全 文 ：B U L L E T N F B OT O人N I C人L E R SEA C RH
第 12 卷 , 第 2期
V o l
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2 2 . N o
.
2
1 0 9 2年 4 月
A p r il
,
1 0 9 2
红松成熟胚离体培养器官发生组织学研究
刘玉喜 唐 翠 詹亚光
S T U OY O N
O F T日E !N
HIS T OG ENE S IS AN D ORG ANO G E NS IS
V !T R O D EV EL O P ME NT F R OM P !NU S
KO R A! E N S!5 EMB R YO S
L i u Y u
一 x i T a n g C 往 1 Z h a n Y a 一 g u a n g
〔摘要 〕 红松 ( P i n u s ko r a i e n s i s s i e b 。 e t Z u 。 e ) 〔3 〕成熟胚离体培 养 ,
先在分化培养基 s( H 十 1一 Z m g / L B A P + 3 % 蔗糖 )培养两周 , 然后转入无激
素培养基 (s H + 3 % 蔗箱 ) , 在下胚轴和上胚轴陆续形成不定芽。 石蜡制片 、
观察红松成熟胚不定芽的器官发生过程 。 结果表明 : 不定 芽起源于胚轴的皮层
细胞 , 有的是表 皮和皮层细胞 同时启动 。 芽形成全过程可分成四个阶段 : 启动
阶段 、 芽原基形成阶段 、 鲜叶原基形成阶段和不定 芽结构形成阶段 。
关键溉 红松 ; 组 织培养 , 不定 芽 ; 形杰建成
松属林木的组织培养 , 近年来发展很快 , 利用胚 、 胚轴 、 子叶 、 针叶 、 芽 、 嫩校等
外植体诱导出愈伤组织 , 腋芽 、 不定芽和胚状体 , 有的物种还得到了带根的完整植株 。
但不定芽形态建成组织学方面的研究却很少 。
红松组织培养方面的论文不多 , 李正理 ( l马6 2) 的研究表明红松胚在无激索培养基
中能正常生长〔 ,〕。 南朝鲜 K i m 〔1 9 8 6 ) 从红松离体胚上诱导出愈伤组织 , 并对愈 伤 组
织的遗传稳定性进行了研究 。 黑龙江省林研所 ( 1 9了8) 以科技消息形式简要报道了红松胚
离体培养形成不定芽 〔4〕。 笔者 ( 1 9 9 1 ) 对红松胚离体培养形成不定芽做了详细报道〔“ 〕 ,
但至今尚未见到红松胚离体培养诱导产生不定芽的组织学观察方面的论文 。 本文对不定
芽的形成进行了组织学观察 , 详细研究了不定芽的产生部位和形成过程 。
材 料 和 方 法
红松种子 1 9 8 8 年采于东北林业大学凉水实验林场 , 在室温 ( 10 一 15 ℃ ) 的条 件 下
刘玉喜 , 唐翠 , 詹亚光 : 黑龙江 , 仆合尔滨 , 东北林业大 学 (N o r t h e a , t F o : e 、 t r 了 U n i二 e r 。 i之y H a r b i。 一5 0 4 0。
组 e i之o n g j ia n g ) .
一 1 8 9 一
砂藏 6一 9 周 , 接种前剥去内外种皮 , 用乙醇和次氯酸钠消毒 , 在无菌条件下剥出胚 浅 .
擂于固体培养基上 。
外植体首先培养在含激素的不定芽分化培 养 基 (S H + 1 一 2 m g / L B A P + 3 % 蔗
糖上 ) , 两周后转到不含激素的不定芽形成培养培基 (S H + 3 % 蔗糖 ) 继续培养 , 陆续
形成不定芽 。
培养室温度为 2 4一 2 6℃ , 每日光照 8一 l o h , 光照强度为 2 5 0 0一 2 0 0 o l u x 。
外植体转到不定芽形成培养基后 , 每天取材固定于 F A A 固定液中 , 石蜡制片 , 镜
检 。
结 果 与 分 析
1
. 胚培养不定芽 的分化 红松成熟胚离体培养产生不定芽 ,成功的培养基和培养程
序是 : 外植体首先接种在含激素的分化培养基 (S H + 1 一 Z m g / L B A P + 3% 蔗搪上 ) ;
两周后转移到不含激素的不定芽形成培养基 (S H 十 3 % 蔗糖 ) 巾 , 在上 、 下胚 轴 上陆
续产生不定芽 ; 将带不定芽的外植体转移到嫩枝生长培养基 ( 1 / Z M S 十 2 % 蔗糖 , 1 / 2
M S 是大量元素减半 ) , 不定芽长成嫩枝 , 不定芽分化率近 30 % 。
红松成熟胚接种 3 天后胚轴由黄变紫 , 7 天后由紫变绿 , 下胚轴膨胀直径达 8 m m 。 、
约 10 天左右在某些外植体的下胚轴表面开始 出现黄色愈伤组织 , 其频率随分化时 间 的
增加而增多 。 子叶的变化是培养 7 天后由黄变绿 , 生长缓慢但肥厚 , 绿色 较 深 。 培 养
3一 4 周后胚芽开始萌动 , 9 周后胚轴长达 巧一25 m二 。
外植体接种后最早出现不定芽的部位是 , 下胚轴上部与子叶相接处的子叶基部缝隙 _
之间 , 首先 出现一圈黄色小斑点 , 随后在黄色小斑点中心出现亮绿色园形小突起 (直径
约 1 m m ) , 此后 3一 5天可发育成肉眼可辨的芽的类似物 , 继代培养在不定芽形成 培 养
基中 , 逐渐长大形成不定芽 。 此处的不定芽分化的快 , 基本同步。 最早出现黄色小斑点
的时间约在离体培养 8 一 10 天开始出现 。
下胚轴其它部位出现黄色小斑点的时 l’id 较晚 , 继代培养在不定芽形成 培 养 基 2一 3
天 (离体培养 16 一 18 天 ) 后才从下胚轴表面上陆续出现黄色小突起 , 它们成片甚 至 布
满整个下胚轴表面 , 从肉眼可辨的小突起出现到形成完整不定芽 , 约需 30 天左 右 。 这
些不定芽是陆续出现的 , 是不同步的 。
形成不定芽最晚的部位是上胚轴 , 离体培养 25 天以后才从刚刚伸出的上胚轴表 面
长出不易用肉眼察觉的小突起 , 这些小突起亦是随着上胚轴的生长而陆续形成 , 不同步
地长成不定芽 。
2
。 不定芽形成过程的解剖学观察 红松成熟胚离体培养 , 上 、 下胚轴表面产 生 不
定芽 , 其起源和形成过程目前尚无报导 , 经笔者研究 , 不定芽起源于胚轴的表皮和皮层
细胞 , 经过 4 个阶段才长成完整的不定芽 。
2
.
1 启动阶段 外植体培养初期表皮和皮层细胞排列整齐未见异常 , 一周后 下 胚
轴的部分皮层细胞发生变化 , 虽然排列整齐但个别细胞质变浓 , 细胞核增大成为分生细
胞 。 这些即将启动的细胞将成为不定芽的原始细胞 , 我们将这个时期称为启动阶段 , 见 _
图版 I 一 1 。
2
.
2 芽原基形成阶段 启动的皮层细胞进行平周分裂形成小细胞群 , 这群细 胞 的
一 1 9 0一
细胞质很浓 , 核大染色深 。 除由皮层细胞平周分裂形成小细胞群外 , 表皮和皮层细胞共
同分裂联成一体形成小细胞群的也有 。 这群细胞进一步分裂 , 加上单个细胞 体 积 的 增
大 , 在胚轴表面形成园形突起 , 这些细胞排列整齐成苗端状构造 , 笔者称此阶段为芽原
基形成阶段 , 见图版 I 一 2 。 此时用肉眼不易分辨 , 只见表面刚刚隆起 , 需仔细观 察 方
能见到黄色小斑的雏形 。
2
.
3 鳞叶原基形成阶段 在胚培养 25 一 40 天间观察到鳞叶原基的形成过程 。 在 近
似苗端的芽原基侧方分生组织细胞平周分裂 , 开始形成鳞叶原基 , 见图版 I 一 3。 由 于
芽原基的中央细胞不断分裂向上使芽原基生长 , 侧生细胞进行平周分裂促进鳞叶原基的
生长 。 在不定芽的形态建成过程中 , 芽原基成为不定芽的起始者 , 随着细胞 的 不 断 分
裂 , 芽原基不断生长 , 鳞叶原基也逐渐成熟 , 而新的鳞叶原基又从芽顶端的侧生分生组
织生成 。 如此一对鳞叶原基形成之后逐渐生长 , 另一对鳞叶原基又开始启动了 , 如此形
成完整的不定芽 。 这一过程就是在胚轴上形成黄斑 , 并在中间出现亮绿色园形小突起 ,
成为肉眼可辨的芽 。
2
.
4 不定芽的结构 离体培养 5一 7 周后陆续形成完整 的不定芽 。 不定芽的外面包
着 8一 10 片芽鳞 , 茎尖分生区顶端一般为半球形 , 顶端分生组织的最外层进行平周和垂
周分裂 , 把细胞加人到茎周围和内部的组织 , 茎端并不显出原套— 原体的组织 。 在顶端分生组织中央位置的表面细胞被认为是原始细胞 , 形成原始细胞层 , 下面是中央母细
胞区 , 再下面是肋状分化组织低 1 〕, 最外层包裹 8一10 个芽鳞形成完整的不 定 芽 , 见
图版 I一 4 . 5 。 最外面包裹的芽鳞类似于正常生长发育的红松针叶 , 见图版 I一 6 。
随着不定芽的生长 , 在嫩茎上出现初生叶 , 在叶腋处有腋芽形成 , 腋芽的结构与不
定芽相似 。
3
. 胚状体的形成 在不定芽形态建成 的研究中发现 , 外植体表面不但能形成 大 量
不同步的不定芽 , 同时也有胚状体的原始体产生 。 外植体离体培养 20 一 25 天时分 生 细
胞团分别形成芽原基和胚状体前体 , 但外观上用肉眼难以分辨 , 只能看到胚轴表面有凹
凸不平的突起 。 胚状体的起源和不定芽相同 , 也是由表皮和皮层细胞分裂形成 。 观察到
的胚状体结构只停留在球形的原始阶段 , 见图版 I一几 还未见到以后的发育过程 , 球形
细胞团内的构造存在极性 , 明显的分成两个区 。 接近顶端的一堆细胞较小 ; 细胞质浓染
色较深 。 两端的细胞较大染色也较浅 , 周围细胞较大细胞质淡染色较浅 。 正是通过接近
两顶端的两堆小细胞 (分生细胞 ) 的分裂将形成完整的胚状体 。
结 论 一 与 讨 论
1
。 红松不定芽的起源与形成过程 红松成熟胚离体培养 , ’ 形成不定芽先后 经 历 4
个阶段 , 红松不定芽是外起源 , 其构造同正常芽 。
S o m m e r 和 B r o w n 通过对长叶松 ( p i n ; 5 p a l u : t丫15 ) 的胚培 养 ; C h a l u p a 和
V at a r t 对白云杉 (八ce a 以au ea ) 下胚轴培养 ; 还有 其 他 学 者 对 欧 洲 云 杉 (八比 a
。好 o aP e 。 ) 、 挪威云杉 叨 i c即 ab f。 : ) 等的胚培养都得到了不定芽 , 通过组织学 观 察 证
明是外起源 , 是从外植体的表皮或皮层细胞平周分裂形成的臼〕; 如此看来红松胚轴上形
成的不定芽 , 其起源与其他学者在某些裸子植物上得到的结果是 , 致的 。
K h e n g一 T u a n C h e a h 在 1 9 78年对黄杉 ( p s e d以膨 g a m。 : 乒i e s i i ) 子叶培养形成
一 1 9 1一
不定芽 , 并进行了组织建成的研究 , 区分成 4 个阶段帅 。 A r二 ol d : 1 9 8 5 年认为欧洲云
杉胚不定芽分化为 3 个阶段 〔“ 〕。 而我们把红松不定芽的分化分为 4 个阶段 , 其实都大同
小异基本一致 , 比较起来还是分为 4 个阶段好 , 从形态比较上更容易区分。
3
. 胚状休原始体的形成 胚状体原始体也起源于胚轴的表皮和皮层细胞 。 由 于 皮
层和表皮细胞的启动 , 分裂形成分生细胞群 , 随着进一步的生长形成具有两极化的球形
细胞团— 胚状体原始体 。 红松成熟胚离体培养在同一培养基及其同一培养程序 , 即可产生不定芽又可产生胚状体 , 但胚状体只停留在球形阶段 。 离体培养一个月后在胚轴上
仍保持苍绿色的球形小突起 , 不再发生任何形态上的变化 , 似乎进人休眠状态就是球形
胚状体原始体 。 之所以不动可能是培养基的种类和激素组成不合适 , 如何使之进一步发
育还需深人研究 。
胚状体是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式 , 在某些裸子植物组织培养过
程中得到了胚状体 。 B a n 。 j e e 和 卫 a d f e r t h 培养多脂松 ( p i : u s r e s i n o s a ) 获 得 了 各
种发育阶段的胚状体 〔7〕; 白云杉未成熟胚培养也获得过胚状体〔`“ 〕 ; 另外欧 洲 落 叶 松
( L a , i戈 e : ` : o Pa e a ) , 欧洲云杉 、 火炬松 ( P i n左5 t a e d a ) 、 花旗松和侧柏 ( B f o t a o 才i e , , t a -
石: ) 都见到了胚状体的形成 。 尽管如此 , 仅有少数发表的文章阐明胚状体的形成过程 ,
经过详细的组织学研究证实了它们确实是胚状体闭 。
1 9 8 5 年 H a k m a n 用 挪威云杉的成熟胚进行组培获得胚状体 〔“ 〕 , 通过组织学观察
发现外植体在一定的培养条件下首先形成胚状体原始体 , 进一步培养就会形成茎轴和根
轴 , 它们内部都是有独立和相连的维管系统 , 但有不少培养休不能进一步分化 , 在液休
一培养基中进行 6 个月的继代培养出现了完整的胚状体 。
通过国外学者的工作发现 , 裸子植物通过组培是可以形成胚状体的 , 而我们对红松
组培和组织学观察也证实 , 红松成熟胚离休培养形成胚状体是可能的 , 但要得到完整胚
状体尚须深人研究 。
A B S T R AC T
C
o l t u r e d Z 二 e e k s 10 v i t r o o n m e d i u 二 ( S H + 1 一 2 m g / 1 B A + 3% s u c : o s e )
f o r d i f f e r e n t i a t i o n
,
m a t u r e e m b
r y o s o f P
。
ko r a i己 n s f s w e r e t r a n s f e r r e d t o
t h e m e d i u m w i t h
o 以 t h o r m o 几 e ( S H + 3 % s u 舀r o s e ) 。 A d v e n t i t i o u s b u d s p r o -
·
d u e e d o 江 e p i e o t y l s a n d h y p o e o t y l s e o n t i n u o u s l y . T h e o r g 几 n o g e n e s i s
p r o e e s s o f a d
v e n t i t i o u s b u d s w a s o b s e r v e d w i t il P a r a f f i n s e e t i o 几 m e t h o d .
T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e a d v e n t i t i o u s b u d a r o , e f r o m e o r t i e a l e e l l
0 f h y p O C 0 t y l s
, s o m e o f t h e 扭 o r i g i功 a t e d f r o m b o t h e o r t i C a l e e l l : a n d
e P i d e r m i s e e l l s
。
T h e w h o l e P r o e e s s o f a d v e n t i t i o u s b u d s d e
v e l o P 位 e且 t i n
心 u l t u r e e o u l d b e d i v i d e d i红 t o f o u r s t a g e s a s f o l l o w s : ( 1 ) s t a r t i n g o f
心 e 115 d i f f e r e n t i a t i o n ; ( 2 ) bu d p r im o r d i u m ; ( 3 ) s h o o t a p e x w i t h n e e d l e
p r i m o r d i a , ( 4 ) 鹿 d v e n t i t i o u s b鲜 d s 。
Ke y w o r d s
* P i n u s ko 犷 a i e n s i s ; t i s s u e e u l t u r e ; a d v e n t i t i o u s b u d s ,
m o r P h o l o g i e a l f o r m a t i o n
.
一 1 9 2 一
参 考 文 献
〔 l 〕
〔 2 〕
〔 3 〕
〔 4 〕
〔 5 〕
〔 6 〕
〔 7 〕
〔 8 〕
〔 9 〕
〔10 〕
〔1 1〕
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