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Colonization trends of endophytic bacteria in cotton and their biological control effect on cotton Verticillium wilt

植物内生细菌在棉花体内的定殖动态及对棉花黄萎病的生物防治效果



全 文 :植物保护学报 Journal of Plant Protection, 2016, 43(2): 207 - 214 DOI: 10􀆰 13802 / j. cnki. zwbhxb. 2016􀆰 02􀆰 005
基金项目:江苏省自然科学基金(BK2012848)
∗通讯作者(Author for correspondence), E⁃mail: yanshuzhen@ njnu. edu. cn
收稿日期: 2014 - 10 - 28
植物内生细菌在棉花体内的定殖动态及
对棉花黄萎病的生物防治效果
王  娜  陶  伟  陈双林  闫淑珍∗
(南京师范大学生命科学学院, 江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,
江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心, 南京 210046)
摘要: 为明确植物内生细菌在棉花体内的定殖规律及对棉花黄萎病防治效果的影响,采用对峙培
养法筛选对大丽轮枝菌 Verticillium dahliae Kleb.抑菌活性强的植物内生细菌,通过形态及生理生化
特征并结合 16S rDNA和 gyrB基因分析鉴定菌株;利用抗生素标记法及盆栽试验研究其在棉花体
内的定殖动态及对棉花黄萎病的防治效果。 结果表明:共筛选到 3 株对大丽轮枝菌具有强抑菌活
性的菌株 SZ5、DP10 和 CCM9,其中 SZ5 为蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus,定殖在棉花根部、茎部和叶
部,DP10 和 CCM9 为枯草芽胞杆菌 B. subtilis,定殖在棉花根部和茎部,3 株菌在棉花根部的定殖数
量均在 103CFU / g以上;棉花苗沾根分别接入 3 株内生细菌 10 d后再接种大丽轮枝菌孢子悬浮液,
对棉花黄萎病的防治效果达 79􀆰 52% ~89􀆰 79% ,而 3 株内生细菌沾根接种后立即移栽到含有大丽
轮枝菌的土壤中对棉花黄萎病的防治效果为 23􀆰 77% ~ 36􀆰 03% 。 表明不同内生细菌菌株在棉花
体内的定殖规律不同;且在棉苗中定殖一定数量后,才能对棉花黄萎病产生较高的防治效果。
关键词: 内生细菌; 棉花黄萎病; 定殖动态; 生物防治
Colonization trends of endophytic bacteria in cotton and their biological
control effect on cotton Verticillium wilt
Wang Na  Tao Wei  Chen Shuanglin  Yan Shuzhen∗
(Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics; Jiangsu Provincial Engineering and Technology Research
Center for Microbiology Research; College of Life Sciences, Nanjing Normal University,
Nanjing 210046, Jiangsu Province, China)
Abstract: In order to study the colonization of endophytic bacteria and their control effect on cotton
Verticillium wilt, the endophytic bacterial strains were screened based on their efficiency of growth
inhibition against Verticillium dahliae Kleb. by using agar disk diffusion, and the isolates were identified
by using morphological and physiological tests combined with 16S rDNA and gyrB⁃based molecular
analysis. The colonization dynamics and the control effect on cotton Verticillium wilt of the isolates were
studied with the label of streptomycin and pot trials, respectively. The results showed that strains SZ5,
DP10 and CCM9 had a notable antagonistic effect on the pathogens of V. dahliae. Strain SZ5 was
identified as Bacillus cereus, and it could colonize the root, stem and leaves of the cotton plants. Strains
DP10 and CCM9 were B. subtilis, and they could colonize the root and stem of the cotton plants. The
quantity of colonization of the three strains in cotton roots were above 103 CFU / g. Inoculation with V.
dahliae spore suspension 10 d after inoculation with endophytic bacterial strains in sterile soils showed
that the control effect against cotton Verticillium wilt was 79􀆰 52% - 89􀆰 79% . However, inoculation of
the three endophytic bacteria strains into soils containing V. dahliae spores had a control effect against
cotton Verticillium wilt of approximately 23􀆰 77% -36􀆰 03% . Different strains of endophytic bacteria had
different colonization patterns in cotton, and colonizing a certain quantity of endophytic bacteria in cotton
seedlings could provide greater control against cotton Verticillium wilt.
Key words: endophytic bacterium; cotton Verticillium wilt; colonization dynamics; biological control
    棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌 Verticillium
dahliae Kleb. 引起的一种土传病害,是导致棉花减
产的主要病害,广泛分布于世界各产棉国。 由于该
病是土壤和种子传播的维管束病害,发病范围广且
几率高,流行性强,防治难度较大(周兆华等,2000;
Fradin & Thomma,2006)。 目前防治该病的主要方
法是培育抗病品种、利用农业措施和使用化学药剂
等,但防治效果都不理想,特别是化学农药的使用,
不仅使病原菌产生抗药性而且对人类健康也会造成
危害(万慧等,2007;Uppal et al. ,2008)。 因此,开展
以生物防治为主导的综合防治措施研究,对该病的
防治具有重要意义(Yang et al. ,2013)。
在土传病害的生物防治研究中,通常采用植物
根际土壤微生物进行,如Wahla et al. (2012)从红辣
椒根际分离出 2 株绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa
菌株 VP1 和 VP2,不仅对辣椒有促生作用还可以控
制辣椒根结线虫的生长;Xue et al. (2013)从农作物
根际分离出 4 株链霉属放线菌 ZY⁃153、B⁃49、X⁃4 和
Z⁃13,在温室试验中对棉花黄萎病的防治效果为
18􀆰 7% ~65􀆰 8% 。 由于田间环境和植物体微生态环
境存在很多因子会影响根际生防微生物的防治作用
(Darrah,1991),所以用根际微生物进行生物防治的
最大问题之一就是效果不稳定(林玲等,2008)。
植物内生细菌是指生活在健康植物各种组织和
器官的细胞间隙或细胞内,并与宿主植物建立起和
谐关系的一类微生物(Strobel et al. ,1993)。 因其定
殖在植物体内,不易受外界环境影响的独特生活方
式而被广泛关注,如傅正擎等(1999)从棉花体内分
离出的内生菌 73a 对棉花黄萎病的防治效果在
70%以上;Erdogan & Benlioglu(2010)从棉花和杂草
根际分离出的 4 株荧光假单胞菌 Pseudomonas fluo⁃
rescens菌株 FP22、FP23、FP30 和 FP35 在大田条件
下均可使棉花发病率降低到 39􀆰 2% ~ 50􀆰 9% ;龚明
福等(2011)从苦豆子根瘤中分离出的内生细菌
KDRE12 和 KDRE41 对盆栽棉花枯萎病的平均防治
效果分别为 67􀆰 11%和 72􀆰 65% 。 表明内生细菌在
生物防治方面具有潜在的应用价值,因此本试验从
多种植物体内分离出内生细菌,在确认菌株对棉花
黄萎病菌具有拮抗活性的基础上,研究这些菌株在
棉花体内的定殖动态及其对棉花黄萎病的防治效
果,旨在为更合理地应用这些生防菌株防治棉花黄
萎病提供理论依据。
1 材料与方法
1􀆰 1 材料
供试菌株及棉花:大丽轮枝菌由江苏省农业科
学院植物保护研究所林玲研究员赠送。 棉花品种为
国审棉 GK⁃70,种子购自江苏省农业科学院种子站。
试剂:提取细菌基因组试剂盒,生工生物工程
(上海)股份有限公司;AxyPrep DNA 凝胶回收试剂
盒,爱思进生物技术(杭州)有限公司;2 × Taq PCR
Master Mix,诺唯赞生物科技有限公司;链霉素
(streptomycin),北京索莱宝科技有限公司。
培养基:牛肉膏蛋白胨(nutrient agar,NA)培养
基:牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、琼脂 15 ~ 20
g、H2O 1 L,pH 7􀆰 0;马铃薯葡萄糖琼脂(potato dex⁃
trose agar,PDA)培养基:马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、
琼脂 15 ~ 20 g、H2O 1 L。
仪器:HWS⁃250B恒温恒湿箱,天津市泰斯特仪
器有限公司;Nikon YS2⁃H 光学显微镜,江南光学仪
器有限公司;MINI⁃SUB CELL GT 电泳仪、Bio⁃Rad
伯乐梯度 PCR 仪,北京伯乐生命科学发展有限公
司;Tanon 2500R全自动数码凝胶图像分析系统,上
海天能科技有限公司。
1􀆰 2 方法
1􀆰 2􀆰 1 植物内生细菌的分离、筛选和鉴定
从不同种植地采集番茄、马铃薯、黄瓜、草莓和
棉花等植株的根、茎和叶,根据 Silva et al. (2012)方
法分离并培养植物内生细菌。 把大丽轮枝菌接种到
含有 100 mL PDA液体培养基的 250 mL三角瓶中,
25℃、200 r / min振荡培养 10 d,取出发酵液用 16 层
纱布过滤,用双蒸水稀释大丽轮枝菌孢子悬浮液,血
球计数板计数,使其孢子悬浮液浓度达到 108CFU /
mL。 取孢子悬浮液 200 μL 均匀涂布于 PDA 平板
802 植  物  保  护  学  报 43 卷
上,在距中心 2􀆰 5 cm处放置直径为 6 mm 的内生细
菌菌饼,每皿 8 个,每个菌株重复 3 次,设不接种菌
饼的 PDA平板为对照,置于 25℃培养箱黑暗培养,
观察抑菌圈大小,记录并转接对大丽轮枝菌有拮抗
作用的菌株。
植物内生细菌的形态观察和生理生化特征鉴定
参照东秀珠和蔡妙英(2001)方法。 植物内生细菌
16S rDNA基因序列分析鉴定:用试剂盒提取内生细
菌基因组,采用细菌通用引物 27F(5′⁃GAGAGTTT⁃
GATCCTGGCTCAG⁃3′) 和 1492R ( 5′⁃CTACGGCTAC⁃
CTTGTTACGA⁃3′),并参照 Liu et al. (2009)方法对其
片段进行 PCR扩增。 植物内生细菌 gyrB基因序列分
析鉴定:采用正向引物 UP2r(5′⁃AGCAGGGTACGGAT⁃
GTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTAT⁃3′)和反向
引物 UP1 (5′⁃GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGC⁃
NGGNGGNAARTTYGA⁃3′) ( Yamamoto & Harayama,
1995),并参照谢永丽等(2014)方法对其片段进行
PCR扩增。 所得 PCR产物割胶回收纯化后均送南京
思普金生物科技有限公司测序,将测序结果与 Gen⁃
Bank数据库中的已知序列进行 BLAST比对,用 Mega
5􀆰 0计算进化距离,以邻接法分别构建系统发育树,
通过 1 000次取样计算其 Boot strap值。
1􀆰 2􀆰 2 植物内生细菌定殖活性测定
参照 Simons et al. (1996)和蔡学清等(2003)方
法将重点菌株接种在链霉素浓度为 10 μg / mL 的
NA平板上(约 50℃时),待菌株稳定生长后,依次转
接到链霉素浓度为 20、40、60、80、100、120、150、
200、250 和 300 μg / mL 的 NA 平板上,标记终浓度
为 300 μg / mL。 根据罗明等 (2007 )和文才艺等
(2011)方法,借助于显微镜观察和平板对峙法对突
变株的生物活性进行检测,最终获得在含有链霉素
的 NA平板上能稳定生长,且菌落形态、定殖能力及
对病原菌的拮抗作用等保持不变的突变体菌株。
1􀆰 2􀆰 3 植物内生细菌在棉花体内的定殖动态测定
将 1􀆰 2􀆰 2 标记菌株接种于含 300 μg / mL链霉素
的 50 mL NA 培养基中,28℃、150 r / min 振荡培养
48 h。 发酵液 8 000 r / min 离心 15 min,去掉上清
液,用无菌蒸馏水洗涤 3 次,最后用双蒸水稀释成
108 CFU / mL的菌悬液。 选取长势一致的 6 ~ 8 叶期
棉花苗,用伤根法接入内生细菌,每株苗接种量为 5
mL,每处理 12 盆,每盆 4 株苗。 分别于接种 1、3、5、
7、10、15、20、25 和 30 d 取出棉花苗,用剪刀将其分
为根、茎、叶 3 部分,分别称重后,75%乙醇处理 5
min,无菌蒸馏水洗 5 次,1% NaClO 处理 5 min,无
菌蒸馏水洗涤 5 次,取最后 1 次冲洗的水 0􀆰 2 mL均
匀涂布于 NA平板,若没有长出细菌,就证明消毒彻
底。 将消毒的根、茎和叶分别置于无菌的组织匀浆
器中研磨,再用无菌蒸馏水梯度稀释,取 10 - 1、10 - 2
和 10 - 3稀释梯度分别涂布于含 300 μg / mL 链霉素
的 NA平板上,每梯度 3 次重复,于 28℃培养 48 h
后分别计数单菌落,统计其分布部位及数量。
1􀆰 2􀆰 4 植物内生细菌对棉花黄萎病的防治试验
试验 1:参照 1􀆰 2􀆰 1 和 1􀆰 2􀆰 3 的方法分别制备大
丽轮枝菌孢子悬浮液和内生细菌菌悬液,小心拔出
生长在灭菌土壤中长势一致的 4 ~ 6 叶期棉花苗,轻
轻抖去根上的土壤,使根完全浸没在细菌菌悬液中,
浸泡 10 min后移栽到无菌土壤中,10 d 后以伤根法
接入大丽轮枝菌孢子悬浮液,每株苗接种量为 5
mL。 设清水沾根 10 d 后接种大丽轮枝菌孢子悬浮
液和不接种大丽轮枝菌孢子悬浮液的棉花苗为对
照,室内培养,每处理 12 株苗,3 次重复,每组处理
共计 36 株苗。
试验 2:把沾根接入内生细菌的棉花苗立即移
栽到含有大丽轮枝菌孢子悬浮液的混合营养土中,
孢子含量为 106 CFU / g;设清水沾根后移栽到含大
丽轮枝菌孢子悬浮液混合土中和普通营养土中的棉
花苗为对照,其它步骤同试验 1。
2 种试验均在接种大丽轮枝菌孢子悬液 60 d时
调查植株的发病情况,依据黄萎病在棉花植株上发
病情况的分级标准进行调查(贾涛等,2007)。 0 级:
棉株健康,无病叶,生长正常;1 级:棉株发病叶片占
1 / 4 以下,变黄萎蔫;2 级:棉株发病叶片占 1 / 4 以
上,1 / 2 以下,变黄萎蔫;3 级:棉株发病叶片占 1 / 2
以上,3 / 4 以下,变黄萎蔫;4 级:棉株发病叶片占3 / 4
以上,或叶片全部脱落,棉株枯死。 并计算病情指
数、发病率、防治效果(秦娟娟等,2010)。 病情指
数 =∑(发病株数 ×代表数值) / (总株数 ×发病最
重级的代表数值) × 100;发病率 =发病株数 /总株
数 × 100% ;防治效果 = (对照区病情指数 -处理区
病情指数) /对照区病情指数 × 100% 。
1􀆰 3 数据分析
采用 SPSS 17􀆰 0 对数据进行单因素方差分析,
应用 Duncan氏新复极差法检验差异显著性。
2 结果与分析
2􀆰 1 植物内生细菌的分离、筛选和鉴定
从植物体内共分离出 211 株内生细菌,从中筛
选到对大丽轮枝菌抑菌直径大于 2􀆰 9 cm 的 3 株内
9022 期 王  娜等: 植物内生细菌在棉花体内的定殖动态及对棉花黄萎病的生物防治效果
生细菌 CCM9、DP10 和 SZ5,通过 PCR 扩增得到其
16S rDNA和 gyrB 基因序列长度分别为 1􀆰 5 kb 和
1􀆰 1 kb左右,将序列检测后提交至 GenBank,获得登
录号分别是 HQ536000、 HQ108183 和 HQ718411。
在 NCBI数据库中进行 BLAST 比对,发现 DP10 和
CCM9 菌株的16S rDNA和 gyrB 基因序列与枯草芽
胞杆菌 Bacillus subtilis同源性达到 99% ,SZ5 菌株的
16S rDNA和 gyrB基因序列与蜡样芽胞杆菌 B. cere⁃
us和苏云金芽胞杆菌 B. thuringiensis 同源性达到
99% ,根据 gyrB 基因序列构建的系统发育树显示
SZ5 菌株和蜡样芽胞杆菌 B. cereus 聚为一支(图
1 ~ 2)。3 株菌的形态特征和生理生化特征表明,菌
株 CCM9 和 DP10 菌落均为圆形,表面湿润凸起,吲
哚反应呈阴性;菌株 SZ5 形成淡黄色和乳白色稍有
光泽的圆形菌落(似蜡),边缘不规则,表面平滑,吲
哚反应呈阳性,不产生伴孢晶体(表 1)。 因此,将菌
株 DP10 和 CCM9 鉴定为枯草芽胞杆菌 B. subtilis,
SZ5 鉴定为蜡样芽胞杆菌 B. cereus。
图 1 基于 16S rDNA基因序列构建的菌株 CCM9、DP10 和 SZ5 及其相关菌株的系统发育树
Fig. 1 The phylogenetic tree of strains CCM9, DP10 and SZ5 and related strains constructed on the basis of 16S rDNA gene sequences
 
图 2 基于 gyrB基因序列构建的菌株 CCM9、DP10 和 SZ5 及其相关菌株的系统发育树
Fig. 2 The phylogenetic tree of strains CCM9, DP10 and SZ5 and related strains constructed on the basis of gyrB gene sequences
 
2􀆰 2 植物内生细菌在棉花体内的定殖动态
植物内生细菌 SZ5、 DP10 和 CCM9 菌株均可在
棉花根中稳定定殖,30 d 时其定殖量均达到 103
CFU / g以上(表 2)。 但 3 株内生细菌在棉花根、茎
和叶中的定殖量和定殖动态存在差异。 菌株 SZ5 可
在棉花的根、茎和叶中定殖,定殖量的大小顺序为根
012 植  物  保  护  学  报 43 卷
      表 1 植物内生细菌 CCM9、SZ5 和 DP10 菌株的形态特征和生理生化特性
Table 1 Morphology, physiological and biochemical characteristics of endophytic bacterial strains CCM9, SZ5 and DP10
特性 Characteristics CCM9 SZ5 DP10 特性 Characteristics CCM9 SZ5 DP10
形状 Shape
大小 Size (μm)
短杆状
Short rod
0􀆰 7 × 2􀆰 5
短杆状
Short rod
1􀆰 0 × 2􀆰 5
短杆状
Short rod
0􀆰 8 × 2􀆰 5
V. P反应 V. P reaction
V. P pH < 6
V. P pH > 7









厌氧 Anaerobic
革兰氏染色 Gram stain






硝酸盐还原 Nitrate reduction
葡萄糖产气 Gas produced from glucose






芽孢 Spore 椭圆形、近中
生 Oval and
nearly middle
柱状、近中生
Columnar and
nearly middle
柱状、近中生
Columnar and
nearly middle
柠檬酸盐利用 Utilization of citrate
丙酸盐利用 Utilization of propionate
淀粉水解 Starch hydrolysis









50℃ — — — 明胶液化 Liquefaction of gelatin + + +
5℃
7% NaCl
pH 5􀆰 7









D⁃葡萄糖 D⁃glucose
L⁃阿拉伯糖 L⁃arabinose
D⁃甘露醇 D⁃mannitol









接触酶 Catalase
吲哚反应 Indole reaction






D⁃木糖 D⁃xylose
    + : 阳性; —: 阴性。 + : Positive; —: negative.
部 > 茎部 > 叶部,最大定殖量分别为 2􀆰 04 × 106、
9􀆰 26 × 103 和 5􀆰 51 × 102 CFU / g,根部的定殖动态和
茎部一致,都具有周期性的先增加后减少的变化趋
势,而在叶部的定殖动态呈一直下降的趋势;菌株
DP10 和 CCM9 定殖在棉花的根部和茎部,根部的定
殖量大于茎部,根部的最大定殖量分别是 6􀆰 33 ×
106CFU / g和 5􀆰 25 × 104 CFU / g,茎部的最大定殖量
分别是 2􀆰 14 × 104 CFU / g和 1􀆰 88 × 102 CFU / g,根部
的定殖动态和茎部一致,呈先增加后减少的变化
趋势。
表 2 植物内生细菌 SZ5、DP10 和 CCM9 菌株在盆栽棉花苗体内的定殖动态
Table 2 Colonization dynamics of endophytic bacterial strains CCM9, SZ5 and DP10 in potted seedlings of cotton 
CFU / g
接种天数(d)
Days of inoculation
SZ5 DP10 CCM9
根 Root( ×105) 茎 Stem( ×103) 叶 Leaf( ×102) 根 Root( ×105) 茎 Stem( ×103) 根 Root( ×104) 茎 Stem( ×102)
1 0􀆰 38 ±0􀆰 10 d 0􀆰 15 ±0􀆰 04 e 5􀆰 51 ±0􀆰 60 a 0􀆰 31 ±0􀆰 06 b 0􀆰 15 ±0􀆰 07 c 0􀆰 39 ±0􀆰 11 bc 1􀆰 08 ±0􀆰 22 ab
3 20􀆰 40 ±1􀆰 32 a 9􀆰 26 ±0􀆰 32 a 5􀆰 30 ±0􀆰 54 a 2􀆰 53 ±0􀆰 15 b 0􀆰 20 ±0􀆰 04 c 5􀆰 25 ±0􀆰 53 a 1􀆰 88 ±0􀆰 24 a
5 0􀆰 50 ±0􀆰 05 d 0􀆰 60 ±0􀆰 13 de 3􀆰 99 ±0􀆰 38 b 2􀆰 68 ±0􀆰 16 b 6􀆰 54 ±0􀆰 19 b 0􀆰 91 ±0􀆰 26 bc 1􀆰 93 ±0􀆰 77 a
7 3􀆰 06 ±1􀆰 02 b 0􀆰 75 ±0􀆰 23 de 2􀆰 19 ±0􀆰 42 d 1􀆰 68 ±0􀆰 63 b 5􀆰 29 ±1􀆰 93 bc 0􀆰 95 ±0􀆰 38 b 1􀆰 47 ±0􀆰 00 ab
10 20􀆰 10 ±1􀆰 50 a 0􀆰 98 ±0􀆰 18 cd 1􀆰 55 ±0􀆰 72 c 63􀆰 27 ±8􀆰 06 a 21􀆰 37 ±4􀆰 98 a 0􀆰 71 ±0􀆰 00 bc 1􀆰 11 ±0􀆰 00 ab
15 0􀆰 35 ±0􀆰 00 d 0􀆰 12 ±0􀆰 03 e 0􀆰 35 ±0􀆰 00 d 2􀆰 65 ±1􀆰 42 b 0􀆰 59 ±0􀆰 25 c 0􀆰 17 ±0􀆰 04 bc 0􀆰 69 ±0􀆰 00 bc
20 4􀆰 21 ±0􀆰 11 b 1􀆰 47 ±0􀆰 32 bc 0􀆰 29 ±0􀆰 00 d 0􀆰 22 ±0􀆰 01 b 0􀆰 52 ±0􀆰 16 c 0􀆰 36 ±0􀆰 09 bc 0􀆰 00 ±0􀆰 00 c
25 0􀆰 54 ±0􀆰 13 d 0􀆰 47 ±0􀆰 17 de 0􀆰 00 ±0􀆰 00 d 0􀆰 18 ±0􀆰 05 b 0􀆰 13 ±0􀆰 00 c 0􀆰 22 ±0􀆰 07 bc 0􀆰 00 ±0􀆰 00 c
30 1􀆰 06 ±0􀆰 04 cd 1􀆰 63 ±0􀆰 05 b 0􀆰 00 ±0􀆰 00 d 0􀆰 06 ±0􀆰 01 b 0􀆰 08 ±0􀆰 00 c 0􀆰 11 ±0􀆰 00 c 0􀆰 00 ±0􀆰 00 c
    表中数据为平均数 ±标准误。 同列不同字母表示经 Duncan 氏新复极差法检验在 P < 0􀆰 05 水平差异显著。 Data are
mean ± SE. Different letters in the same column indicate significant difference at P < 0􀆰 05 level by Duncan’s new multiple range test.
2􀆰 3 植物内生细菌对棉花黄萎病的防治效果
棉花苗分别接入内生细菌 CCM9、SZ5 和 DP10
菌株 10 d时再接种大丽轮枝菌处理对棉花黄萎病
的防治效果分别为 89􀆰 79% 、83􀆰 96%和 79􀆰 52% ,而
棉花苗分别接入 3 株内生细菌后,立即移栽至含大
丽轮枝菌的土壤中时防治效果分别为 36􀆰 03% 、
26􀆰 02%和 23􀆰 77% (表 3)。 不同内生细菌对棉花黄
萎病的防治效果存在差异,CCM9 菌株的防治效果
最高,但与 SZ5 和 DP10 菌株差异不显著。 表明 3
株内生细菌在植物体内定殖后再接种黄萎病菌防治
效果较高。
3 讨论
Stein(2005)和 Latha et al. (2011)报道芽胞杆
菌可以产生种类多样的抑制植物病原菌生长的生物
活性因子,如细菌素、几丁质酶、抗菌多肽和酚类等。
1122 期 王  娜等: 植物内生细菌在棉花体内的定殖动态及对棉花黄萎病的生物防治效果
      表 3 植物内生细菌 CCM9、SZ5 和 DP10 菌株对棉花黄萎病的防治效果
Table 3 Control effects of the endophytic bacterial strains CCM9, SZ5 and DP10 against cotton Verticillium wilt
菌株
Strain
棉苗接入内生细菌 10 d时再接种病原菌
Pathogen inoculation 10 d after inoculation of
endophytic bacteria
棉苗接入内生细菌后立即接种病原菌
Pathogen inoculation immediately after inoculation of
endophytic bacteria
发病率 (% )
Incidence rate
病情指数
Disease index
防治效果 (% )
Control effect
发病率 (% )
Incidence rate
病情指数
Disease index
防治效果 (% )
Control effect
CCM9 13. 89 ± 2. 78 a 9. 72 ± 2. 50 b 89. 79 ± 2. 76 a 72. 22 ± 2. 78 b 61. 81 ± 3. 67 b 36. 03 ± 2. 91 b
SZ5 22. 22 ± 2. 78 bc 14. 94 ± 4. 89 b 83. 96 ± 4. 86 a 80. 56 ± 11. 11 b 71. 53 ± 9. 19 b 26. 02 ± 9. 06 b
DP10 27. 78 ± 5. 55 b 19. 44 ± 7. 25 b 79. 52 ± 7. 81 a 88. 89 ± 2. 78 ab 73. 61 ± 3. 03 b 23. 77 ± 2. 28 b
对照 CK 100. 00 ± 0. 00 a 95. 83 ± 1. 20 a 0. 00 ± 0. 00 b 100. 00 ± 0. 00 a 96. 53 ± 1. 84 a 0. 00 ± 0. 00 c
    CK: 只接种大丽轮枝菌孢子悬浮液土壤。 表中数据为平均数 ±标准误。 同列数据后不同字母表示经 Duncan 氏新复极
差法检验在 P < 0􀆰 05 水平差异显著。 CK: Only inoculated with spore suspension of V. dahliae. Data are mean ± SE. Different let⁃
ters in the same column indicate significant difference at P < 0􀆰 05 level by Duncan’s new multiple range test.
本研究筛选出的 3 株内生细菌 CCM9、DP10 和 SZ5
通过观察其形态学和生理生化特征,并结合 16S rD⁃
NA和 gyrB 基因序列比对结果均鉴定为芽胞杆菌,
这为进一步利用内生细菌生物防治棉花黄萎病奠定
了基础。
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的一种典型的
维管束真菌病害,随着现代生物学技术的发展,对棉
花黄萎病的防治,开始以环保、高效的生物防治为
主,而实现生物防治的必要条件是筛选到目的菌株。
Li et al. (2013)把具有拮抗活性的枯草芽胞杆菌菌
株 HJ5 与生物有机肥结合后可以显著降低棉花黄
萎病的发病率;Prieto et al. (2009)证明内生细菌
PICF7 能减弱大丽轮枝菌孢子萌发和菌丝延长的机
制主要是二者具有相同的生态位。 本试验筛选的 3
株芽胞杆菌均能定殖在棉花体中,其中菌株 CCM9
和 DP10 在根部大量定殖的同时部分转移到茎部定
殖;菌株 SZ5 在根部大量定殖的同时转移到茎部和
叶部定殖,这与范玉刚等(2011)报道内生细菌 S11
在棉花植株不同部位相互转移的结果相似。 内生细
菌在棉花体内能够自下而上进行转移,这种转移方
式与棉花黄萎病菌的侵染方式相似,因此认为 3 株
内生细菌在棉花体内定殖可能对抑制黄萎病菌的生
长和繁殖起到重要作用。 有研究认为这些内生细菌
转移过程中受到木质部导管流动性( James et al. ,
2001;Compant et al. ,2005;2008)和蒸腾压力(James
et al. ,2002;Compant et al. ,2010)的影响。 但是有
关内生细菌的传导机制和其在体内增殖的影响因素
仍有待进一步研究;同样该类型的生防菌株是否通
过定殖在棉花的导管或者维管束等部位防治黄萎病
以及其防病机理为何也需深入研究。
人工接种病原菌是检测生防细菌对病原菌抑制
能力的主要方法,Berg et al. (2001)通过在土壤中人
工接种大丽轮枝菌来评估筛选菌株对病原菌的生物
防治能力。 本研究发现棉花苗接入内生细菌后立即
移栽到病土时,对黄萎病的防治效果比较低,仅为
23􀆰 77% ~36􀆰 03% ;而接入内生细菌 10 d 后再接种
黄萎病菌的防治效果可达 79􀆰 52% ~ 89􀆰 79% ,防治
效果显著提高。 说明具有生防作用的内生细菌在棉
花体内定殖一定数量后,才能对棉花黄萎病产生较
高的防治效果。 这与檀根甲等(2008)报道的枯草
芽胞杆菌 BS80⁃6 菌株对苹果采后炭疽病的控病效
果及付思娅等(2013)报道的内生细菌对辣椒疫病
的防治效果相一致。 因此,应用内生细菌防治植物
病害应采用提前定殖的方式,使生防菌在作物根部
或茎部定殖一定数量的菌体,占据特定的生态位点
和空间后,病原菌才会受到更强的抑制,从而更有效
地防止病害的发生。
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(责任编辑:李美娟)
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