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Acquirement of Transgenic Chinese Cabbage with BmkIT-Chitinase Gene and Their Insect -resistant Bioassay

转双价抗虫基因大白菜新种质的获得及其抗虫性分析



全 文 :书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$科技援疆项目"
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#
作者简介$兰创业"
#+&"
#!男!硕士!助理研究员!主要从事大白菜种质资源创新研究
2(34/5
$
#)!)"*)#%&
!66
,783
转双价抗虫基因大白菜新种质的
获得及其抗虫性分析
兰创业#!刘
!
钊#!贾晓军!!周
!
进!
"
#
山西省农业科学院 蔬菜研究所!太原
"%""%#
&
!
新疆建设兵团 第六师农业科学研究所!新疆五家渠市
&%#%""
#

!
要$采用超声波辅助花粉介导方法!将双价抗虫基因
!"#$%&()*)+,-.
导入早熟型大白菜自交系
!"(#+(%
!最终
获得了
*
个转基因大白菜优良自交系纯合株系
9#(*
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(
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(
9##($

9!"(#%
&以转基因大白菜株系和非转基因
对照植株为材料!对
!"#$%&()*)+,-.
基因在大白菜中的遗传规律(基因表达及抗虫性进行进一步分析结果显
示$"
#
#转化株后代多代"
:
#
"
:
)
#
;<=
(
>8?@ABC1D58@@/1
E
等分子跟踪检测表明!目的基因已成功导入受体植株!且
能够稳定遗传&用该转基因方法对大白菜进行基因转化所获得的转基因植株分析显示!外源基因多数以多拷贝形
式整合于核基因组!少部分外源基因以单拷贝形式整合"
!
#
25/04
分析结果证明!所导入的外源基因可高效表达!
:
)
代株系新鲜叶片中表达产物量最高达到
","$+
#
E
)
E
#左右"
%
#转基因株系田间抗虫性统计分析表明!转化
株系与对照在抗虫性方面有显著差异!其对小菜蛾及菜青虫抗性普遍提高
!
"
%
级研究认为!转
!"#$%&()*)&
+,-.
基因大白菜中
!"#$%&()*)+,-.
基因的表达可有效提高大白菜的抗虫性
关键词$大白菜&花粉介导&
!"#$%
基因&
()*)+,-.
基因&双价抗虫基因
中图分类号$
F-&*
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F-&$
文献标志码$
G
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1
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J
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E
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C847A400/0@BR
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X
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E
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E
B1/734@BC/450YBCB
783
X
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X
5/S/74@/8141R>8?@ABC1D58@A
J
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@C410
E
B1/7
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541@041R@AB/C
X
C8
E
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E
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J
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E
B1/70BQ/0@/13?5@/(78
XJ
S8C341R
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E
B1/704
XX
B4CBR/1SBY@C4105/1B0,
"
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ZBC/S/BR@ABBQ
X
CB00/818SS8CB/
E
1
E
B1B
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X
CB00/81
X
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B1/7
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1
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5
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E
B1B
!!
大白菜"
!0,--)7,7,"
1
.-*0)-H,00
X
,
1
.#)+.+&
-)-
#起源于中国!又称结球白菜(白菜等!是中国乃
至亚洲重要的栽培食用蔬菜之一由于其富含维生
素(糖(矿物质等营养成分!深受广大消费者喜食
但在大白菜的栽培过程中!虫害一直是影响其高产(
稳产及品质的重要制约因素!其中!菜青虫"
/).0)-
0,
1
,.H,
#(菜螟"
8.2232,3+9,2)-
#和小菜蛾"
/23&
*.22,4
5
26-*.22,
#等鳞翅目昆虫对其危害尤为严
重*#+由于白菜类蔬菜作物中缺乏有效的抗虫资
源!无法通过常规手段培育出抗虫白菜类蔬菜作物
品种*!+因此通过生物技术手段对其进行抗虫基因
转化及改造成为大白菜转基因育种研究的重要
内容
近年来!通过农杆菌介导等转基因方法!已经相
继获得了转雪花莲凝集素基因*%+(马铃薯蛋白酶抑
制剂基因*)+(豇豆胰蛋白酶抑制剂基因*($+(慈姑胰
蛋白酶抑制基因*$+和苏云金芽孢杆菌基因*-+等抗虫
大白菜新种质!但国内外最主要的(应用最广泛还是
源自苏云金芽胞杆菌基因的转
!*
杀虫晶体蛋白基

70
5
#:;

70
5
#:7
白菜*-+尽管如此!转基因抗
虫大白菜与其它转基因抗虫作物"转
!*
杀虫晶体蛋
白基因玉米(棉花等#相比!其抗虫性普遍较差!这可
能与抗虫目的基因在白菜类蔬菜作物中的表达水平
偏低有关*#+&另外!单抗虫基因的转化!抗虫谱较窄!
它只对某几种或一小类害虫具有毒杀作用!易使害
虫产生耐受性因此!开发培育新型抗虫基因!联合
使用
!
种或
!
种以上不同杀虫机制的抗虫基因对大
白菜转化是极其重要的
昆虫特异性蝎神经毒素是来源于东亚钳蝎神经
毒素中的一种富含生物活性的多肽物质!其对昆虫
有专一性麻痹致死作用!而对哺乳动物无害或毒性
很小!因而被广泛应用于生物杀虫剂和抗虫转基因
植物的研究*&+在转蝎神经毒素基因抗虫植物研究
方面!
U4C@81
等*++首先将昆虫蝎毒素基因
:,$%
(
!.$%#

!.$%!
等转入烟草!表明了其对棉铃虫
幼虫有较强的致死性姚斌等*#"+将蝎毒素基因
:,
$%
基因转入烟草!监测到杀虫活性
W?
等*##+也将
昆虫蝎毒素基因
:,8$%
基因转入棉花中!使其对
棉铃虫的致死率到
))^
"
+&^
而对于鳞翅目昆
虫而言!几丁质是其消化道内壁和身体表皮的重要
组成部分!昆虫在蜕皮时分泌几丁质酶以分解几丁
质!并蜕掉旧皮如果将昆虫几丁质酶导入植物!使
其在植物中持续表达!就会阻止入侵害虫的正常发
育!从而起到保护植物的作用在转昆虫几丁质基
因抗虫植物研究方面!
V8
X
454_C/0A141
等*#!+首次将
烟草天蛾几丁质酶基因插入苜蓿丫纹夜蛾核型多角
体病毒中!使其对草地贪夜蛾半致死时间大大下降
/`1
E
等*#%+也将烟草天蛾几丁质酶基因通过农杆菌
:/
质粒介导转化到烟草中!获得了抗烟蚜转基因植
株!但对烟草天蛾幼虫抗虫性不明显郝曜山等*#)+
将烟草夜蛾几丁质酶基因与东亚钳蝎神经毒素基因
双价基因导入玉米中!所获得的转基因玉米植株对
玉米螟表现出明显抗虫性在转基因植物安全性日
益受到重视的情况下!对这
!
种基因转化进行研究
并完善!将会有良好的应用前景
本研究通过自己发明的超声波辅助花粉介导的
方法!将克隆构建的含有东亚钳蝎昆虫特异性神经
毒素基因
!"#$%
*
-
+与具有广谱杀虫作用的烟草夜
蛾几丁质酶基因
()*)+,-.
*
-
+的双价抗虫基因!导入
早熟型大白菜自交系
!"(#+(%
中!获得了包含
!"&
#$%

()*)+,-.
基因的转基因植株!通过对转化株
后代进行多代的
;<=
(
>8?@ABC1D58@@/1
E
等分子跟
踪检测及田间抗虫性鉴定和观察!最终获得了稳定
遗传的转
!"#$%&()*)+,-.
双价抗虫基因大白菜
并证实了转基因植株及其后代对
!
种鳞翅目昆虫的
抗性作用!丰富了转基因大白菜抗虫材料
#
!
材料和方法
<,<
!
试验材料
本研究所用受体材料为早熟型大白菜自交系
!"(#+(%
!株高
)"73
!开展度
%*73a%*73
!生育期
*"R
!外叶绿色!叶肋成白色!黄心!在太原地区周年
可以种植由山西省农业科学院蔬菜研究所培育
研究使用的农杆菌菌株为
HUG))")
!重组质粒
X
UK#"#(U3_K:(7A/
携有东亚钳蝎昆虫特异性神经
毒素基因 "
!"<$%
#(烟草夜蛾几 丁质 酶基因
"
()*)+,-.
#及
+
1
*
$
抗性基因等!载体所用的启动
子为花椰菜花叶病毒的
<4]T(%*0
启动子!终止子

:/
质粒中胭脂碱合成酶基因的终止序列
180
!该
菌株质粒由山西省农业科学院生物技术研究中心提
供"图
#
#
<,=
!
转化和筛选
将经过低温春化处理的大白菜自交系
!"(#+(%
+
#

!!!!!!!!!!!
兰创业!等$转双价抗虫基因大白菜新种质的获得及其抗虫性分析

#
!
质粒
X
UK#"#(U3_K:(
[/
E
,#
!
;5403/R
X
UK#"#(U3_K:(
幼苗!于春天移栽入专用实验田!在其开花期每日上

#"
$
""
"
##
$
""
采集新鲜花粉!置于
!""
E
%
H
蔗糖
缓冲溶液中进行超声波预处理!超声波预处理参数
为功率
#""W
!工作时间
*0
!间隔
#*0
!工作
*

加入质粒
I`G
后!再次对花粉悬浮液进行超声波
处理!处理功率
#*"W
!其他参数同前将处理好的
花粉滴加
#""3
E
%
H
硼酸和
!""3
E
%
H
硝酸钙后快
速涂抹于待转化柱头上!以促进其花粉萌发授粉
后用防虫网袋隔离并标记
将收获的
:
"
代种子用
-"^
酒精灭菌后播于铺
有浸湿滤纸的培养皿中!卡那霉素发芽筛选浓度为
#*"3
E
%
H
!
&b
下光照培养!
%
"
)R
后根据其出芽
情况!子叶及真叶颜色变化!初步筛选确定卡那霉素
抗性苗!并将其移到营养钵中继续培养!待苗壮后于
)b
下低温春化处理
#
月!转到大盆并置于温室栽
培!准备进行分子检测并通过蕾期授粉以收获种子
得到自交后代
<>?
!
转化株
@A$
提取及
B2C
检测
取其嫩叶提取总
I`G
!提取
I`G
方法采用本
单位改良的
<:GU
法*#*+"提取缓冲液中加入
",*^
乙基黄原酸钾!将
I4的浓度提高至
!,*385
%
H
!
可使大白菜提取的
I`G
浓度及质量大大提高#
使用提取的卡那霉素抗性植株
I`G
模板进行
;<=
扩增!扩增过程中以未转化大白菜基因组
I`G

阴性对照!无菌水为空白对照!质粒为阳性对照
()*)+,-.
基因上游引物"
*c(G:V#和下游引物"
*c(::VGGV<(%c
#!扩增片段大小为
#&""D
X
扩增采用
!"
#
H
体系!
;<=
扩增程序为
+*b
预变性
*3/1
!
+)b
变性
%"0
!
**b
退火
#3/1
!
-!b
延伸
!3/1
!
%*

循环!
-!b
终延伸
#"3/1

;<=
产物
)b
保存!
#,"^
琼脂糖凝胶电泳检测分析
!"#$%
基因上游引物"
*c(G:VGGG:::::<(
<::G:G(%c
#和下游引物"
*c(::GG<::VVG<(%c
#!扩增片段大小为
!&"D
X
扩增时采

!"
#
H
体系!
;<=
扩增程序为
+* b
预变性
*
3/1
!
+)b
变性
%"0
!
**b
退火
%"0
!
-!b
延伸
%"
0
!
%*
个循环!
-!b
终延伸
#"3/1
保存
;<=
产物!

#,"^
琼脂糖凝胶电泳检测分析
将重复均扩增出
!
个外源基因阳性条带的植株
确定为转化株引物合成是由上海生工生物工程公
司完成
<>D
!
转基因植株
E",3)(+4F",,#+
1
检测

;<=
检测
:
!
代呈阳性株的大白菜提取总
I`G
为待测样品!以非转基因大白菜
I`G
为阴性
对照!阳性对照质粒
I`G
!用
8)+R
%
酶对待检测样
品进行酶切!将酶切产物于
#,!^
琼脂糖凝胶上电
泳分离!进行
>8?@ABC1D58@@/1
E
杂交检测试验中!
I`G
探针分别使用外源基因
()
基因
#&""D
X

!"#
基因
!&"D
X
的全长基因
>8?@ABC1D58@@/1
E
试验按照
=87AB
公司的
K`V I`G H4DB5/1
E
41R
B`@B7@/81d/@
试剂盒的说明书进行具体实验如
I`G
变性(转移及杂交方法!杂交后用
N(
光片自显
影曝光参照,分子克隆-*#$+
<>G
!

%1234+56-#-/$7)
基因白菜的
HF#0/
检测
为对外源双价抗虫基因在受体内表达水平进行
定量分析!选取
()*)+,-.
标准样品按每孔
#""1
E
"
#
%
#"
#
1
!
1e#
"
#"
的标准稀释
#"
个浓度梯度!作
为阳性对照!以水为空白&以非转化大白菜蛋白为阴
性对照!制作标准曲线所有样品的
)"*13
光吸
收值均取
%
次重复测定结果的平均值*#-+
<,I
!
转化大白菜抗虫鉴定
!
#
"田间网室抗虫鉴定
!
选取
%
代以上稳定遗
传的转
!"#$%&()*)+,-.
基因白菜于专用温室内鉴
定材料于
!"#)

)
月播种育苗!待幼苗
)

#

后将其移栽入温室中!和非转基因对照白菜单行种
植!每份材料种植重复
%
次取羽化历期基本一致
的小菜蛾成虫"雌雄各半#按虫苗比
#f#"
接虫
!
"
%
周后对叶片危害情况进行调查
!"田间抗虫鉴定
!
选取
%
代以上稳定遗传的

!"#$%&()*)+,-.
基因白菜与非转基因大白菜!
在实验田内双行相间种植!全生育期少打或不打农
药防治!在春秋两季菜青虫高发期进行田间统计观
察分析
!
%
"实验室菜青虫饲喂实验
!
选取
%
代以上稳
定遗传的转
!"#$%&()*)+,-.
基因白菜与非转基因
大白菜!在实验室培养皿内进行菜青虫饲喂实验
菜青虫为田内人工抓取!每培养皿接虫
#"
条!放大
"#
西
!

!

!

!

!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$

小基本相同叶片饲喂
#!A
后拍照观察并分析统计
以上鉴定方法均根据叶片的咬食情况分级!抗
性分级参考王欣*#&+的抗性调查方法和分级标准
咬食级$网室田间鉴定危害情况&
"
级无虫$全部叶
片生长正常&
#
级有虫$叶片有轻微危害症状!有小
孔!但小孔不相连&
%
级有虫$叶片危害症状较严重!
叶片小孔相连!但叶片完整&
*
级有虫$叶片危害症
状严重!叶片有大洞!但叶片基本完整或有大量叶片
残余&
-
级有虫$叶片危害症状极为严重!叶片仅剩
叶脉及不完整叶片
!
!
结果与分析
=><
!
转基因大白菜
.
J
代种子的获得及其卡那霉素
抗性初步筛选
将超声波处理过的含有外源基因双价抗虫基因
表达构件
X
UK#"#(U3_K:(
的大白菜花粉!人工
涂抹于待转化花序"蕾期#上共处理大白菜
%"
株!
由于处理后的花粉萌发率较低!最终获得
:
"
代种

$"""
余粒
转化获得的转
!"#$%&()*)+,-.
基因大白菜应
同时被赋予卡那霉素抗性!本试验对
:
"
代种子进
行了卡那霉素抗性筛选首先!分别将非转基因大
白菜种子在铺有浸湿滤纸的培养皿中培养!浸湿滤
纸附加卡那霉素浓度分别为
"
(
*"
(
#""
(
#*"
(
!""
(
!*"
(
%""3
E
%
H
*
#+
+
!最终可以看到
#*"3
E
%
H
浓度正
好可抑制全部非转基因大白菜的种子正常生长萌动
后子叶发黄以至死亡"图
!
!
G
#!因此!以浓度
#*"
3
E
%
H
定为导入后代的卡那霉素抗性筛选浓度最
终在该浓度下
:
"
代种子培养共获得
:
#
代抗性苗
*-

=>=
!
转基因大白菜
B2C
检测
将初步获得的卡那霉素抗性苗继续培养并移栽
到温室待苗壮后全部取样并提取总
I`G
进行
;<=
检测重复
%
次结果表明!
:
#
代植株扩增
出约为
#&""D
X
()*)+,-.
基因特异条带的阳性植
株有
!$
株!扩增出约
!&"D
X
!"#$%
基因特异条带
的阳性植株有
%#
株!双基因同时被检测到的阳性植
株为
!*

;<=
结果条带清晰!少有杂带!和阳性
对照大小一致&阴性对照(水对照均未扩增出目的条
带!双基因同时检出重合率较高!表明操作过程中无
污染!结果可靠图
%
为部分转基因株系的检测
结果
:
#
代双抗虫基因检测为阳性植株经蕾期人工
自交授粉获得后代种子!经低温春化后继续种植获

:
!
代转基因大白菜!对其进行
;<=
检测!检测阳
性植株继续种植!连续
%

;<=
跟踪"表
#
只列出
了部分典型材料统计数据结果#
从表
#
中可以看到!利用超声波辅助花粉介导
法转化所获得的
:
#
代株系在其后代多代
;<=
分子
检测时!如果把所获得的目的性状外源基因作为显
性性状的话!按照孟德尔分离规律理论!其
:
!
(
:
%

:
)
代检测阳性比率在后代整个群体中性状分离
比率应为
%f#
(
*f#

+f#
!但在实际检验时其分
离比率出现
%
种情况!如表
#

9#(*
(
9!(-
转化事
件中!其检测结果后代分离比率与预期比率是基本
拟合的!符合孟德尔遗传分离规律!但这部分材料只
G,
非转基因种子在
#*"3
E
%
H
浓度卡那霉素水溶液培养"
#
#&
U,:
"
代转化种子在
#*"3
E
%
H
浓度
卡那霉素水溶液培养&
<,
非转基因种子在
"3
E
%
H
浓度卡那霉素水溶液培养"
!
#

!
!
:
"
代种子卡那霉素筛选
G,I8@
E
B1B@/745
J
38R/S/BR0BBR0/1@AB7817B1@C4@/818S#*"3
E
%
H_4143
J
7/14
6
?B8?0085?@/81
"
#
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"
E
B1BC4@/810BBR0/1@AB7817B1@C4@/818S#*"3
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H_4143
J
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6
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E
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"E
B1BC4@/81
##
#

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兰创业!等$转双价抗虫基因大白菜新种质的获得及其抗虫性分析

<
!

%1234+56-#-/$7)
基因大白菜植株
B2C
检测结果
:4D5B#
!
:AB;<=4145
J
0/08S@C410
E
B1/7
E
B
X
541@0
转化事件
I8,8S
043
X
5B0
:
!
"预期阳性率
-*^
#
:
!
E
B1BC4@/81
"
BQ
X
B7@4D5BC4@/8-*^
#
阳性率
=B
6
?B17
J
8S
X
80/@/ZBCB0?5@
%
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&
!
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"预期阳性率
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B1BC4@/81
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&
;,
阳性对照&
U,
空白水对照&
I,
阴性对照&"
G
#
"
#&
("
U
#
"
#*,
转基因植株

%
!
部分转基因大白菜的几丁质酶基因"
G
#和蝎毒基因"
U
#
;<=
检测结果
],`H!"""
&
;,;80/@/ZB781@C85
&
U,U541_Y/@AY4@BC
&
I,IB
E
4@/ZB781@C85
&"
G
#
#&
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U
#
#*,:C410S8C3BR
X
541@0
[/
E
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X
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E
B1B
"
G
#
41R!"#$%
E
B1B
"
U
#
X
541@0RB@B7@BRD
J
;<=
占所获得转化事件
#
%
*
&另一情况材料在所获得转
化事件中占大多数!如
9!(%
(
9*(#
检测结果显示!其
:
!
代似乎就已经高度纯合!检测结果阳性率远高于
理论值!不符合孟德尔遗传!考虑到所使用的转基因
方法!推测这些转化事件中!外源基因并不是以单拷
贝存在!而是多拷贝!多整合位点存在&第三种情况
只在个别转化事件中发现!如
9-(%

:
!
代材料检测
中只表现出极低的阳性率!将阳性植株再种植到
:
%
代时未能检测出阳性植株
=>?
!
转基因大白菜
E",3)(+
检测

:
!

;<=
检测仍呈阳性的植株进行了
>8?@ABC1D58@@/1
E
杂交检测检测结果表明"图
)
#!
;<=
检测的
!*
个转化事件中!有
#+
个转化事件的
后代检测到双基因特异性杂交信号初步证明外源
抗虫基因已经成功整合到了大白菜自交系基因组
中同时!
>8?@ABC1D58@@/1
E
杂交检测结果呈阴性!
;<=
检测结果呈阳性的几个转化事件在
:
%

;<=
G,
几丁质酶基因&
U,
蝎毒基因&
;,
质粒&
I,
非转基因大白菜&
#
"
),
转基因大白菜

)
!
部分
:
!
代植株的
>8?@ABC1D58@@/1
E
杂交结果
G,()*)+,-.
E
B1B
&
U,!"#$%
E
B1B
&
;,;5403/R
&
I,I81(@C410S8C3BR
X
541@
&
#),:C410S8C3BR
X
541@0
[/
E
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!
;4C@8S:
)
@C410S8C3BR
E
B
X
541@0
/RB1@/S/BRD
J
>8?@ABC1D58@@/1
E
检测也均表现为阴性结果!再次证明了转化过程中
存在少部分假阳性事件而对
>8?@ABC1D58@@/1
E

交检测结果进行分析表明!用该转化方法对大白菜
进行基因转化时!大部分转化事件为多拷贝(多位点
整合到大白菜基因组中
!#
西
!

!

!

!

!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$

=>D
!
转双价抗虫基因大白菜的
HF#0/
检测

:
)

;<=

>8?@ABC1D58@@/1
E
杂交双基因
均呈阳性反应的转基因植株进行
25/04
分析基于
导入的外源基因为双价抗虫基因!本研究只对导入

()*)+,-.
基因进行了蛋白表达浓度测定首先!
用酶联免疫检测仪测定
7A/
标准样品
)"*13
光吸
收值!以蛋白质量浓度为横坐标!以
)"*13
光吸收
值为纵坐标!应用
>/
E
34;58@
软件制作
25/04
检测标
准曲线*#-+!相关性分析表明!标准蛋白相关系数为
",++!
!线性回归方程为
5
e"=-"*4g","")
!之后!
利用酶联免疫检测方法!分别对各转化事件后代纯
合材料和阴性对照进行
)"*13
光吸收值测定!并
根据标准曲线计算各被检样品的
蛋白浓
度!部分结果如图
*

检测结果显示!来源于
9#(*
转化事件中的
9#(
*(%
株系!外源基因表达的几丁质酶表达量最高!鲜
叶片含量达到
","$+
#
E
)
E
#
而在转化事件中占
大多数的多拷贝(多整合位点的转化株"如表中
9!(
%
(
9*(#
等#在该检测中表达量反而远低于单拷贝的
转化株系"如
9#(*
(
9!(-
等#!这也与后期虫试结果
基本吻合
=,G
!
转双价抗虫基因大白菜抗虫性网室及田间观
察鉴定
对所获得的经各代分子检测均为阳性!严格经
过蕾期人工授粉所获得的转基因大白菜自交系
:
)
代进行网室及田间抗虫性观察鉴定"图
$
#统计分
析显示"表
!
#!各转化事件
:
)
代植株抗虫性与对照
相比有显著差异!其对小菜蛾及菜青虫抗性普遍提

!
"
%
级!并且抗虫性能够稳定遗传
从表
!
可以看到!各转化事件不仅与对照受体
间在抗虫性方面差异达
*^
显著性水平!其相互之
间也存在差异!如
9#(*
(
9!(-
和其他转化事件如
9+(
$
(
9#+(#
等相比!在抗虫性上也表现出很高的优势

$
可以直观看到部分转基因大白菜与对照在田间
与实验室人工饲喂的结果差异显著产生这种差异
的原因和外源基因的插入位点(拷贝数的多少及外
源基因在宿主细胞内表达量的多少相关田间抗性
结果与前期的分子检测结果基本吻合

*
!
部分转基因大白菜株系目的基因的
25/04
检测结果
[/
E
,*
!
25/044145
J
0/08S7A/@/140B
E
B1B/1
X
4C@
@C410
E
B1/7
E
B
X
541@0

=
!
部分转基因
.
D
代植株抗虫性田间鉴定
:4D5B!
!
>@4@/0@/7CB0?5@8S/10B7@CB0/0@417B8S083B:
)
@C410S8C3BR
X
541@0/1@ABS/B5R
材料编号
H/1B
1?3DBC
小菜蛾各抗性级别植株比率
K10B7@/7/R45C4@/88S@C410
E
B1/7
E
B@8R/4381R38@A
%
^
"
"
#

HBZB5"#
%

HBZB5%
*

HBZB5*
-

HBZB5-
菜青虫各抗性级别植株比率
K10B7@/7/R45C4@/88S@C410
E
B1/7
E
B@8/=0,
1
,.H,
%
^
"
"
#

HBZB5"#
%

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*

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-

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注$不同小写字母表示转基因株系与对照受体间抗虫性差异达到
","*
显著性水平
I8@B
$
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E
B1/75/1B041R781@C85
X
541@4@@AB","*5BZB5,
%#
#

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兰创业!等$转双价抗虫基因大白菜新种质的获得及其抗虫性分析
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非转基因对照&
D
"
S,
部分转基因大白菜$
D,\#(*
&
7,\!(-
&
R,\#+(#
&
B,\+($
&
S,\!"(#%

$
!
转基因大白菜植株田间对小菜蛾"
G
#和菜青虫"
U
#饲喂抗虫性分析
4,I81(@C410S8C3BR
X
541@0
&
DS,>83B@C410S8C3BR
X
541@0
$
D,\#(*
&
7,\!(-
&
R,\#+(#
&
B,\+($
&
S,\!"(#%
[/
E
,$
!
K10B7@(CB0/0@41@4145
J
0/08S@C410
E
B1/7
E
B@8R/4381R38@A
"
G
#
41R/=0,
1
,.H,
"
U
#
/1@ABS/B5R
%
!

!

本研究首次实现了利用超声波辅助花粉介导法
对大白菜自交系的转化!尽管在所获得的
$"""
余粒
种子中通过初筛及分子检测最终只得到
!*
个转化
事件!转化效率仅为
",)^
但使用该方法不经过
组织培养!当代就可以获得种子!有效地避免了组织
培养基因型限制(周期长等问题!其操作简单(费用
低廉!不失为一种优秀的白菜转化基因方法在研
究过程中也发现!该方法在大白菜所获得的转化事
件中外源基因在宿主基因组中以多拷贝(多位点整
合方式存在较多!这与杜建中等*!"+在玉米(王景雪
等*!#+在芥菜等作物上转化结果不同!在一定程度上
降低了其转化效率在转化过程中也发现转化事件
中存在一定的假阳性事件!也存在双基因只检测出
一个基因!而另一个基因检测不到的情况!证明该方
法在转化过程中只有部分基因导入的现象!这可能
与前期超声波处理质粒结构破损有关!这与郝曜山
等*#)+在玉米上结果是相同的
本研究所获得转基因大白菜新品系在温室及田
间的抗虫性鉴定结果证明了双价抗虫基因
!"#$%&
()*)+,-.
编码的
!
种杀虫蛋白对鳞翅目害虫有较
好的抗性
!
种抗虫基因在大白菜中同时表达!可
以有效地避免该种蔬菜大面积种植时田间害虫对该
基因表达的蛋白产生抗性及耐受性鉴于其与商业
上广泛采用的
U@
杀虫晶体蛋白完全不同的杀虫机
)#
西
!

!

!

!

!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$

理!及其专一作用于昆虫体内特殊靶标位点而对哺
乳动物无害的特性!认为对该新品系的研发一方面
丰富了大白菜的抗虫基因材料!另一方面也可以有
效解决鳞翅目害虫抗性风险
对所获得的转化事件从
:
#
代到
:
)
代进行了
;<=
(
>8?@ABC1D58@@/1
E
杂交和外源基因表达的蛋
白等分子检测!并以此结果为依据对大白菜自交系
进行了选择!最终获得了较纯合的转
!"#$%&()*)&
+,-.
基因大白菜新品系在此过程中!双价抗虫基

!"#$%&()*)+,-.
在大部分材料中能够随白菜核
I`G
稳定遗传!且其蛋白表达检测与田间抗虫鉴定
结果表现出较高的一致性但在各代跟踪检测调查
中!也发现了很多外源基因在各代遗传中并没有符
合现有的遗传规律!如材料
\!(#
(
\*(#
等在
:
!
代的
;<=
检测中似乎就表现出很高的纯合率!后来的
>8?@ABC1D58@
杂交检测证明了该转化事件中外源
基因是以多拷贝的形式存的!结合该材料的分离情
况!我们推测此事件中外源基因不仅存在多个拷贝!
而且其整位点应该处于多条染色体上研究中还发
现了小部分材料!如
9-(%
等!其在
:
#

:
!
代材料

;<=
检测呈阳性!且其阳性率较低!而在
:
%
代材
料后均检测不到阳性植株!
>8?@ABC1D58@@/1
E
杂交
检测结果为阴性!排除了污染等实验室人为情况!此
假阳性事件是如何继续到
:
!
代的!推测是否存在
伴随母体的细胞质遗传!在这些方面我们将会进一
步深入研究
在转
!"#$%&()*)+,-.
基因大白菜遗传稳定的
株系中!尽管经分子检测选择抗虫基因已基本纯合!
其田间抗虫性与对照表现出明显差异!但不同株系
间抗虫性程度也存在明显差异!研究表明!外源基因
的拷贝数与外源基因的表达及田间抗虫性相关高
拷贝数基因表达及田间表现反而低于低拷贝数的转
化事件!这与郭美锦等*!!+和
O8AB1D5?3O
等*!%+在
毕赤酵母上的外源基因表达研究结论是相似的同
时也发现!同样为单拷贝的转化事件在田间抗虫程
度方面也存在较大的差异!这可能和外源基因的插
入位点及方式也有一定的相关性因此!在选育转
双价抗虫基因大白菜新品系时!还结合了田间调查!
与常规育种技术相结合逐代选留了具有较高抗虫性
的单株(自交留种和单株播种方法!最终获得了
*


!"#$%&()*)+,-.
双价抗虫基因大白菜优良自交
系!这些自交系所导入的外源基因可高效表达!在田
间抗虫性表现与对照有显著差异!抗性普遍提高了
!
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大白菜转修饰豇豆胰蛋白酶抑制
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