全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)"#)#,
基金项目$国家自然科学基金"
%#!""!%&
#&陕西省教育厅科研计划"
#&12"3
#
作者简介$唐
!
绮"
##(
#!女!硕士!主要从事被子植物生殖生物学研究
4)56.7
$
*3%!"3$,,
!88
+9:5
"
通信作者$王丹阳!副教授!硕士生导师!主要从事被子植物生殖生物学研究
4)56.7
$
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0;?+@=?+90
黄瓜生殖细胞分离及其线粒体
$%&
的
观察与拷贝数定量分析
唐
!
绮!蔺
!
祯!高
!
龙!郭
!
雪!王丹阳"
"西北大学 生命科学学院!西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室!西安
,#""$
#
摘
!
要$该研究以
$
"
3
月上午
#"
点左右摘取的新鲜黄瓜花朵为材料!采用渗透压冲击的方法分离黄瓜生殖细胞!
并应用竞争型定量
ABC
技术测定其线粒体
DEF
数量!分析生殖细胞在发育过程中线粒体
DEF
的变化!以明确高
丰度线粒体
DEF
的来源!为进一步研究被子植物调控线粒体
DEF
扩增的分子机制奠定基础结果显示$"
#
#
DFAG
染色观察发现!黄瓜生殖细胞的细胞核周围存在大量的细胞器
DEF
荧光点!表明黄瓜生殖细胞的细胞质中
存在大量的线粒体
DEF
"
!
#成熟黄瓜生殖细胞平均包含"
#"%,H#!$
#个线粒体
DEF
拷贝"
%
#成熟生殖细胞内
线粒体
DEF
含量为早期生殖细胞的
#&+*
倍!表明成熟生殖细胞中的线粒体
DEF
主要来自于生殖细胞形成后其
内活跃的线粒体
DEF
扩增研究认为!黄瓜生殖细胞内活跃的线粒体
DEF
是黄瓜线粒体父系遗传的基础
关键词$线粒体
DEF
&拷贝数&父系遗传&黄瓜&生殖细胞
中图分类号$
I%&
J
+*#
&
I,*%
文献标志码$
F
(")*+#","-./,/0*+#1/2/)"-12"23-44$#-524*,!3#+"45",!0#*)
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89
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@0@V6W.[@9@7
"
LB
#
!!
植物细胞
%
个携带
DEF
的细胞器)))细胞
核*质体及线粒体以不同的方式传递
DEF
到下一
代不同于细胞核的双亲遗传!叶绿体与线粒体普
遍呈现母系遗传!尤其是线粒体!显现出更为严格的
母系遗传+#)!,在迄今所研究过的植物中!只有甜
瓜*天竺葵*香蕉及黄瓜等少数物种呈现双亲或者父
系线粒体遗传的特征+%)*,由于线粒体是携带
DEF
的细胞器!因此!线粒体遗传的本质是线粒体
DEF
的遗传细胞学研究结果表明$对于线粒体双亲或
者父系遗传的物种!其生殖细胞或精细胞总是携带
丰富的线粒体
DEF
&而对于母系遗传的物种!则几
乎不携带
DEF
+
$
,
因此!线粒体
DEF
含量与线粒
体遗传模式呈现出高度的相关性
对于那些双亲或者父系遗传的物种!其生殖细胞
或精细胞都包含线粒体
DEF
!细胞学方法难以对线
粒体
DEF
含量进行准确的测量以前的研究运用定
量
ABC
技术测量了天竺葵精细胞及甜瓜生殖细胞中
线粒体
DEF
含量+,,结果显示$对于双亲遗传的天
竺葵!其精细胞所携带的线粒体
DEF
数量为"
!*$+
,H,#+!
#个&而对于父系遗传的甜瓜!其生殖细胞所
携带的则为"
#!$+%H%#"+$
#个这些定量结果与
这两个物种的线粒体遗传模式呈现出高度的一致
性!即父系遗传的甜瓜在生殖细胞中线粒体
DEF
含量远高于双亲遗传的天竺葵在精细胞中的线粒体
DEF
含量因此!定量研究结果能为我们理解线粒
体的遗传模式提供更为精细的实验数据
黄瓜!作为少数几个线粒体父系遗传的物种之
一!对其生殖细胞中线粒体
DEF
含量的测定还未见
报道本研究通过分离黄瓜生殖细胞!应用竞争型定
量
ABC
技术测量了其内线粒体
DEF
含量!分析生殖
细胞在发育过程中线粒体
DEF
的变化!以明确高丰
度线粒体
DEF
的来源!为进一步研究被子植物调控
线粒体
DEF
扩增的分子机制奠定基础
#
!
材料和方法
@+@
!
实验材料
实验材料黄瓜"
!*&(%)"&
#在自然条件下于
&
"
3
月种植于西北大学果园新鲜的黄瓜花朵取自上
午
#"
$
""
左右!摘取后立即进行后续的实验
@+A
!
方
!
法
@BAB@
!
花粉
$&C
压片
!
在载玻片上!将新鲜花粉
置于
#
滴
DFAG
"
+#
#
<
%
5M
#与固定液"
&_
多聚甲
醛!
_
戊二醛!
"+#5:7
%
M
二甲砷酸钠#的混合液中
静置
%"/
盖上盖玻片后!轻轻用力向一个方向挤
压花粉内容物因受力而被挤压出花粉用莱卡倒
置显微镜
DZG%#""
观察压片!用彩色
BBD
获取图像
@+A+A
!
生殖细胞的分离
!
生殖细胞的分离采用渗
透压冲击的方法+3,将新鲜成熟花粉富集于
%*_
蔗糖溶液中!经过
#5.0
离心后"
#""`
<
#!将上清换
成
#*_
蔗糖溶液以进行渗透压冲击在渗透压变
化的冲击下!花粉将从萌发孔处释放包含生殖细胞
的内容物将生殖细胞在倒置显微镜下用玻璃毛细
管于
#*_
蔗糖溶液中清洗
%
遍后进行富集生殖
细胞的活力用
aDF
染色方法进行检测细胞于
"+"#_aDF
溶液中进行
*5.0
染色后!置于倒置荧
光显微镜下观察
@+A+D
!
生殖细胞的消化处理
!
将富集的黄瓜生殖
细胞转移至
ABC
管中进行消化处理在消化前!细
胞首先经过快速冻融处理以破裂细胞膜消化液的
组成为
"+!` +
,
酶缓冲液"天根#!
*"
#
<
%
5M
蛋白
酶
T
"
Z@V9#消化条件$
*$b
过夜处理消化液
的用量为每个生殖细胞添加
!
#
M

@BABE
!
定量
C2F
!
消化液经过
*b
变性处理
*
5.0
以灭活其中的蛋白酶
T
竞争型定量
ABC
用
于定量实验+,!,定量
ABC
包括
!
轮
ABC
扩增
在第
#
轮
ABC
扩增中!首先!按普通
ABC
反应配制
*
个反应!组分包括
#` +
,
酶缓冲液*
"+!55:7
%
M
=EKA/
*
"+$Q+
,
酶*双蒸水及
"+&55:7
%
M
引物
对"
B5I60#a
%
B5I60#C
#
+
,
,
&其次!向每个
ABC
反
应液中加入
!
#
M
消化液作为模板!其对应于单个生
殖细胞中的线粒体
DEF
数量&最后!向每个
ABC
管中加入不同数量的竞争模板
9556WC
(
"竞争模板
9556WC)
来自甜瓜线粒体
DEF
上的基因
56WC

由于甜瓜的
56WC
在序列上与黄瓜的
56WC
完全一
致!所以
9556WC)
也可以用于黄瓜的定量实验与
56WC
片段相比!
9556WC)
缺失了其内部的
##%U
]

在定量
ABC
反应中!由
9556WC
(与
56WC
所扩增
出的
ABC
产物大小不同!由此可以在凝胶上进行区
分#+,,
ABC
反应条件为
*b
变性
%"/
!
$"b
退火
%"/
!
,!b
延伸
%"/
!共
!"
个循环该反应结束后!
进行第
!
轮
ABC
扩增以第
#
轮的反应液
#
#
M
做
为第
!
轮
ABC
模板!反应循环数为
!!
个循环其
它反应条件如上!仅将引物对换成
B5I60!a
%
B5I60!C
+
,
,

拷贝数的计算根据
!
次
ABC
扩增条带的灰度
值比进行首先!计算
*
个
ABC
反应中
!
条带的灰
度值比&其次!找出灰度值比接近修正系数
"+$&
的
ABC
反应"修正系数为当定量模板与竞争模板为
#c#
时!其扩增的两
ABC
产物的灰度值比#+,,&最
后!用该
ABC
反应来计算线粒体
DEF
的拷贝数!
方法为该
ABC
反应的竞争模板的数量乘以-灰度值
比与修正系数.之比
"%&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
@BABG
!
$#62
H
%
$&C
染色
!
早期的两核花粉及成
熟花粉于固定液中室温固定
&O
固定液组成为$
&_
多聚甲醛!
_
戊二醛!
"+#5:7
%
M
二甲砷酸钠
固定的样品经乙醇脱水后!于
K@9O0:[.W%"&"
树脂
中进行渗透*聚合实验流程按产品厂家建议进行
*""05
厚的切片先于
#
#
<
%
5MD.PB
,
溶液中染
色
%5.0
!用蒸馏水清洗
!5.0
后!再于
"+#
#
<
%
5M
DFAG
溶液中染色
$5.0
+
$
,
所有图像均在同等条件
下拍照获取!以方便后续
DEF
含量变化的分析
为了比较早期生殖细胞与成熟生殖细胞中线粒
体
DEF
变化!统计了这两个发育时期单个线粒体
中的
DEF
含量变化以及整个生殖细胞中的线粒体
数目变化单个线粒体内的
DEF
含量变化对应于
切片上这两个时期单个
DFAG
点的平均灰度值之比
"灰度值在
AO:W:/O:
]
中进行计算#&而线粒体数目
的变化则对应于相同细胞质面积内
DFAG
点的数量
之比!细胞质面积在
AO:W:/O:
]
中可以用总像素点
来表示总的线粒体
DEF
含量变化则用单个线粒
体的
DEF
含量变化与线粒体数目变化之积来表示
!
!
结果与分析
AB@
!
黄瓜生殖细胞内的细胞器
$%&
用花粉压片结合
DFAG
染色技术检测结果显
示!黄瓜生殖细胞的细胞核周围存在大量的荧光点
"图
#
!
F
!箭标所示#!这些核外的荧光点暗示了细胞
器
DEF
的存在而对照拟南芥精细胞的细胞核周
围并无明显的点状荧光信号"图
#
!
Y
#由于遗传学
证据已经显示黄瓜为线粒体父系遗传物种+%,!因此!
这些点状的荧光信号暗示了线粒体
DEF
的存在
尽管黄瓜生殖细胞与拟南芥精细胞在核外细胞
器
DEF
上的
DFAG
染色结果不同!但是!它们在花
粉营养细胞中的染色结果却是相似的!即都不包含
可见的细胞器
DEF
"图
#
!
F
*
Y
#这暗示这
!
个物
种的花粉营养细胞仅携带少量的细胞器
DEF
!其含
量已经低于
DFAG
染色所能观察到的范围这与前
期的观察结果是一致的+$,
A+A
!
黄瓜生殖细胞的分离
为了对成熟黄瓜生殖细胞中的线粒体
DEF
含
量进行准确的测量!我们首先分离*纯化了该细胞
在渗透压变化的冲击下!生殖细胞会伴随营养细胞
F+
箭头所示黄瓜生殖细胞"
LB
#的细胞质中存在大量的
细胞器
DEF
"与拟南芥精细胞图
Y
相比#&
LE+
生殖细胞的
细胞核&
dE+
营养细胞的细胞核&
2E+
精细胞的细胞核
图
#
!
黄瓜生殖细胞携带大量的细胞器
DEF
KO@6VV:;.0a.
<
+FV@
]
V@/@0W/6U?0=60W:V
<
60@76VDEF
.09
>
W:
]
76/5:X9?9?5U@VLB
"
9:5
]
6V@=;.WO/
]
@V59@7
:X-*(./%0.0a.
<
+Y
#&
LE+E?97@?/:XLB
&
dE+E?97@?/
:X[@
<
@W6U7@9@7
&
2E+E?97@?/:X/
]
@V59@7
a.
<
+#
!
FU?0=60W:V
<
60@76VDEF.0
<
@0@V6W.[@9@7
"
LB
#
:X!*&(%)"&
F+
刚从花粉释放的生殖细胞&
Y+
富集的
!
个生殖细胞&
B
*
D+aDF
染色以指示
生殖细胞的活力&
A+
花粉&
LB+
生殖细胞&
F
"
B
图像为
DGB
效果
图
!
!
黄瓜生殖细胞的分离
F+FLB
-
?/WV@7@6/@=
&
Y+KO@9:7@9W@=!LB/
&
B60=D+aDF/W6.0.0
<
W:.0=.96W@WO@69W.[.W
>
:X
LB/
&
A+A:7@0
&
LB+L@0@V6W.[@9@7
&
F(B6V@WO@DGB
]
.9W?V@/
a.
<
+!
!
G/:76W.:0:X
<
@0@V6W.[@9@7/XV:5!*&(%)"&
]
:7@0
#%&
%
期
!!!!!!!!!!!
唐
!
绮!等$黄瓜生殖细胞分离及其线粒体
DEF
的观察与拷贝数定量分析
的细胞质从花粉萌发孔处释放到花粉外"图
!
!
F
箭
头所示#这些游离的生殖细胞可以通过玻璃毛细
管进行小规模富集!图
!
!
Y
显示了富集的
!
个生
殖细胞
aDF
染色显示!分离的生殖细胞在
!O
后
仍具细胞活力"图
!
!
B
*
D
#
ABD
!
黄瓜生殖细胞中线粒体
$%&
拷贝数的定量
分离得到的
!
个生殖细胞!在经过快速的冻融
处理后!于
*3
#
M
消化液中进行消化处理以释放模
板
DEF

!
#
M
消化产物"平均对应于
#
个生殖细
胞#被用来作为单个定量
ABC
反应的模板在每次
的定量实验中!设置
*
个定量
ABC
反应每个
ABC
反应除了包含相同数量的线粒体
DEF
模板
"数量未知#外!还包含不同数量的竞争模板
95)
56WC)
"竞争模板的数量是已知的#从
ABC
产物
的凝胶电泳结果可以看见!随着竞争型模板的逐渐
增加!由其扩增而来的
ABC
产物的条带亮度逐渐递
增"
%%U
]
条带#!同时!由线粒体
DEF
扩增而来的
条带亮度逐渐减弱"
&*!U
]
#这表明两扩增产物在
ABC
反应中表现出明显的竞争关系!暗示了定量结
果是可靠的选取了两
ABC
条带灰度值比接近参
考系数"
"+$&
#的
ABC
反应来计算线粒体
DEF
的
拷贝数"图
%
!
F
"
B
#
%
次实验结果分别为
#"%
个*
3%
个及
##!*
个因此!单个黄瓜生殖细胞平
均携带的线粒体
DEF
拷贝数为"
#"%,H#!$
#个
图
%
!
黄瓜生殖细胞线粒体
DEF
拷贝数的定量分析
a.
<
+%
!
I?60W.X.96W.:0:X5WDEF9:
]
.@/.0
<
@0@V6W.[@9@7:X!*&(%)"&
F
*
Y+
显示早期生殖细胞的
D.PB
,
"
F
#及
DFAG
"
Y
#染色&
B
*
D+
显示成熟生殖细胞的
D.PB
,
"
B
#及
DFAG
"
D
#染色&
F
和
B
中的
D.PB
,
染色显示的是线粒体"
Z
箭头所示#!而
Y
和
D
中的
DFAG
染色指示的则是线粒体
DEF
&
4+
代表单个线粒体
DFAG
荧光的增加值"平均值
H
标准差#&
a+
显示了单位细胞质面积内
DFAG
荧光点数量的增加值"平均值
H
标准差#&
4LE+
早期生殖细胞细胞核&
ZLE+
成熟生殖细胞细胞核&
4LB+
早期生殖细胞&
ZLB+
成熟生殖细胞&
Z+
线粒体
图
&
!
生殖细胞中线粒体
DEF
扩增
F60=Y@eO.U.WWO@D.PB
,
/W6.0.0
<
"
F
#
60=DFAG/W6.0.0
<
"
Y
#
:X5WDEF9:0W@0W/.0@6V7
>
LB
&
B60=D.0=.96W@WO@D.PB
,
/W6.0.0
<
"
B
#
60=
DFAG/W6.0.0
<
"
D
#
.056W?V@LB
&
WO@D.PB
,
/W6.0.0
<
.0F60=B.0=.96W@/WO@5.W:9O:0=V.6
"
Z6VV:;O@6=
#!
;O.7@DFAG/W6.0.0
<
=./
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76
>
/WO@5WDEF9:0W@0W/
&
4V@
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V@/@0W/WO@9O60
<
@:X5WDEF9:0W@0W/U@W;@@0@6V7
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LB60=56W?V@LB
"
5@60H2D
#&
a=@0:W@/WO@9O60
<
@:X5.W:9O:0=V.670?5U@V:99?VV@=.0WO@9
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W:
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76/5
]
@V?0.W6V@6
"
5@60H2D
#&
4LE+46V7
><
@0@V6W.[@
9@70?97@?/
&
ZLE+Z6W?V@
<
@0@V6W.[@9@70?97@?/
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学
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报
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卷
ABE
!
生殖细胞中线粒体
$%&
的扩增
为了调查成熟生殖细胞产生如此高丰度线粒体
DEF
的原因!比较了早期生殖细胞与成熟生殖细胞
中的线粒体
DEF
含量生殖细胞最早出现于小孢
子第一次不对称有丝分裂!这次分裂产生了
#
个体
积较大的营养细胞和
#
个体积较小的生殖细胞"早
期生殖细胞#鉴于早期生殖细胞难以分离!运用切
片技术与
D.PB
,
%
DFAG
染色来研究线粒体
DEF
的变
化在切片上!
D.PB
,
染色能够显示生殖细胞中的线
粒体"图
&
!
F
和
B
中
Z
所示#!其相对应的
DFAG
点
能指示线粒体
DEF
的含量"图
&
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*
D
箭头所示#
结果显示$成熟生殖细胞中的
DFAG
染色点在荧光信
号上是早期生殖细胞的
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倍"图
&
!
4
#!同时!成熟
生殖细胞中的荧光点在单位面积上出现的频率是早
期生殖细胞的
%+%
倍!暗示总的线粒体数目增加了
%+%
倍"图
&
!
a
#因此!在发育过程中!成熟生殖细胞中
的线粒体
DEF
含量增加为早期生殖细胞的
#&+*
倍
这表明成熟生殖细胞中的线粒体
DEF
主要来自于生
殖细胞形成后其内活跃的线粒体
DEF
扩增
%
!
讨
!
论
在本研究中!我们定量分析了黄瓜生殖细胞中
的线粒体
DEF
数量黄瓜生殖细胞平均携带
"
#"%,H#!$
#个线粒体
DEF
拷贝这与同属植物
甜瓜生殖细胞的线粒体
DEF
含量相似"
#!$H
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#
+
,
,
如此高丰度的线粒体
DEF
主要来自于生
殖细胞内活跃的线粒体
DEF
扩增这包括两方面
的原因$单个线粒体内
DEF
含量的增加以及生殖
细胞内总线粒体数量的增加这可能是黄瓜线粒体
父系遗传的主要原因
基因组测序结果表明!黄瓜核基因组和线粒体
基因组的大小分别为
!&%+*ZU
与
#*$3\U
+
#")##
,

在成熟生殖细胞中"核基因组的复制已经完成#!其
核
DEF
的含量为
&3,ZU
!而线粒体
DEF
的含量
为
#$!$+"ZU
"
#"%,` #*$3\U
#因此!黄瓜生殖
细胞所携带的线粒体
DEF
含量是其核
DEF
含量
的
%+%
倍这种核外线粒体
DEF
含量大于核
DEF
含量的现象在植物细胞中并不常见目前!仅
在天竺葵卵细胞中报道过+#!,考虑到核基因组与
线粒体基因组共用了一些与
DEF
复制相关的原
料!这提示生殖细胞中可能存在某种机制使得线粒
体能高效地利用
DEF
复制所需要的各种物质
在被子植物中!体细胞平均携带约
*"
个线粒体
DEF
拷贝+,!#%,在体细胞的分裂过程中!线粒体
DEF
仅复制
#
倍后平均分配到
!
个子细胞中目
前!我们并不清楚是什么机制维持了体细胞中的线
粒体
DEF
仅发生
#
倍的增加/ 但是!与体细胞不
同!黄瓜生殖细胞却发生了
#&+*
倍的线粒体
DEF
扩增这表明体细胞中维持线粒体
DEF
数量的机
制在黄瓜生殖细胞中并不能正常行使功能因此!
在黄瓜生殖细胞中!可能存在或者缺失了某些因子!
使得线粒体
DEF
发生了超量复制解析这些因
子!有助于我们理解线粒体
DEF
数量控制的基本
生命科学问题近来!研究者们已用
CK)ABC
方法
从分离的百花丹与烟草精细胞构建了各自的
9DEF
文库+#&)#*,!进而解析了大量精细胞表达的基因利
用该方法并结合黄瓜生殖细胞的分离技术!使得我
们可以获得黄瓜生殖细胞的转录组&同时!鉴于黄瓜
基因组的测序已经完成!这使得我们可以利用黄瓜
生殖细胞作为实验材料来研究被子植物调控线粒体
DEF
扩增的分子机制
参考文献!
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封面植物介绍"""陕西羽叶报春
陕西羽叶报春"
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#隶属于报春花科报春花属!一年生草本!株高
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&"95
!全株
被多细胞柔毛地上茎短或者近于无!须根少数或多数叶多枚簇生!叶片卵形或卵状披针形!带叶柄长
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"
#*95
!宽
!
"
*95
!先端圆钝!羽状全裂!羽片
%
"
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对!长
3
"
!*55
!小裂片再不整齐浅裂&裂片两面均密
生灰白色短茸毛&叶柄长
!+*
"
*+*95
!被腺毛!基部宽扁花葶高
3
"
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!常
#
"
多数自叶丛中抽出!中
空!外被银白色粗腺毛伞形花序具
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"
#"
"
"
#!
#花!花梗长
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"
!+*95
&苞片线状披针形!长
3
"
#"55
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花萼圆锥状!长
*
"
#"55
!外被粗毛!宽约
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!先端
*
"
$
裂!裂片披针形!果期增大成圆锥状钟形&花冠
初开时为紫色!开放后为粉红色!冠檐直径
#+*
"
!+*95
!下部呈管状!管部长
*
"
355
!冠筒长于花萼约
#
%
&
&上部花冠于花萼外
*
深裂!裂片倒心形!每裂片先端再
!
浅裂!裂片先端圆!粉红并略带蓝紫色!裂片基
部有倒心形先为橘黄色后渐变为紫红色的彩斑花柱异长!长花柱花$雄蕊着生于冠筒近中部!花丝短或者
近无&花药黄色&花柱长约
$
"
355
!柱头略高于筒口&短花柱花$雄蕊常生于近花冠裂口处内侧&花柱内藏
于花冠筒下部!长
&
"
*55
!柱头圆形!绿色子房球状!胚珠多数!特立中央胎座蒴果球形!外果皮膜质!
成熟后不裂或者顶裂&种子圆球状!直径
#+*55
!成熟后黑褐色!有皱纹花期
!
"
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月!果期
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*
月
陕西羽叶报春为中国特有物种!陕西省地方重点保护植物一般生于海拔
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"
#"""5
天然次生落叶
阔叶林下*湿润且多砂石土壤上分布地较为狭窄!自
#"&
年
!
月德国植物学家
S+a.79O0@V
在陕西南部的
秦岭山区采到模式标本后!百余年来再未见到存活的植物
!""$
年在湖北省重新发现!
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年
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月在陕西
省也被重新发现
!图文由陕西师范大学生命科学学院
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张建强提供#
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西
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北
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学
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报
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卷