁再耘孕阅圆 菌体已完全松
散尧菌丝消化完全袁而 再耘阅员 辕 再耘阅圆 仅菌体表面软化
渊图 员冤遥 由于原生质体在酶解液中时间越长袁越容
易受到损伤袁会影响其再生率袁因此选用 再耘孕阅培养
基中培养的菌丝体袁在 圆豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤酶解体系中
酶解 猿 澡 获得的原生质体遥 这些原生质体大小均
猿缘员圆 期 周凤艳等院空心莲子草致病菌假隔链格孢菌原生质体的制备与再生
一袁数量符合要求袁适于后期转化遥
圆援 源 稳渗剂对原生质体制备和再生的影响
镜检结果表明袁园援 苑 酝 晕葬悦造 所获得的原生质体
数量最多袁达 员援 圆 伊 员园苑 个遥 但是原生质体的再生结
果表明袁园援 苑 酝 山梨醇稳渗剂获得的再生原生质体
数量 园援 怨 伊 员园苑 个高于前者 园援 愿 伊 员园苑 个渊图 圆冤遥 为
了后期获得较多的转化子袁因而选用 园援 苑 酝 山梨醇
作为稳渗剂遥
图 员 不同酶体系和酶解时间对原生质体制备的影响
云蚤早援 员 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 藻灶扎赠皂藻 泽赠泽贼藻皂泽 葬灶凿 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 燥灶 责则藻责葬则葬贼蚤燥灶 燥枣 责则燥贼燥责造葬泽贼泽
摇 摇 再耘孕阅员院再耘孕阅培养基 员豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤曰再耘孕阅圆院再耘孕阅培养基 圆豫渊杂 垣 蕴 垣 阅冤曰再耘阅员院再耘阅培养基 员豫渊杂 垣 蕴 垣 阅冤曰再耘阅 圆院再耘阅培养基
圆豫渊杂 垣 蕴 垣 阅冤遥 再耘孕阅员院 再耘孕阅 皂藻凿蚤怎皂 员豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤曰 再耘孕阅圆院 再耘孕阅 皂藻凿蚤怎皂 圆豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤曰 再耘阅员院 再耘阅 皂藻凿蚤怎皂 员豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤曰
再耘阅圆院 再耘阅 皂藻凿蚤怎皂 圆豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤援
图 圆 不同稳渗剂对原生质体提取及再生的影响
云蚤早援 圆 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 燥泽皂燥贼蚤糟 泽贼葬遭蚤造蚤扎藻则泽 燥灶 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 葬灶凿 则藻早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 责则燥贼燥责造葬泽贼泽
圆援 缘 潮霉素浓度对突变体筛选的影响
为了解假隔链格孢菌原生质体对潮霉素的耐受
性袁将获得的再生原生质体和野生型菌株分别转接
入含有不同潮霉素浓度的 孕阅粤培养基上袁发现野生
型菌株在含 圆缘 滋早 辕 皂蕴 潮霉素的培养基上无法正常
生长袁而突变体在含 员缘园 滋早 辕 皂蕴 潮霉素培养基上仍
可正常生长遥
圆援 远 突变体的分子检测
孕悦砸检测结果渊图 猿冤表明袁野生型菌株中无目
的片段产生袁而随机挑选的 猿 株突变体菌株中可以
克隆得到含有潮霉素基因的片段 员远缘园 遭责袁将阳性克
隆子送生工生物工程渊上海冤股份有限公司测序袁经
晕悦月陨比对袁结果与潮霉素基因 员 园愿园 遭责 同源性达
怨怨豫 袁表明转化成功遥
猿 讨论
原生质体的产生与菌丝的多少尧菌龄的大小有
关袁一般来说从幼嫩菌丝中所获得的原生质体产量
较高尧质量较好遥 但是随着菌龄的增大袁原生质体获
得率和质量明显降低袁超过一定菌龄的菌丝体中就
很难再分离出原生质体咱员愿暂 遥 因此袁必须以合适菌龄
的菌丝体进行原生质体提取遥 一般认为指数生长期
源缘员 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
图 猿 突变体和野生型菌株潮霉素基因 孕悦砸检测结果
云蚤早援 猿 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 澡赠早则燥皂赠糟蚤灶 早藻灶藻 燥枣 贼澡藻 皂怎贼葬灶贼
葬灶凿 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 泽贼则葬蚤灶泽 遭赠 孕悦砸
摇 摇 酝院酝葬则噪藻则曰栽院突变体曰宰院野生型遥 酝院 酝葬则噪藻则曰 栽院 皂怎贼葬灶贼
泽贼则葬蚤灶曰 宰院 憎蚤造凿 贼赠责藻 泽贼则葬蚤灶援
后期的菌丝是比较适合制备原生质体的咱员怨暂 遥 由于
不同真菌的指数生长期不同袁因而不同真菌制备原
生质体的最佳菌龄各不相同遥 且使用不同培养基袁
也有可能会造成菌丝培养时间的不同咱圆园暂 遥 本试验
也发现假格链格孢菌以 再耘孕阅 或 再耘阅 培养基培养
圆 凿产生的菌丝体均适合提取原生质体袁且前者的提
取量大于后者遥
由于真菌细胞壁是由几丁质尧半纤维素等多种
成分构成袁单一酶只能降解其中一种或几种成分袁获
得的原生质体量少袁且大小易不均匀遥 而崩溃酶尧裂
解酶和蜗牛酶都是复合酶袁在链格孢菌原生质体提
取试验中发现袁这 猿 种酶的组合可以获得理想的原
生质体咱圆员暂 遥 本试验前期研究也发现袁单独使用这 猿
种酶中的 员 种或 圆 种酶袁所获得的原生质体数量均
达不到要求渊未列数据冤遥 大量试验结果表明袁真菌
原生质体的数量和形态是影响转化结果的关键因
素袁即使酶体系适合袁若反应浓度较低袁也无法获得
足够数量和均一形态的原生质体袁影响转化成功率曰
若反应浓度较高袁则会在短时间内伤害释放出的原
生质体袁影响其再生能力咱员远暂 遥 造成这种情况的原因
有两种袁一是由于酶液纯度较低袁其中往往含有一些
对原生质体有害的酶类渊如过氧化物酶尧核糖核酸
酶等冤袁随着酶液浓度增加袁这些有害酶类浓度也随
之增加袁进而影响了原生质体的活性曰二是由于酶液
浓度过大袁易使菌丝体发生凝集而难以原生质体
化咱圆圆暂 遥 本试验条件下袁选用 圆豫 渊杂 垣 蕴 垣 阅冤酶体系
在 猿园 益酶解 猿 澡袁即可获得足够数量的原生质体遥
稳渗剂有助于维持原生质体形态的稳定袁对其
形成和再生都有重要影响遥 由于不同真菌的菌丝体
所处的生理状态不同袁对稳渗剂的敏感性也不同遥
研究表明袁有的稳渗剂虽然可使原生质体产量达到
最高袁却不一定最有助于原生质体再生遥 如 园援 远 酝
酝早杂韵源窑苑匀圆韵作为稳渗剂袁可使丝状真菌 粤蕴员愿 的原
生质体产量达到最高袁但最适合其原生质体再生的
稳渗剂却是 园援 远 酝 蔗糖咱圆猿暂 遥 在本研究中也出现了
类似的情况袁假格链格孢菌在 园援 苑 酝 晕葬悦造 作为稳渗
剂的条件下所获得的原生质体产量最高袁但却是以
园援 苑 酝山梨醇为稳渗剂的再生率最高遥
由于研究未知基因功能最常用也是最直接的方
法就是将目的基因在组织中敲除袁然后观察缺失了
目的基因的材料所发生的变化袁从而推测出该基因
的功能遥 悦澡燥等咱员苑暂以质粒 责悦月员远猿远 为骨架袁发现以
线性小元件结构对链格孢菌原生质体进行基因敲除
的成功率袁相比其它方法提高了 源园豫 袁是进行链格
孢菌基因敲除试验的有效方法遥 而本研究中同时也
使用了含有潮霉素基因的质粒 责悦月员远猿远袁后期将可
以通过比较突变体表型的变化袁如致病力的强弱尧产
孢能力的改变等袁从而确定目的菌株遥 且由于已知
该质粒序列袁也为后继插入缺失基因的分离和基因
敲除验证简化了步骤遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 徐胜袁张新全袁李建龙援 扁穗牛鞭草人工草地中空心莲子草
杂草防除效果研究援 中国草地袁 圆园园猿袁 圆缘 渊圆冤院 猿源 原 猿苑
咱圆暂 月葬则则藻贼燥 砸 宰袁 栽燥则则藻泽 粤 晕 蕴援 晕蚤皂遭赠葬 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻 葬灶凿 悦藻则糟燥泽鄄
责燥则葬 葬造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬藻院 贼憎燥 灶藻憎 则藻糟燥则凿泽 燥枣 枣怎灶早葬造 责葬贼澡燥早藻灶泽 燥灶 粤造鄄
贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬 责澡蚤造燥曾藻则燥蚤凿藻泽 渊 葬造造蚤早葬贼燥则 憎藻藻凿冤 蚤灶 月则葬扎蚤造援 粤怎泽贼则葬造葬鄄
泽蚤葬灶 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠袁 员怨怨怨袁 圆愿渊圆冤院 员园猿 原 员园苑
咱猿暂 向梅梅援 广东农田杂草上的病原真菌援 华南农业大学学报袁
圆园园圆袁 圆猿渊员冤院 源员 原 源源
咱源暂 郧蚤造遭藻则贼 砸 蕴袁 粤怎造凿 月 粤袁 匀藻灶灶藻糟噪藻 月 砸援 蕴藻葬枣 葬灶凿 泽贼藻皂 泽责燥贼 燥枣
粤造贼藻则灶葬灶贼澡藻则葬 责澡蚤造燥曾藻则燥蚤凿藻泽 渊葬造造蚤早葬贼燥则 憎藻藻凿冤 蚤灶 粤怎泽贼则葬造蚤葬 糟葬怎泽藻凿
遭赠 晕蚤皂遭赠葬 泽责援 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园园缘袁 缘源渊源冤院 缘愿缘
咱缘暂 孕燥皂藻造造葬 粤 宰 灾袁 月葬则则藻贼燥 砸 宰袁 悦澡葬则怎凿葬贼贼葬灶 砸援 晕蚤皂遭赠葬 葬造贼藻则鄄
灶葬灶贼澡藻则葬藻 葬 责燥贼藻灶贼蚤葬造 遭蚤燥糟燥灶贼则燥造 葬早藻灶贼 枣燥则 葬造造蚤早葬贼燥则憎藻藻凿袁 粤造贼藻则鄄
灶葬灶贼澡藻则葬 责澡蚤造燥曾藻则燥蚤凿藻泽援 月蚤燥悦燥灶贼则燥造袁 圆园园苑袁 缘圆渊圆冤院 圆苑员 原 圆愿愿
咱远暂 聂海峰袁 陈志谊袁 刘永锋袁 等援 假隔链格孢渊晕蚤皂遭赠葬 葬造贼藻则鄄
灶葬灶贼澡藻则葬藻冤杂云鄄员怨猿防除空心莲子草田间高效使用技术研究援
植物保护袁 圆园园愿袁 猿源渊猿冤院 员园怨 原 员员猿
咱苑暂 酝葬则噪澡葬皂 允 耘袁 匀蚤造造藻 允援 匀燥泽贼鄄泽藻造藻糟贼蚤增藻 贼燥曾蚤灶泽 葬泽 葬早藻灶贼泽 燥枣 糟藻造造
凿藻葬贼澡 蚤灶 责造葬灶贼鄄枣怎灶早怎泽 蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠袁
圆园园员袁 圆院 圆圆怨 原 圆猿怨
咱愿暂 周遗品袁 向梅梅袁 姜子德袁 等援 莲子草假隔链格孢毒素的分
离纯化与结构鉴定援 高等学校化学学报袁 圆园园远袁 圆苑 渊愿冤院
员源愿缘 原 员源愿苑
缘缘员圆 期 周凤艳等院空心莲子草致病菌假隔链格孢菌原生质体的制备与再生
咱怨暂 范兰兰袁姜子德袁向梅梅援 莲子草假隔链格孢毒素对空心莲
子草根尖组织防御酶活性的影响援 华南农业大学学报袁
圆园员园袁 猿员渊猿冤院 圆愿 原 猿员
咱员园暂 张云霞袁 范兰兰袁 施祖荣袁 等援 莲子草假隔链格孢毒素对
空心莲子草叶片和根尖组织超微结构的影响援 华中农业大
学学报袁 圆园员员袁 猿园渊员冤院 愿源 原 愿愿
咱员员暂 聂亚锋袁 刘长河袁 陈志谊袁 等援 莲子草假隔链格孢对空心
莲子草活性氧代谢的影响援 植物保护学报袁 圆园员猿袁 源园渊猿冤院
圆苑怨 原 圆愿源
咱员圆暂 酝觟遭蚤怎泽 晕袁 匀藻则贼憎藻糟噪 悦援 云怎灶早葬造 责澡赠贼燥贼燥曾蚤灶泽 葬泽 皂藻凿蚤葬贼燥则泽 燥枣
增蚤则怎造藻灶糟藻援 悦怎则则藻灶贼 韵责蚤灶蚤燥灶 蚤灶 孕造葬灶贼 月蚤燥造燥早赠袁 圆园园怨袁 员圆院 猿怨园 原
猿怨愿
咱员猿暂 林玲袁 史建荣袁 陈怀谷袁 等援 禾谷镰孢菌原生质体的制备
和再生研究援 南京师大学报袁 圆园园员袁 圆源渊员冤院 愿愿 原 怨员
咱员源暂 姚婷婷袁 王正祥援 黑曲霉原生质体的制备尧再生及转化条
件援 食品与生物技术学报袁 圆园园远袁 圆缘渊源冤院 员员远 原 员圆园
咱员缘暂 丁成翔袁 侯太平袁 向晶晶袁 等援 刺孢吸水链霉菌与淡紫灰
链霉菌原生质体制备条件研究援 四川大学学报袁 圆园园苑袁 源源
渊猿冤院 远苑怨 原 远愿圆
咱员远暂 栽葬灶葬噪葬 粤袁 杂澡蚤燥贼葬灶蚤 匀袁 再葬皂葬皂燥贼燥 酝袁 藻贼 葬造援 陨灶泽藻则贼蚤燥灶葬造 皂怎贼葬鄄
早藻灶藻泽蚤泽 葬灶凿 糟造燥灶蚤灶早 燥枣 贼澡藻 早藻灶藻泽 则藻择怎蚤则藻凿 枣燥则 遭蚤燥泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 燥枣
贼澡藻 澡燥泽贼鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟 粤运鄄贼燥曾蚤灶 蚤灶 贼澡藻 允葬责葬灶藻泽藻 责藻葬则 责葬贼澡燥贼赠责藻 燥枣
粤造贼藻则灶葬则蚤葬 葬造贼藻则灶葬贼葬援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼鄄酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁
员怨怨怨袁 员圆渊愿冤院 远怨员 原 苑园圆
咱员苑暂 悦澡燥 再 砸袁 阅葬增蚤泽 允 宰袁 运蚤皂 运 匀袁 藻贼 葬造援 粤 澡蚤早澡 贼澡则燥怎早澡责怎贼 贼葬则鄄
早藻贼藻凿 早藻灶藻 凿蚤泽则怎责贼蚤燥灶 皂藻贼澡燥凿 枣燥则 粤造贼藻则灶葬则蚤葬 遭则葬泽泽蚤糟蚤糟燥造葬 枣怎灶糟鄄
贼蚤燥灶葬造 早藻灶燥皂蚤糟泽 怎泽蚤灶早 造蚤灶藻葬则 皂蚤灶蚤皂葬造 藻造藻皂藻灶贼 渊 蕴酝耘冤 糟燥灶鄄
泽贼则怎糟贼泽援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼鄄酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 圆园园远袁 员怨渊员冤院
苑 原 员缘
咱员愿暂 张志光袁 李东屏袁 方芳袁 等援 丝状真菌原生质体技术研
究要要要培养条件对原生质体的影响援 湖南师范大学学报袁
员怨怨愿袁 圆员渊员冤院 远园 原 远缘
咱员怨暂 杨迎青袁 李明海袁 杨媚袁 等援 水稻纹枯病菌原生质体制备
与再生条件的优化援 华中农业大学学报袁 圆园员园袁 圆怨渊缘冤院
缘源远 原 缘缘员
咱圆园暂 秦蔚袁 李成云袁 杨根华袁 等援 水稻纹枯病菌渊砸澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬
泽燥造葬灶蚤 粤郧鄄员 陨粤冤原生质体的制备和再生援 云南农业大学学
报袁 圆园员猿袁 圆愿渊圆冤院 圆苑园 原 圆苑猿
咱圆员暂 伏建国袁 朱云枝袁 强胜援 链格孢菌原生质体的制备与限制
性内切酶介导整合渊砸耘酝陨冤转化的致病性诱变援 菌物学报袁
圆园园缘袁 圆源渊猿冤院 源园苑 原 源员猿
咱圆圆暂 李巍袁 吕圭源袁 胡伟莲袁 等援 月造葬噪藻泽造藻葬 贼则蚤泽责燥则葬 匀员要要要原生
质体制备与再生条件研究援 浙江科技学院学报袁 圆园园怨袁 圆员
渊员冤院 圆猿 原 猿员
咱圆猿暂 卢明锋袁 张月杰援 丝状真菌 粤蕴员愿 的原生质体制备和再生
条件的优化援 生物技术袁 圆园员圆袁 圆圆渊猿冤院 愿远 原 怨园
渊责任编辑院高摇 峰冤
远缘员 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷