全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（２）： ２０７ － ２１４ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０２􀆰 ００５
基金项目：江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１２８４８）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｙａｎｓｈｕｚｈｅｎ＠ ｎｊｎｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
收稿日期： ２０１４ － １０ － ２８
植物内生细菌在棉花体内的定殖动态及
对棉花黄萎病的生物防治效果
王　 娜　 陶　 伟　 陈双林　 闫淑珍∗
（南京师范大学生命科学学院， 江苏省微生物与功能基因组学重点实验室，
江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心， 南京 ２１００４６）
摘要： 为明确植物内生细菌在棉花体内的定殖规律及对棉花黄萎病防治效果的影响，采用对峙培
养法筛选对大丽轮枝菌 Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ．抑菌活性强的植物内生细菌，通过形态及生理生化
特征并结合 １６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｇｙｒＢ基因分析鉴定菌株；利用抗生素标记法及盆栽试验研究其在棉花体
内的定殖动态及对棉花黄萎病的防治效果。 结果表明：共筛选到 ３ 株对大丽轮枝菌具有强抑菌活
性的菌株 ＳＺ５、ＤＰ１０ 和 ＣＣＭ９，其中 ＳＺ５ 为蜡样芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ，定殖在棉花根部、茎部和叶
部，ＤＰ１０ 和 ＣＣＭ９ 为枯草芽胞杆菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ，定殖在棉花根部和茎部，３ 株菌在棉花根部的定殖数
量均在 １０３ＣＦＵ ／ ｇ以上；棉花苗沾根分别接入 ３ 株内生细菌 １０ ｄ后再接种大丽轮枝菌孢子悬浮液，
对棉花黄萎病的防治效果达 ７９􀆰 ５２％ ～８９􀆰 ７９％ ，而 ３ 株内生细菌沾根接种后立即移栽到含有大丽
轮枝菌的土壤中对棉花黄萎病的防治效果为 ２３􀆰 ７７％ ～ ３６􀆰 ０３％ 。 表明不同内生细菌菌株在棉花
体内的定殖规律不同；且在棉苗中定殖一定数量后，才能对棉花黄萎病产生较高的防治效果。
关键词： 内生细菌； 棉花黄萎病； 定殖动态； 生物防治
Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｒｅｎｄｓ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｏｔｔｏｎ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ
Ｗａｎｇ Ｎａ　 Ｔａｏ Ｗｅｉ　 Ｃｈｅｎ Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ　 Ｙａｎ Ｓｈｕｚｈｅｎ∗
（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ； Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ； Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎａｎｊｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００４６， Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｏｔｔｏｎ
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ， ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ． ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａｇａｒ ｄｉｓｋ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｇｙｒＢ⁃ｂａｓｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｏｔｔｏｎ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌａｂｅｌ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｐｏｔ ｔｒｉａｌｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｔｒａｉｎｓ ＳＺ５，
ＤＰ１０ ａｎｄ ＣＣＭ９ ｈａｄ ａ ｎｏｔａｂｌｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ Ｖ． ｄａｈｌｉａｅ． Ｓｔｒａｉｎ ＳＺ５ ｗａｓ
ｉｄｅｎｔｉfiｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ， ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｃｏｌｏｎｉｚｅ ｔｈｅ ｒｏｏｔ， ｓｔｅｍ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｔｔｏｎ ｐｌａｎｔｓ． Ｓｔｒａｉｎｓ
ＤＰ１０ ａｎｄ ＣＣＭ９ ｗｅｒｅ Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ， ａｎｄ ｔｈｅｙ ｃｏｕｌｄ ｃｏｌｏｎｉｚｅ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｔｔｏｎ ｐｌａｎｔｓ． Ｔｈｅ
ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ ｒｏｏｔｓ ｗｅｒｅ ａｂｏｖｅ １０３ ＣＦＵ ／ ｇ． Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｖ．
ｄａｈｌｉａｅ ｓｐｏｒｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ １０ ｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｓｔｅｒｉｌｅ ｓｏｉｌｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｃｏｔｔｏｎ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ ｗａｓ ７９􀆰 ５２％ － ８９􀆰 ７９％ ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎｔｏ ｓｏｉｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｖ． ｄａｈｌｉａｅ ｓｐｏｒｅｓ ｈａｄ ａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ
ｃｏｔｔｏｎ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ ｏｆ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ２３􀆰 ７７％ －３６􀆰 ０３％ ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｈａｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ， ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｇｒｅａｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｇａｉｎｓｔ ｃｏｔｔｏｎ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ； ｃｏｔｔｏｎ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ； ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ； ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ
　 　 棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌 Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ． 引起的一种土传病害，是导致棉花减
产的主要病害，广泛分布于世界各产棉国。 由于该
病是土壤和种子传播的维管束病害，发病范围广且
几率高，流行性强，防治难度较大（周兆华等，２０００；
Ｆｒａｄｉｎ ＆ Ｔｈｏｍｍａ，２００６）。 目前防治该病的主要方
法是培育抗病品种、利用农业措施和使用化学药剂
等，但防治效果都不理想，特别是化学农药的使用，
不仅使病原菌产生抗药性而且对人类健康也会造成
危害（万慧等，２００７；Ｕｐｐａｌ ｅｔ ａｌ． ，２００８）。 因此，开展
以生物防治为主导的综合防治措施研究，对该病的
防治具有重要意义（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２０１３）。
在土传病害的生物防治研究中，通常采用植物
根际土壤微生物进行，如Ｗａｈｌａ ｅｔ ａｌ． （２０１２）从红辣
椒根际分离出 ２ 株绿脓杆菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
菌株 ＶＰ１ 和 ＶＰ２，不仅对辣椒有促生作用还可以控
制辣椒根结线虫的生长；Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ． （２０１３）从农作物
根际分离出 ４ 株链霉属放线菌 ＺＹ⁃１５３、Ｂ⁃４９、Ｘ⁃４ 和
Ｚ⁃１３，在温室试验中对棉花黄萎病的防治效果为
１８􀆰 ７％ ～６５􀆰 ８％ 。 由于田间环境和植物体微生态环
境存在很多因子会影响根际生防微生物的防治作用
（Ｄａｒｒａｈ，１９９１），所以用根际微生物进行生物防治的
最大问题之一就是效果不稳定（林玲等，２００８）。
植物内生细菌是指生活在健康植物各种组织和
器官的细胞间隙或细胞内，并与宿主植物建立起和
谐关系的一类微生物（Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ，１９９３）。 因其定
殖在植物体内，不易受外界环境影响的独特生活方
式而被广泛关注，如傅正擎等（１９９９）从棉花体内分
离出的内生菌 ７３ａ 对棉花黄萎病的防治效果在
７０％以上；Ｅｒｄｏｇａｎ ＆ Ｂｅｎｌｉｏｇｌｕ（２０１０）从棉花和杂草
根际分离出的 ４ 株荧光假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ⁃
ｒｅｓｃｅｎｓ菌株 ＦＰ２２、ＦＰ２３、ＦＰ３０ 和 ＦＰ３５ 在大田条件
下均可使棉花发病率降低到 ３９􀆰 ２％ ～ ５０􀆰 ９％ ；龚明
福等（２０１１）从苦豆子根瘤中分离出的内生细菌
ＫＤＲＥ１２ 和 ＫＤＲＥ４１ 对盆栽棉花枯萎病的平均防治
效果分别为 ６７􀆰 １１％和 ７２􀆰 ６５％ 。 表明内生细菌在
生物防治方面具有潜在的应用价值，因此本试验从
多种植物体内分离出内生细菌，在确认菌株对棉花
黄萎病菌具有拮抗活性的基础上，研究这些菌株在
棉花体内的定殖动态及其对棉花黄萎病的防治效
果，旨在为更合理地应用这些生防菌株防治棉花黄
萎病提供理论依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试菌株及棉花：大丽轮枝菌由江苏省农业科
学院植物保护研究所林玲研究员赠送。 棉花品种为
国审棉 ＧＫ⁃７０，种子购自江苏省农业科学院种子站。
试剂：提取细菌基因组试剂盒，生工生物工程
（上海）股份有限公司；ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ 凝胶回收试剂
盒，爱思进生物技术（杭州）有限公司；２ × Ｔａｑ ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，诺唯赞生物科技有限公司；链霉素
（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ），北京索莱宝科技有限公司。
培养基：牛肉膏蛋白胨（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ，ＮＡ）培养
基：牛肉膏 ３ ｇ、蛋白胨 １０ ｇ、ＮａＣｌ ５ ｇ、琼脂 １５ ～ ２０
ｇ、Ｈ２Ｏ １ Ｌ，ｐＨ ７􀆰 ０；马铃薯葡萄糖琼脂（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘ⁃
ｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基：马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、
琼脂 １５ ～ ２０ ｇ、Ｈ２Ｏ １ Ｌ。
仪器：ＨＷＳ⁃２５０Ｂ恒温恒湿箱，天津市泰斯特仪
器有限公司；Ｎｉｋｏｎ ＹＳ２⁃Ｈ 光学显微镜，江南光学仪
器有限公司；ＭＩＮＩ⁃ＳＵＢ ＣＥＬＬ ＧＴ 电泳仪、Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ
伯乐梯度 ＰＣＲ 仪，北京伯乐生命科学发展有限公
司；Ｔａｎｏｎ ２５００Ｒ全自动数码凝胶图像分析系统，上
海天能科技有限公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 植物内生细菌的分离、筛选和鉴定
从不同种植地采集番茄、马铃薯、黄瓜、草莓和
棉花等植株的根、茎和叶，根据 Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ． （２０１２）方
法分离并培养植物内生细菌。 把大丽轮枝菌接种到
含有 １００ ｍＬ ＰＤＡ液体培养基的 ２５０ ｍＬ三角瓶中，
２５℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养 １０ ｄ，取出发酵液用 １６ 层
纱布过滤，用双蒸水稀释大丽轮枝菌孢子悬浮液，血
球计数板计数，使其孢子悬浮液浓度达到 １０８ＣＦＵ ／
ｍＬ。 取孢子悬浮液 ２００ μＬ 均匀涂布于 ＰＤＡ 平板
８０２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
上，在距中心 ２􀆰 ５ ｃｍ处放置直径为 ６ ｍｍ 的内生细
菌菌饼，每皿 ８ 个，每个菌株重复 ３ 次，设不接种菌
饼的 ＰＤＡ平板为对照，置于 ２５℃培养箱黑暗培养，
观察抑菌圈大小，记录并转接对大丽轮枝菌有拮抗
作用的菌株。
植物内生细菌的形态观察和生理生化特征鉴定
参照东秀珠和蔡妙英（２００１）方法。 植物内生细菌
１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列分析鉴定：用试剂盒提取内生细
菌基因组，采用细菌通用引物 ２７Ｆ（５′⁃ＧＡＧＡＧＴＴＴ⁃
ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ⁃３′） 和 １４９２Ｒ （ ５′⁃ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣ⁃
ＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡ⁃３′），并参照 Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （２００９）方法对其
片段进行 ＰＣＲ扩增。 植物内生细菌 ｇｙｒＢ基因序列分
析鉴定：采用正向引物 ＵＰ２ｒ（５′⁃ＡＧＣＡＧＧＧＴＡＣＧＧＡＴ⁃
ＧＴＧＣＧＡＧＣＣＲＴＣＮＡＣＲＴＣＮＧＣＲＴＣＮＧＴＡＴ⁃３′）和反向
引物 ＵＰ１ （５′⁃ＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＹＧＣ⁃
ＮＧＧＮＧＧＮＡＡＲＴＴＹＧＡ⁃３′） （ Ｙａｍａｍｏｔｏ ＆ Ｈａｒａｙａｍａ，
１９９５），并参照谢永丽等（２０１４）方法对其片段进行
ＰＣＲ扩增。 所得 ＰＣＲ产物割胶回收纯化后均送南京
思普金生物科技有限公司测序，将测序结果与 Ｇｅｎ⁃
Ｂａｎｋ数据库中的已知序列进行 ＢＬＡＳＴ比对，用 Ｍｅｇａ
５􀆰 ０计算进化距离，以邻接法分别构建系统发育树，
通过 １ ０００次取样计算其 Ｂｏｏｔ ｓｔｒａｐ值。
１􀆰 ２􀆰 ２ 植物内生细菌定殖活性测定
参照 Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６）和蔡学清等（２００３）方
法将重点菌株接种在链霉素浓度为 １０ μｇ ／ ｍＬ 的
ＮＡ平板上（约 ５０℃时），待菌株稳定生长后，依次转
接到链霉素浓度为 ２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、
２００、２５０ 和 ３００ μｇ ／ ｍＬ 的 ＮＡ 平板上，标记终浓度
为 ３００ μｇ ／ ｍＬ。 根据罗明等 （２００７ ）和文才艺等
（２０１１）方法，借助于显微镜观察和平板对峙法对突
变株的生物活性进行检测，最终获得在含有链霉素
的 ＮＡ平板上能稳定生长，且菌落形态、定殖能力及
对病原菌的拮抗作用等保持不变的突变体菌株。
１􀆰 ２􀆰 ３ 植物内生细菌在棉花体内的定殖动态测定
将 １􀆰 ２􀆰 ２ 标记菌株接种于含 ３００ μｇ ／ ｍＬ链霉素
的 ５０ ｍＬ ＮＡ 培养基中，２８℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 振荡培养
４８ ｈ。 发酵液 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ，去掉上清
液，用无菌蒸馏水洗涤 ３ 次，最后用双蒸水稀释成
１０８ ＣＦＵ ／ ｍＬ的菌悬液。 选取长势一致的 ６ ～ ８ 叶期
棉花苗，用伤根法接入内生细菌，每株苗接种量为 ５
ｍＬ，每处理 １２ 盆，每盆 ４ 株苗。 分别于接种 １、３、５、
７、１０、１５、２０、２５ 和 ３０ ｄ 取出棉花苗，用剪刀将其分
为根、茎、叶 ３ 部分，分别称重后，７５％乙醇处理 ５
ｍｉｎ，无菌蒸馏水洗 ５ 次，１％ ＮａＣｌＯ 处理 ５ ｍｉｎ，无
菌蒸馏水洗涤 ５ 次，取最后 １ 次冲洗的水 ０􀆰 ２ ｍＬ均
匀涂布于 ＮＡ平板，若没有长出细菌，就证明消毒彻
底。 将消毒的根、茎和叶分别置于无菌的组织匀浆
器中研磨，再用无菌蒸馏水梯度稀释，取 １０ － １、１０ － ２
和 １０ － ３稀释梯度分别涂布于含 ３００ μｇ ／ ｍＬ 链霉素
的 ＮＡ平板上，每梯度 ３ 次重复，于 ２８℃培养 ４８ ｈ
后分别计数单菌落，统计其分布部位及数量。
１􀆰 ２􀆰 ４ 植物内生细菌对棉花黄萎病的防治试验
试验 １：参照 １􀆰 ２􀆰 １ 和 １􀆰 ２􀆰 ３ 的方法分别制备大
丽轮枝菌孢子悬浮液和内生细菌菌悬液，小心拔出
生长在灭菌土壤中长势一致的 ４ ～ ６ 叶期棉花苗，轻
轻抖去根上的土壤，使根完全浸没在细菌菌悬液中，
浸泡 １０ ｍｉｎ后移栽到无菌土壤中，１０ ｄ 后以伤根法
接入大丽轮枝菌孢子悬浮液，每株苗接种量为 ５
ｍＬ。 设清水沾根 １０ ｄ 后接种大丽轮枝菌孢子悬浮
液和不接种大丽轮枝菌孢子悬浮液的棉花苗为对
照，室内培养，每处理 １２ 株苗，３ 次重复，每组处理
共计 ３６ 株苗。
试验 ２：把沾根接入内生细菌的棉花苗立即移
栽到含有大丽轮枝菌孢子悬浮液的混合营养土中，
孢子含量为 １０６ ＣＦＵ ／ ｇ；设清水沾根后移栽到含大
丽轮枝菌孢子悬浮液混合土中和普通营养土中的棉
花苗为对照，其它步骤同试验 １。
２ 种试验均在接种大丽轮枝菌孢子悬液 ６０ ｄ时
调查植株的发病情况，依据黄萎病在棉花植株上发
病情况的分级标准进行调查（贾涛等，２００７）。 ０ 级：
棉株健康，无病叶，生长正常；１ 级：棉株发病叶片占
１ ／ ４ 以下，变黄萎蔫；２ 级：棉株发病叶片占 １ ／ ４ 以
上，１ ／ ２ 以下，变黄萎蔫；３ 级：棉株发病叶片占 １ ／ ２
以上，３ ／ ４ 以下，变黄萎蔫；４ 级：棉株发病叶片占３ ／ ４
以上，或叶片全部脱落，棉株枯死。 并计算病情指
数、发病率、防治效果（秦娟娟等，２０１０）。 病情指
数 ＝∑（发病株数 ×代表数值） ／ （总株数 ×发病最
重级的代表数值） × １００；发病率 ＝发病株数 ／总株
数 × １００％ ；防治效果 ＝ （对照区病情指数 －处理区
病情指数） ／对照区病情指数 × １００％ 。
１􀆰 ３ 数据分析
采用 ＳＰＳＳ １７􀆰 ０ 对数据进行单因素方差分析，
应用 Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法检验差异显著性。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 植物内生细菌的分离、筛选和鉴定
从植物体内共分离出 ２１１ 株内生细菌，从中筛
选到对大丽轮枝菌抑菌直径大于 ２􀆰 ９ ｃｍ 的 ３ 株内
９０２２ 期 王　 娜等： 植物内生细菌在棉花体内的定殖动态及对棉花黄萎病的生物防治效果
生细菌 ＣＣＭ９、ＤＰ１０ 和 ＳＺ５，通过 ＰＣＲ 扩增得到其
１６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｇｙｒＢ 基因序列长度分别为 １􀆰 ５ ｋｂ 和
１􀆰 １ ｋｂ左右，将序列检测后提交至 ＧｅｎＢａｎｋ，获得登
录号分别是 ＨＱ５３６０００、 ＨＱ１０８１８３ 和 ＨＱ７１８４１１。
在 ＮＣＢＩ数据库中进行 ＢＬＡＳＴ 比对，发现 ＤＰ１０ 和
ＣＣＭ９ 菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｇｙｒＢ 基因序列与枯草芽
胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ同源性达到 ９９％ ，ＳＺ５ 菌株的
１６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｇｙｒＢ基因序列与蜡样芽胞杆菌 Ｂ． ｃｅｒｅ⁃
ｕｓ和苏云金芽胞杆菌 Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ 同源性达到
９９％ ，根据 ｇｙｒＢ 基因序列构建的系统发育树显示
ＳＺ５ 菌株和蜡样芽胞杆菌 Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ 聚为一支（图
１ ～ ２）。３ 株菌的形态特征和生理生化特征表明，菌
株 ＣＣＭ９ 和 ＤＰ１０ 菌落均为圆形，表面湿润凸起，吲
哚反应呈阴性；菌株 ＳＺ５ 形成淡黄色和乳白色稍有
光泽的圆形菌落（似蜡），边缘不规则，表面平滑，吲
哚反应呈阳性，不产生伴孢晶体（表 １）。 因此，将菌
株 ＤＰ１０ 和 ＣＣＭ９ 鉴定为枯草芽胞杆菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ，
ＳＺ５ 鉴定为蜡样芽胞杆菌 Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ。
图 １ 基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列构建的菌株 ＣＣＭ９、ＤＰ１０ 和 ＳＺ５ 及其相关菌株的系统发育树
Ｆｉｇ． １ Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ＣＣＭ９， ＤＰ１０ ａｎｄ ＳＺ５ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
　
图 ２ 基于 ｇｙｒＢ基因序列构建的菌株 ＣＣＭ９、ＤＰ１０ 和 ＳＺ５ 及其相关菌株的系统发育树
Ｆｉｇ． ２ Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ＣＣＭ９， ＤＰ１０ ａｎｄ ＳＺ５ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｇｙｒＢ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
　
２􀆰 ２ 植物内生细菌在棉花体内的定殖动态
植物内生细菌 ＳＺ５、 ＤＰ１０ 和 ＣＣＭ９ 菌株均可在
棉花根中稳定定殖，３０ ｄ 时其定殖量均达到 １０３
ＣＦＵ ／ ｇ以上（表 ２）。 但 ３ 株内生细菌在棉花根、茎
和叶中的定殖量和定殖动态存在差异。 菌株 ＳＺ５ 可
在棉花的根、茎和叶中定殖，定殖量的大小顺序为根
０１２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
　 　 　 表 １ 植物内生细菌 ＣＣＭ９、ＳＺ５ 和 ＤＰ１０ 菌株的形态特征和生理生化特性
Ｔａｂｌｅ １ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ＣＣＭ９， ＳＺ５ ａｎｄ ＤＰ１０
特性 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ＣＣＭ９ ＳＺ５ ＤＰ１０ 特性 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ＣＣＭ９ ＳＺ５ ＤＰ１０
形状 Ｓｈａｐｅ
大小 Ｓｉｚｅ （μｍ）
短杆状
Ｓｈｏｒｔ ｒｏｄ
０􀆰 ７ × ２􀆰 ５
短杆状
Ｓｈｏｒｔ ｒｏｄ
１􀆰 ０ × ２􀆰 ５
短杆状
Ｓｈｏｒｔ ｒｏｄ
０􀆰 ８ × ２􀆰 ５
Ｖ． Ｐ反应 Ｖ． Ｐ ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｖ． Ｐ ｐＨ ＜ ６
Ｖ． Ｐ ｐＨ ＞ ７
＋
—
＋
＋
—
＋
＋
—
＋
厌氧 Ａｎａｅｒｏｂｉｃ
革兰氏染色 Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ
—
＋
—
＋
—
＋
硝酸盐还原 Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ
葡萄糖产气 Ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｇｌｕｃｏｓｅ
＋
—
＋
—
＋
—
芽孢 Ｓｐｏｒｅ 椭圆形、近中
生 Ｏｖａｌ ａｎｄ
ｎｅａｒｌｙ ｍｉｄｄｌｅ
柱状、近中生
Ｃｏｌｕｍｎａｒ ａｎｄ
ｎｅａｒｌｙ ｍｉｄｄｌｅ
柱状、近中生
Ｃｏｌｕｍｎａｒ ａｎｄ
ｎｅａｒｌｙ ｍｉｄｄｌｅ
柠檬酸盐利用 Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒａｔｅ
丙酸盐利用 Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ
淀粉水解 Ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
＋
—
＋
＋
—
＋
＋
—
＋
５０℃ — — — 明胶液化 Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ＋ ＋ ＋
５℃
７％ ＮａＣｌ
ｐＨ ５􀆰 ７
—
＋
＋
—
＋
＋
—
＋
＋
Ｄ⁃葡萄糖 Ｄ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ
Ｌ⁃阿拉伯糖 Ｌ⁃ａｒａｂｉｎｏｓｅ
Ｄ⁃甘露醇 Ｄ⁃ｍａｎｎｉｔｏｌ
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
接触酶 Ｃａｔａｌａｓｅ
吲哚反应 Ｉｎｄｏｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ
＋
—
＋
＋
＋
—
Ｄ⁃木糖 Ｄ⁃ｘｙｌｏｓｅ
　 　 ＋ ： 阳性； —： 阴性。 ＋ ： Ｐｏｓｉｔｉｖｅ； —： ｎｅｇａｔｉｖｅ．
部 ＞ 茎部 ＞ 叶部，最大定殖量分别为 ２􀆰 ０４ × １０６、
９􀆰 ２６ × １０３ 和 ５􀆰 ５１ × １０２ ＣＦＵ ／ ｇ，根部的定殖动态和
茎部一致，都具有周期性的先增加后减少的变化趋
势，而在叶部的定殖动态呈一直下降的趋势；菌株
ＤＰ１０ 和 ＣＣＭ９ 定殖在棉花的根部和茎部，根部的定
殖量大于茎部，根部的最大定殖量分别是 ６􀆰 ３３ ×
１０６ＣＦＵ ／ ｇ和 ５􀆰 ２５ × １０４ ＣＦＵ ／ ｇ，茎部的最大定殖量
分别是 ２􀆰 １４ × １０４ ＣＦＵ ／ ｇ和 １􀆰 ８８ × １０２ ＣＦＵ ／ ｇ，根部
的定殖动态和茎部一致，呈先增加后减少的变化
趋势。
表 ２ 植物内生细菌 ＳＺ５、ＤＰ１０ 和 ＣＣＭ９ 菌株在盆栽棉花苗体内的定殖动态
Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ＣＣＭ９， ＳＺ５ ａｎｄ ＤＰ１０ ｉｎ ｐｏｔｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ　
ＣＦＵ ／ ｇ
接种天数（ｄ）
Ｄａｙｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ＳＺ５ ＤＰ１０ ＣＣＭ９
根 Ｒｏｏｔ（ ×１０５） 茎 Ｓｔｅｍ（ ×１０３） 叶 Ｌｅａｆ（ ×１０２） 根 Ｒｏｏｔ（ ×１０５） 茎 Ｓｔｅｍ（ ×１０３） 根 Ｒｏｏｔ（ ×１０４） 茎 Ｓｔｅｍ（ ×１０２）
１ ０􀆰 ３８ ±０􀆰 １０ ｄ ０􀆰 １５ ±０􀆰 ０４ ｅ ５􀆰 ５１ ±０􀆰 ６０ ａ ０􀆰 ３１ ±０􀆰 ０６ ｂ ０􀆰 １５ ±０􀆰 ０７ ｃ ０􀆰 ３９ ±０􀆰 １１ ｂｃ １􀆰 ０８ ±０􀆰 ２２ ａｂ
３ ２０􀆰 ４０ ±１􀆰 ３２ ａ ９􀆰 ２６ ±０􀆰 ３２ ａ ５􀆰 ３０ ±０􀆰 ５４ ａ ２􀆰 ５３ ±０􀆰 １５ ｂ ０􀆰 ２０ ±０􀆰 ０４ ｃ ５􀆰 ２５ ±０􀆰 ５３ ａ １􀆰 ８８ ±０􀆰 ２４ ａ
５ ０􀆰 ５０ ±０􀆰 ０５ ｄ ０􀆰 ６０ ±０􀆰 １３ ｄｅ ３􀆰 ９９ ±０􀆰 ３８ ｂ ２􀆰 ６８ ±０􀆰 １６ ｂ ６􀆰 ５４ ±０􀆰 １９ ｂ ０􀆰 ９１ ±０􀆰 ２６ ｂｃ １􀆰 ９３ ±０􀆰 ７７ ａ
７ ３􀆰 ０６ ±１􀆰 ０２ ｂ ０􀆰 ７５ ±０􀆰 ２３ ｄｅ ２􀆰 １９ ±０􀆰 ４２ ｄ １􀆰 ６８ ±０􀆰 ６３ ｂ ５􀆰 ２９ ±１􀆰 ９３ ｂｃ ０􀆰 ９５ ±０􀆰 ３８ ｂ １􀆰 ４７ ±０􀆰 ００ ａｂ
１０ ２０􀆰 １０ ±１􀆰 ５０ ａ ０􀆰 ９８ ±０􀆰 １８ ｃｄ １􀆰 ５５ ±０􀆰 ７２ ｃ ６３􀆰 ２７ ±８􀆰 ０６ ａ ２１􀆰 ３７ ±４􀆰 ９８ ａ ０􀆰 ７１ ±０􀆰 ００ ｂｃ １􀆰 １１ ±０􀆰 ００ ａｂ
１５ ０􀆰 ３５ ±０􀆰 ００ ｄ ０􀆰 １２ ±０􀆰 ０３ ｅ ０􀆰 ３５ ±０􀆰 ００ ｄ ２􀆰 ６５ ±１􀆰 ４２ ｂ ０􀆰 ５９ ±０􀆰 ２５ ｃ ０􀆰 １７ ±０􀆰 ０４ ｂｃ ０􀆰 ６９ ±０􀆰 ００ ｂｃ
２０ ４􀆰 ２１ ±０􀆰 １１ ｂ １􀆰 ４７ ±０􀆰 ３２ ｂｃ ０􀆰 ２９ ±０􀆰 ００ ｄ ０􀆰 ２２ ±０􀆰 ０１ ｂ ０􀆰 ５２ ±０􀆰 １６ ｃ ０􀆰 ３６ ±０􀆰 ０９ ｂｃ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｃ
２５ ０􀆰 ５４ ±０􀆰 １３ ｄ ０􀆰 ４７ ±０􀆰 １７ ｄｅ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｄ ０􀆰 １８ ±０􀆰 ０５ ｂ ０􀆰 １３ ±０􀆰 ００ ｃ ０􀆰 ２２ ±０􀆰 ０７ ｂｃ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｃ
３０ １􀆰 ０６ ±０􀆰 ０４ ｃｄ １􀆰 ６３ ±０􀆰 ０５ ｂ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｄ ０􀆰 ０６ ±０􀆰 ０１ ｂ ０􀆰 ０８ ±０􀆰 ００ ｃ ０􀆰 １１ ±０􀆰 ００ ｃ ０􀆰 ００ ±０􀆰 ００ ｃ
　 　 表中数据为平均数 ±标准误。 同列不同字母表示经 Ｄｕｎｃａｎ 氏新复极差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。 Ｄａｔａ ａｒｅ
ｍｅａｎ ± ＳＥ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ．
２􀆰 ３ 植物内生细菌对棉花黄萎病的防治效果
棉花苗分别接入内生细菌 ＣＣＭ９、ＳＺ５ 和 ＤＰ１０
菌株 １０ ｄ时再接种大丽轮枝菌处理对棉花黄萎病
的防治效果分别为 ８９􀆰 ７９％ 、８３􀆰 ９６％和 ７９􀆰 ５２％ ，而
棉花苗分别接入 ３ 株内生细菌后，立即移栽至含大
丽轮枝菌的土壤中时防治效果分别为 ３６􀆰 ０３％ 、
２６􀆰 ０２％和 ２３􀆰 ７７％ （表 ３）。 不同内生细菌对棉花黄
萎病的防治效果存在差异，ＣＣＭ９ 菌株的防治效果
最高，但与 ＳＺ５ 和 ＤＰ１０ 菌株差异不显著。 表明 ３
株内生细菌在植物体内定殖后再接种黄萎病菌防治
效果较高。
３ 讨论
Ｓｔｅｉｎ（２００５）和 Ｌａｔｈａ ｅｔ ａｌ． （２０１１）报道芽胞杆
菌可以产生种类多样的抑制植物病原菌生长的生物
活性因子，如细菌素、几丁质酶、抗菌多肽和酚类等。
１１２２ 期 王　 娜等： 植物内生细菌在棉花体内的定殖动态及对棉花黄萎病的生物防治效果
　 　 　 表 ３ 植物内生细菌 ＣＣＭ９、ＳＺ５ 和 ＤＰ１０ 菌株对棉花黄萎病的防治效果
Ｔａｂｌｅ ３ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ＣＣＭ９， ＳＺ５ ａｎｄ ＤＰ１０ ａｇａｉｎｓｔ ｃｏｔｔｏｎ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
棉苗接入内生细菌 １０ ｄ时再接种病原菌
Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ １０ ｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ
棉苗接入内生细菌后立即接种病原菌
Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ
发病率 （％ ）
Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ
病情指数
Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ
防治效果 （％ ）
Ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ
发病率 （％ ）
Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ
病情指数
Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ
防治效果 （％ ）
Ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ
ＣＣＭ９ １３． ８９ ± ２． ７８ ａ ９． ７２ ± ２． ５０ ｂ ８９． ７９ ± ２． ７６ ａ ７２． ２２ ± ２． ７８ ｂ ６１． ８１ ± ３． ６７ ｂ ３６． ０３ ± ２． ９１ ｂ
ＳＺ５ ２２． ２２ ± ２． ７８ ｂｃ １４． ９４ ± ４． ８９ ｂ ８３． ９６ ± ４． ８６ ａ ８０． ５６ ± １１． １１ ｂ ７１． ５３ ± ９． １９ ｂ ２６． ０２ ± ９． ０６ ｂ
ＤＰ１０ ２７． ７８ ± ５． ５５ ｂ １９． ４４ ± ７． ２５ ｂ ７９． ５２ ± ７． ８１ ａ ８８． ８９ ± ２． ７８ ａｂ ７３． ６１ ± ３． ０３ ｂ ２３． ７７ ± ２． ２８ ｂ
对照 ＣＫ １００． ００ ± ０． ００ ａ ９５． ８３ ± １． ２０ ａ ０． ００ ± ０． ００ ｂ １００． ００ ± ０． ００ ａ ９６． ５３ ± １． ８４ ａ ０． ００ ± ０． ００ ｃ
　 　 ＣＫ： 只接种大丽轮枝菌孢子悬浮液土壤。 表中数据为平均数 ±标准误。 同列数据后不同字母表示经 Ｄｕｎｃａｎ 氏新复极
差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 水平差异显著。 ＣＫ： Ｏｎｌｙ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｐｏｒｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｖ． ｄａｈｌｉａｅ． Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＥ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔ⁃
ｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ．
本研究筛选出的 ３ 株内生细菌 ＣＣＭ９、ＤＰ１０ 和 ＳＺ５
通过观察其形态学和生理生化特征，并结合 １６Ｓ ｒＤ⁃
ＮＡ和 ｇｙｒＢ 基因序列比对结果均鉴定为芽胞杆菌，
这为进一步利用内生细菌生物防治棉花黄萎病奠定
了基础。
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的一种典型的
维管束真菌病害，随着现代生物学技术的发展，对棉
花黄萎病的防治，开始以环保、高效的生物防治为
主，而实现生物防治的必要条件是筛选到目的菌株。
Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （２０１３）把具有拮抗活性的枯草芽胞杆菌菌
株 ＨＪ５ 与生物有机肥结合后可以显著降低棉花黄
萎病的发病率；Ｐｒｉｅｔｏ ｅｔ ａｌ． （２００９）证明内生细菌
ＰＩＣＦ７ 能减弱大丽轮枝菌孢子萌发和菌丝延长的机
制主要是二者具有相同的生态位。 本试验筛选的 ３
株芽胞杆菌均能定殖在棉花体中，其中菌株 ＣＣＭ９
和 ＤＰ１０ 在根部大量定殖的同时部分转移到茎部定
殖；菌株 ＳＺ５ 在根部大量定殖的同时转移到茎部和
叶部定殖，这与范玉刚等（２０１１）报道内生细菌 Ｓ１１
在棉花植株不同部位相互转移的结果相似。 内生细
菌在棉花体内能够自下而上进行转移，这种转移方
式与棉花黄萎病菌的侵染方式相似，因此认为 ３ 株
内生细菌在棉花体内定殖可能对抑制黄萎病菌的生
长和繁殖起到重要作用。 有研究认为这些内生细菌
转移过程中受到木质部导管流动性（ Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ． ，
２００１；Ｃｏｍｐａｎｔ ｅｔ ａｌ． ，２００５；２００８）和蒸腾压力（Ｊａｍｅｓ
ｅｔ ａｌ． ，２００２；Ｃｏｍｐａｎｔ ｅｔ ａｌ． ，２０１０）的影响。 但是有
关内生细菌的传导机制和其在体内增殖的影响因素
仍有待进一步研究；同样该类型的生防菌株是否通
过定殖在棉花的导管或者维管束等部位防治黄萎病
以及其防病机理为何也需深入研究。
人工接种病原菌是检测生防细菌对病原菌抑制
能力的主要方法，Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （２００１）通过在土壤中人
工接种大丽轮枝菌来评估筛选菌株对病原菌的生物
防治能力。 本研究发现棉花苗接入内生细菌后立即
移栽到病土时，对黄萎病的防治效果比较低，仅为
２３􀆰 ７７％ ～３６􀆰 ０３％ ；而接入内生细菌 １０ ｄ 后再接种
黄萎病菌的防治效果可达 ７９􀆰 ５２％ ～ ８９􀆰 ７９％ ，防治
效果显著提高。 说明具有生防作用的内生细菌在棉
花体内定殖一定数量后，才能对棉花黄萎病产生较
高的防治效果。 这与檀根甲等（２００８）报道的枯草
芽胞杆菌 ＢＳ８０⁃６ 菌株对苹果采后炭疽病的控病效
果及付思娅等（２０１３）报道的内生细菌对辣椒疫病
的防治效果相一致。 因此，应用内生细菌防治植物
病害应采用提前定殖的方式，使生防菌在作物根部
或茎部定殖一定数量的菌体，占据特定的生态位点
和空间后，病原菌才会受到更强的抑制，从而更有效
地防止病害的发生。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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ｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
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ｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｇｙｒＢ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａ⁃
ｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ⁃
ｔｉｄａ ｓｔｒａｉｎｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６１（３）：
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Ｙａｎｇ Ｐ， Ｓｕｎ ＺＸ， Ｌｉｕ ＳＹ， Ｌｕ ＨＸ， Ｚｈｏｕ Ｙ， Ｓｕｎ Ｍ． ２０１３． Ｃｏｍｂｉ⁃
ｎｉｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｇｅｓ
ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｉｌｔ． Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ４７：
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Ｚｈｏｕ ＺＨ， Ｚｈａｎｇ ＴＺ， Ｐａｎ ＪＪ， Ｃｈｅｎ ＺＸ， Ｊｉａｎｇ ＷＭ． ２０００． Ｐａｔｈｏｇｅ⁃
ｎｉｃｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ｏｎ ｃｏｔｔｏｎ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ．
Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ， ３３（２）： ５１ － ５７ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［周
兆华， 张天真， 潘家驹， 陈兆夏， 蒋伟民． ２０００． 大丽轮枝
菌在棉花品种上的致病力分化研究． 中国农业科学， ３３
（２）： ５１ － ５７］
（责任编辑：李美娟）
４１２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷