全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(2): 131-138(2012)
收稿日期: 2011-04-25; 修回日期: 2011-10-29
基金项目: 国家自然科学基金(30970133); 高等学校博士学科点基金(20100204110004); 高等学校学科创新引智计划(B07049)
通讯作者: 吴云锋, 教授, 主要从事植物病毒方面的教学和研究; Tel:029-87092716, Fax: 029-87092716, E-mail:wuyf@nwsuaf. edu. cn
第一作者: 李正男(1983 - ), 男, 吉林白城人, 博士研究生, 主要从事植物病毒分类与鉴定方面的研究工作; Tel: 13474027851,
E-mail: lizhengnan-007@163. com。
丁香卷叶病植原体的分子鉴定
李正男1, 张 磊2, 吴云锋1*
( 1旱区作物逆境生物学国家重点实验室 农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室 西北农林科技大学植保学院,
杨凌 712100; 2西北农林科技大学林学院, 杨凌 712100)
摘要:通过透射电子显微镜,在表现卷叶、褪绿症状的丁香(Syringa oblata)样品的叶脉韧皮部筛管细胞内观察到大量植原
体粒子。 应用植原体 16S rRNA基因通用引物对 P1 / P7 和 R16F2n / R16R2 对表症丁香植株总 DNA进行巢式 PCR扩增,得
到了约 1. 2 kb的目标片段,通过对扩增片段进行测序、系统发育分析和同源性分析,结果表明,该片段长度为 1 246 bp,在
系统发育进化树上与翠菊黄化组(Candidatus Phytoplasma asteris)成员是聚集在一起的,与该组成员同源性均在 98%以上。
用 16Sr RNAⅠ组和Ⅴ组特异引物确定了该病害非混合侵染所致,相似性系数和 RFLP分析表明该植原体属于 16SrⅠ-B亚
组。 这是国内关于翠菊黄化组植原体在丁香上感染的首次报道。
关键词:植原体; 16S rRNA基因; PCR; 相似性系数; RFLP
Molecular detection and identification of a phytoplasma associated with lilac leaf
roll　 LI Zheng-nan1, ZHANG Lei2, WU Yun-feng1 　 ( 1State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas
and Key Laboratory of Crop Pest Integrated Pest Management on the Loess Plateau of Ministry of Agriculture College of Plant
Protection, Northwest A&F University,Yangling 712100, China; 2 College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling
712100, China)
Abstract: In those of Syringa oblata plants showing symptoms of leaf roll, chlorotic, a great quantity of
structures resembling phytoplasmas were observed in small pieces of phloem sieve elements by Electron mi-
croscopy. Nested PCR using a combination of phytoplasma-specific universal primer pairs (P1 / P7- R16F2n /
R16R2) amplified 16S rDNA with the expected size (1. 2 kb) from all samples of symptomatic S. oblata
plants. On the basis of sequencing, phylogenetic analysis and nucleotide alignments to PCR products, a 1 246
bp fragment was obtained that clustered together with the members of ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ and
shared a 98% similarity. Group specific primer pairs R16(Ⅰ) F1 / R16(Ⅰ)R1 and R16(Ⅴ) F1 / R16(Ⅴ)
proved that this disease was caused by unmixed infection. Similarity coefficient and RFLP analysis indicated
that it was belonged to phytoplasmas members of 16Sr I-B. This is the first time to report group ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’ infecting S. oblata plants in China.
Key words: phytoplasma; 16S rRNA gene; polymerase chain reaction; similarity coefficient; restriction
fragment length polymorphism
中图分类号: S432　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)02-0131-08
　 　 植原体(phytoplasma)是一类无细胞壁,不能
人工培养,存在于植物韧皮部筛管细胞内,类似植
物病原细菌的原核生物。 主要由叶蝉、飞虱等韧皮
部取食的昆虫传播,常常引起植株丛枝、黄化、花变
　
植物病理学报 42 卷
叶、生长衰退等症状。 迄今为止,世界上报道的植
原体病害多达 300 多种,我国也报道了 70 余种[1],
且有不断增加的趋势。
传统上对植原体进行鉴定和命名时,主要依靠
寄主植物的种类、病症等生物学性状和介体昆虫的
特性,不仅对复合侵染的植原体难以鉴定,而且费
时费力,常常导致片面甚至错误的结论。 近年来,
核酸杂交、RFLP、PCR等分子生物学技术在植原体
研究中的广泛应用,极大地推动了植原体分子鉴定
和分类等方面的研究。 由于 16S rRNA 基因、核糖
体蛋白基因( rp)、延伸因子基因( tuf)在进化上具
有高度的保守性,因此,常常被用作植原体分类的
依据[2 ~ 7]。 其中 16S rRNA 基因的应用最为广
泛[8 ~ 12],Lee等[3]通过对植原体 16S rRNA 基因进
行 RFLP分析,将现有的 34 个典型植原体株系划
分为 14 个组 32 个亚组。 Wei 等[13]根据 16S rD-
NA序列的 RFLP分析结果,将植原体划分为 28 个
组。 Zhao 等[14]依据植原体在线分类工具-iPhy-
Classifier对植原体的 16S rDNA 序列进行虚拟的
RFLP分析,将植原体划分为 28 个组。
丁香(Syringa oblata)属于木樨科香花属落叶
灌木或小乔木,原产欧洲和我国[15]。 因其具有独
特的芳香、硕大繁茂的花序,优雅而调和的花色,丰
满而秀丽的姿态,被广泛用于路边、林缘、公园等的
绿化。 本研究采用组织形态学方法和分子生物学
技术证明了丁香卷叶病是由植原体引起的,并通过
对 16S rRNA基因进行测序、系统发育分析、相似
性系数分析和 RFLP分析,确定了该植原体株系的
分类地位。
1　 材料和方法
1. 1　 材料
表现叶片卷曲、褪绿症状的丁香样品和无症状
丁香样品均采自陕西省杨凌区;克隆载体 PMD18-
T simple vector、限制性内切酶购自 TaKaRa 公司,
Taq聚合酶、PCR 产物回收试剂盒购自 Fermentas
公司;枣疯、苦楝丛枝样品和 E. coli JM109 菌株为
本实验室保存。
1. 2　 电子显微镜
从表症和健康的丁香叶脉组织取 2 mm × 2
mm大小的韧皮部组织,检测植原体的存在,首先
将取得的组织样品用 3%的戊二醛和 4%的多聚甲
醛混合物固定 4 h,然后用 1%的锇酸再次固定,
10% ~ 70%的乙醇和 0 ~ 100%的丙酮逐级脱水,
用 812 环氧树脂包埋,然后将该切片以醋酸铀酰及
柠檬酸铅作双重染色,最后用 JEM-1200X 透射电
镜观察照相。
1. 3　 丁香病株总 DNA提取
感病丁香样品总 DNA提取方法参照 Li 等[16]
的方法进行,最后于 -80℃冰箱中保存备用。 同时
以健康丁香 DNA 为阴性对照,枣疯、苦楝丛枝样
品 DNA为阳性对照,提取方法同上。
1. 4　 丁香卷叶病的分子检测
直接 PCR以提取的总 DNA为模板,用植原体
16S rRNA 基因通用引物对 P1 (5′-AAGAGTTT-
GATCCTGGCTCAGGATT-3′) / P7 ( 5′-CGTCCT-
TCATCGGCTCTT-3′) [15]进行扩增。 扩增条件为:
95℃预处理 5 min,95℃ 30 s,50℃ 1 min,72℃ 1
min,35 个循环;最后 72℃ 10 min。 然后将直接
PCR产物稀释 30 倍作为模板,用引物对 R16F2n
(5′-GAAACGCTGCTAAGACTGG-3′) / R16R2(5′-
TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′) [3] 进
行巢式 PCR,扩增条件为:94℃预处理 3 min;94℃
1 min,52℃ 1 min,72℃ 1 min;进行 5 个循环。 然
后以 94℃ 30s;50℃ 1 min,72℃ 2 min,进行 25 个
循环,最后 72℃延伸 10 min。 以直接 PCR 产物稀
释 30 倍作为模板,用 16S rRNAⅠ组和Ⅴ组特异引
物对 R16 (Ⅰ) F1 ( 5′-TAAAAGACCTAGCAAT-
AGG-3′) / R16 ( Ⅰ ) R1 ( 5′-CAATCCGAACT-
GAGACTGT-3′) 和 R16 ( Ⅴ) F1 ( 5′-TTAAAA-
GACCTTCTTCGG-3′) / R16 ( Ⅴ ) R1 ( 5′-
TTCAATCCGTACTGAGACTACC-3′) [17] 分 别 进
行巢式 PCR 扩增。 扩增条件为:94℃预处理 3
min,94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃ 75 s,30 个循环,
最后 72℃延伸 5 min。 用 1%琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物,EB染色,在凝胶成像系统下成像。 PCR
反应以健康丁香总 DNA 为阴性对照,枣疯、苦楝
丛枝样品 DNA 为阳性对照。 Marker 为 MarkerⅣ
(大连 TaKaRa公司)。
1. 5　 PCR产物的纯化、克隆及序列测定
PCR产物纯化采用快捷型琼脂糖 DNA 回收
231
　
　 2 期 　 　 李正男,等:丁香卷叶病植原体的分子鉴定
试剂盒(Fermentas 公司生产)。 纯化的 PCR 产物
与 PMD18-T simple vector ( TaKaRa 公司生产)
16℃连接过夜。 感受态细胞制备采用 Cohen 等的
氯化钙法进行。 将连接产物转化大肠杆菌 E. coli
JM109 感受态细胞,经过蓝白斑筛选后,挑去筛选
平板上的白色菌落培养,采用碱裂解法提取重组质
粒,经过 PCR鉴定为阳性的重组质粒送至三博远
志生物技术有限公司进行测序。
1. 6　 序列同源性比较和虚拟 RFLP分析
将所得 DNA 序列提交 GenBank 并进行
BLAST比对检索,与 NCBI 中已知序列进行同源
性比较,通过 MEGA 4. 0 软件将测定的 16S rDNA
序列与已知各植原体组及亚组的代表进行同源性
比较,并构建系统进化树。 采用 Zhao 等[14]研发的
植原体在线分类工具-iPhyClassifier 对测定的 16S
rDNA 序列进行相似性系数分析和虚拟的 RFLP
分析。
1. 7　 PCR产物的 RFLP分析
在 37℃下,分别用限制性内切酶 AluⅠ、BamH
Ⅰ、BfaⅠ、BstUⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ、HaeⅢ、HhaⅠ、
HinfⅠ、HpaⅠ、HpaⅡ、KpnⅠ、Sau 3AⅠ、MseⅠ、
RsaⅠ、SspⅠ对巢式 PCR 扩增产物进行酶切。 在
65℃下,用限制性内切酶 TaqⅠ对巢式 PCR 扩增
产物进行酶切。 酶切参照 Lee 等[3]的方法,酶切
产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,EB 染色,在
凝胶成像系统下成像,并与该序列的虚拟酶切结果
和 Lee 等[3] 建立的 RFLP 标准图谱进行比较。
Marker 为 ϕX174 RFI DNA HaeIII digest (大连
TaKaRa公司)。
2　 结果与分析
2. 1　 丁香卷叶病病株症状
发病丁香为紫丁香(Syringa oblata)。 感病植
株表现为枝头顶端叶片内卷,茎秆节间短缩,叶片
出现褪绿斑点,花朵变小,不能结果实(图 1)。
2. 2　 电镜结果
本研究通过透射电子显微镜观察,在感病丁香
韧皮组织的筛管细胞中发现有形状不规则的植原
体存在;在健康丁香样品中没有观察到植原体粒
子。 观察到的植原体形态多样,大小在 300 ~ 700
nm之间(图 2)。
2. 3　 PCR扩增结果
利用植原体 16S rRNA 基因通用引物从表现
卷叶症状的丁香样品和阳性对照中扩增出长度约
1. 2 kb的片段,与目标片段大小相符,而从健康丁
香样品中未扩增出特异条带。 证明表现卷叶症状
的丁香中确实是有植原体存在的。
利用Ⅰ组特异性引物对 R16(Ⅰ)F1 / R16(Ⅰ)
R1 从丁香卷叶和苦楝丛枝样品中扩增出 1. 1 kb
的特异性片段,健康丁香样品和枣疯样品中未扩增
出特异条带;用Ⅴ组特异性引物对 R16 (Ⅴ) F1 /
R16(Ⅴ)R1 从枣疯样品中扩增出 1. 1 kb的特异性
片段,丁香卷叶、苦楝丛枝 、健康丁香样品均为扩
增出特异性片段。 说明丁香卷叶样品中存在翠菊
黄化组植原体。
Fig. 1　 The symptom of Syringa oblate showing leaf roll
A: Diseased Syringa oblate; B: 1: Diseased leaf; 2: Healthy leaf.
331
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 2 　 Transmission electron micrograph of
phloem of infected Syringa oblate
The black arrows indicate polymorphic bodies of phytom-
plama. The bar was 0. 5 μm.
2. 4　 序列测定及同源性分析
经序列测定,丁香卷叶植原体的 16S rDNA 片
段长度为 1 246 bp,G + C 含量为 47. 27% ,将其提
交 GenBank(GenBank No. FJ445224)。 将该序列
在 GenBank中进行 BLAST搜索,发现搜索到的序
列均为翠菊黄化组成员,其中与苦楝丛枝病植原体
(FJ537132)同源性最高,达到 99. 44% 。 引物对
R16(Ⅰ) F1 / R16 (Ⅰ) R1 扩增片段长度为 1 097
bp,G + C的含量为 47. 13% 。 利用 MEGA 4. 0 软
件将丁香卷叶植原体 16S rDNA 序列与翠菊黄化
组植原体 7 个亚组代表及其他各植原体组代表的
16S rDNA 序列进行比较,构建系统发育进化树
(图 3)。 从图中可以看出丁香卷叶植原体与 16Sr
Ⅰ-B亚组的苦楝丛枝植原体(FJ436972)聚集在一
个分枝,从而表明该分离物与 16SrⅠ-B 亚组亲缘
关系最近。
2. 5　 相似性系数分析
应用植原体在线分类工具-iPhyClassifier 对测
定的 16S rDNA序列进行了相似性系数分析,由表
1 可知,FJ445224 与 FJ537132 的相似性系数最高
(丁香卷叶植原体与苦楝丛枝植原体的相似性系
数为 1),苦楝丛枝植原体为 16Sr Ⅰ-B 亚组成员,
由此可以断定丁香卷叶植原体也是 16Sr Ⅰ-B 亚
组成员。
2. 6　 虚拟 RFLP分析和实际 RFLP分析
对测定的 16S rDNA 序列进行虚拟的 RFLP
分析,并对 16S rRNA基因巢式 PCR产物进行了实
际的 RFLP 分析(图 4),虚拟 RFLP 图谱和实际
RFLP图谱是一致的,与 Lee 等[3]构建的植原体
RFLP分析图谱中马里兰翠菊黄化植原体的 RFLP
图谱也是一致的。 马里兰翠菊黄化植原体是 16Sr
Ⅰ-B亚组的代表株系,通过进一步的 RFLP 分析
也证明丁香卷叶植原体是 16Sr Ⅰ-B亚组成员。
综合透射电镜观察结果和分子检测结果,表
明丁香卷叶病是由 16SrⅠ-B 亚组植原体侵染引
起的。
3　 讨论
本研究通过对感病样品进行透射电镜观察和
分子生物学检测,确定了该病害是由植原体引起
的。 该植原体与 16SrⅠ组植原体的核苷酸一致性
均在 98%以上,进化树分析证明该植原体与 16Sr
Ⅰ-B亚组亲缘关系最近,通过相似性系数分析、虚
拟和实际 RFLP分析,证明丁香卷叶植原体为 16Sr
Ⅰ-B亚组成员。 目前在我国西北省区报道的植原
体多为 16SrⅠ组和 16SrⅤ组成员,所以在本研究
中选用了这 2 组的特异性引物来检测病株中是否
存在复合侵染。 Ⅰ组特异性引物从表现症状的丁
香样品中扩增出 1 097 bp 的特异片段,而用 16Sr
Ⅴ组特异引物没有特异片段出现,证明不存在
16SrⅤ组植原体的混合侵染。 此之前国内未见有
植原体感染丁香造成病害的报道。 国外对植原体
侵染丁香有过一些研究,如:16SrⅦ的白蜡树黄化
植原体在丁香上引起了丛枝病[18],但 16SrⅠ组成
员侵染丁香在国内外是首次报道。
近年来,随着计算机软件及网络技术的发展,
科研工作者开始用计算机模拟 RFLP 分析,对植原
体进行快速准确的分类鉴定[18 ~ 21],根据模拟
RFLP图谱和相似性系数计算,在原来已建立 18
个植原体组的基础上,又新增了 10 个植原体组。
在本研究中虚拟 RFLP 分析结果和实际 RFLP 分
析结果是一样的,证明了虚拟 RFLP 分析的可靠
性,这种方法简化了 RFLP 分析的实验操作过程,
在以后的植原体分类工作中将得到越来越广泛的
应用。
431
　
　 2 期 　 　 李正男,等:丁香卷叶病植原体的分子鉴定
Fig. 3　 Phylogenetic tree based on sequences of the 16S rDNA from eight phytoplasmas of
‘Candidatus Phytoplasma asteris’ group and representive phytoplasma strains in the
16Sr group / subgroup constructed with the neighbor-joining method
　 　 在构建系统进化树时发现:该分离物不但与
16SrⅠ-B亚组的苦楝丛枝植原体聚集在一起,还
与 16SrⅠ-D亚组的泡桐丛枝植原体聚集在一起,
这是由于泡桐丛枝植原体拥有 2 套异质的 rrn 操
纵子,而这 2 个异质的操纵子间只有很小的变异,
根据两套异质的 rrn 操纵子可将泡桐丛枝植原体
分为 16SrⅠ-B亚组成员和 16SrⅠ-D 亚组成员,因
此,在构建系统发育进化树的时候 16SrⅠ-D 的泡
桐丛枝植原体会聚集在 16SrⅠ-B亚组中[3]。 由于
丁香卷叶植原体与苦楝丛枝植原体的同源性最高,
而在杨凌地区丁香和苦楝又是最为常见的绿化树
种,在公园内常常比邻种植,苦楝丛枝病在杨凌周
边地区普遍发生,因此,丁香卷叶植原体与苦楝丛
枝植原体间的关系还有待进一步研究。
531
Table 1　 Similiary coefficient of 35 phytoplasma strains from GenBank plus sample Syringa oblate (naturally infected)
Serial# rain / GenBank accessic 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
1 AY389828(16SrI-A) 1
2 FJ537132(16SrI-B) 0. 92 1
3 AF222065(16SrI-C) 0. 91 0. 93 1
4 AF222066(16SrI-C) 0. 9 0. 92 0. 93 1
5 AY265206(16SrI-D) 0. 91 0. 97 0. 9 0. 89 1
6 AY265213(16SrI-E) 0. 91 0. 93 0. 92 0. 91 0. 9 1
7 AY265211(16SrI-F) 0. 86 0. 88 0. 87 0. 88 0. 85 0. 87 1
8 U96616(16SrI-K) 0. 86 0. 86 0. 85 0. 86 0. 85 0. 9 0. 9 1
9 L33765(16SrⅡ) 0. 47 0. 48 0. 46 0. 5 0. 48 0. 46 0. 46 0. 33 1
10 L04682(16SrI-Ⅲ) 0. 55 0. 5 0. 53 0. 55 0. 48 0. 51 0. 56 0. 51 0. 59 1
11 U18747(16SrIⅤ) 0. 54 0. 51 0. 52 0. 54 0. 49 0. 49 0. 49 0. 38 0. 48 0. 7 1
12 AF189214(16SrⅤ) 0. 52 0. 47 0. 49 0. 48 0. 45 0. 43 0. 49 0. 35 0. 48 0. 64 0. 63 1
13 AY390261(16SrⅥ) 0. 57 0. 5 0. 55 0. 53 0. 48 0. 34 0. 39 0. 34 0. 52 0. 72 0. 69 0. 89 1
14 X68339(16SrⅦ) 0. 53 0. 54 0. 51 0. 51 0. 53 0. 47 0. 51 0. 36 0. 52 0. 65 0. 64 0. 74 0. 82 1
15 AF353090(16SrⅧ) 0. 6 0. 54 0. 59 0. 6 0. 53 0. 53 0. 5 0. 36 0. 58 0. 72 0. 67 0. 8 0. 89 0. 72 1
16 AF248957(16SrIⅩ) 0. 5 0. 43 0. 46 0. 48 0. 42 0. 38 0. 39 0. 34 0. 52 0. 53 0. 54 0. 56 0. 62 0. 55 0. 66 1
17 X68375(16SrⅩ) 0. 56 0. 51 0. 56 0. 54 0. 52 0. 49 0. 53 0. 53 0. 36 0. 53 0. 43 0. 5 0. 49 0. 47 0. 51 0. 42 1
18 D12581(16SrⅪ) 0. 63 0. 56 0. 58 0. 59 0. 54 0. 54 0. 6 0. 38 0. 61 0. 73 0. 68 0. 68 0. 76 0. 75 0. 76 0. 61 0. 66 1
19 X76427(16SrⅫ) 0. 85 0. 88 0. 88 0. 87 0. 85 0. 87 0. 81 0. 83 0. 42 0. 5 0. 46 0. 46 0. 37 0. 5 0. 45 0. 39 0. 48 0. 57 1
20 AF248960(16SrⅩⅢ) 0. 65 0. 71 0. 7 0. 69 0. 7 0. 64 0. 66 0. 63 0. 51 0. 48 0. 43 0. 45 0. 4 0. 47 0. 48 0. 35 0. 55 0. 52 0. 7 1
21 AJ550984(16SrⅩⅣ) 0. 59 0. 52 0. 56 0. 55 0. 52 0. 5 0. 54 0. 38 0. 51 0. 67 0. 66 0. 73 0. 81 0. 71 0. 74 0. 61 0. 66 0. 87 0. 51 0. 49 1
22 AF147708(16SrⅩⅤ) 0. 48 0. 51 0. 52 0. 55 0. 48 0. 5 0. 56 0. 36 0. 8 0. 58 0. 53 0. 59 0. 6 0. 52 0. 67 0. 63 0. 44 0. 62 0. 51 0. 51 0. 55 1
23 AY725228(16SrⅩⅥ) 0. 54 0. 55 0. 54 0. 52 0. 54 0. 54 0. 46 0. 51 0. 25 0. 3 0. 28 0. 26 0. 25 0. 29 0. 27 0. 21 0. 28 0. 31 0. 62 0. 44 0. 27 0. 27 1
24 AY725234(16SrⅩⅦ) 0. 52 0. 55 0. 54 0. 52 0. 54 0. 56 0. 46 0. 51 0. 25 0. 26 0. 22 0. 2 0. 21 0. 27 0. 25 0. 21 0. 2 0. 27 0. 62 0. 36 0. 2 0. 27 0. 57 1
25 DQ174122(16SrⅩⅧ) 0. 79 0. 82 0. 86 0. 83 0. 78 0. 8 0. 77 0. 73 0. 48 0. 53 0. 56 0. 49 0. 57 0. 51 0. 61 0. 48 0. 56 0. 58 0. 85 0. 66 0. 56 0. 56 0. 52 0. 52 1
26 AB054986(16SrⅩⅨ) 0. 52 0. 49 0. 49 0. 52 0. 49 0. 47 0. 51 0. 38 0. 51 0. 57 0. 74 0. 59 0. 69 0. 64 0. 71 0. 56 0. 54 0. 68 0. 46 0. 41 0. 66 0. 51 0. 24 0. 2 0. 52 1
27 X76431(16SrⅩⅩ) 0. 49 0. 44 0. 46 0. 47 0. 44 0. 44 0. 46 0. 45 0. 32 0. 58 0. 47 0. 38 0. 46 0. 42 0. 54 0. 49 0. 79 0. 65 0. 44 0. 46 0. 73 0. 37 0. 26 0. 2 0. 46 0. 62 1
28 AJ632155(16SrⅩⅪ) 0. 41 0. 4 0. 4 0. 41 0. 4 0. 4 0. 42 0. 31 0. 48 0. 5 0. 64 0. 47 0. 57 0. 57 0. 59 0. 47 0. 38 0. 62 0. 38 0. 36 0. 56 0. 49 0. 28 0. 2 0. 42 0. 62 0. 35 1
29 Y14175(16SrⅩⅫ) 0. 51 0. 48 0. 51 0. 51 0. 46 0. 44 0. 44 0. 31 0. 46 0. 6 0. 74 0. 6 0. 67 0. 63 0. 7 0. 57 0. 38 0. 67 0. 4 0. 4 0. 6 0. 47 0. 26 0. 24 0. 48 0. 79 0. 5 0. 65 1
30 AY083605(16SrⅩⅩⅢ) 0. 76 0. 77 0. 82 0. 76 0. 74 0. 8 0. 72 0. 69 0. 48 0. 48 0. 45 0. 43 0. 48 0. 45 0. 54 0. 39 0. 45 0. 54 0. 74 0. 67 0. 47 0. 51 0. 48 0. 46 0. 72 0. 41 0. 42 0. 4 0. 4 1
31 AF509322(16SrⅩⅩⅣ) 0. 46 0. 43 0. 47 0. 46 0. 41 0. 41 0. 45 0. 42 0. 42 0. 6 0. 8 0. 65 0. 76 0. 66 0. 73 0. 56 0. 48 0. 66 0. 46 0. 39 0. 7 0. 48 0. 24 0. 2 0. 49 0. 72 0. 6 0. 68 0. 74 0. 39 1
32 AF521672(16SrⅩⅩⅤ) 0. 55 0. 53 0. 52 0. 53 0. 52 0. 5 0. 56 0. 53 0. 59 0. 62 0. 57 0. 61 0. 65 0. 58 0. 65 0. 51 0. 57 0. 57 0. 47 0. 46 0. 57 0. 59 0. 25 0. 22 0. 52 0. 57 0. 49 0. 41 0. 54 0. 48 0. 51 1
33 AJ539179(16SrⅩⅩⅥ) 0. 62 0. 57 0. 57 0. 58 0. 55 0. 55 0. 51 0. 47 0. 4 0. 61 0. 75 0. 56 0. 62 0. 53 0. 59 0. 47 0. 45 0. 57 0. 56 0. 46 0. 59 0. 42 0. 34 0. 3 0. 61 0. 62 0. 44 0. 55 0. 65 0. 51 0. 67 0. 54 1
34 AJ539180(16SrⅩⅩⅦ) 0. 71 0. 72 0. 73 0. 78 0. 69 0. 71 0. 69 0. 67 0. 5 0. 65 0. 74 0. 55 0. 63 0. 61 0. 63 0. 55 0. 51 0. 62 0. 69 0. 56 0. 62 0. 52 0. 42 0. 4 0. 77 0. 57 0. 52 0. 48 0. 56 0. 64 0. 61 0. 52 0. 72 1
35 FJ445224 0. 92 1 0. 93 0. 92 0. 97 0. 93 0. 88 0. 86 0. 48 0. 5 0. 51 0. 47 0. 5 0. 54 0. 54 0. 43 0. 51 0. 56 0. 88 0. 71 0. 52 0. 51 0. 55 0. 55 0. 82 0. 49 0. 44 0. 4 0. 48 0. 77 0. 43 0. 53 0. 57 0. 72 1
　
　 2 期 　 　 李正男,等:丁香卷叶病植原体的分子鉴定
Fig. 4　 RFLP analysis of 16S rDNA sequence F2nR2 from Syringa oblate leaf roll sample
A: Theoretical RFLP; B: Actual RFLP.
参考文献
[1] 　 Li Y, Tian G Z, Piao C G, et al. Rapid molecular
differentiation and identification of different phyto-
plasmas from several plants in China ( in Chinese)
[J] . Acta Phytopathologica Sinica (植物病理学报),
2005, 35(4): 293 -299.
[2] 　 Schneider B, Gibb KS, Seemüller E. Sequence and
RFLP analysis the elongation factor Tu gene used in
differentiation and classification phytoplasmas [ J ] .
Microbiology, 1997, 143: 338 -3389.
[3] 　 Lee I M, Gundersen-Rindal D E, Davis R E, et al.
Revised classification scheme of phytoplasmas based on
RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein
gene sequences [J] . International Journal of Systema-
tic Bacteriology, 1998, 48: 1153 -1169.
[4] 　 Tian J B, Guo H P, Bertaccini A, et al. Molecular
detection of jujube witches’ broom phytoplasmas in
micropropagated jujube shoots [ J ] . Hortscience,
2000, 35: 1274 -1275.
[5] 　 Abou-Jawdah Y, Karakashian A, Sobh H, et al. An
epidemic of almond witches’ -broom in Lebanon: clas-
sification and phylogenetic relationships of the associa-
ted phytoplasma [ J] . Plant Disease, 2002, 86 (5):
477 -484.
[6] 　 Harrison N A, Womack M, Carpio M L. Detection
and characterization of a lethal yellowing (16SrIV)
731
　
植物病理学报 42 卷
group phytoplasma in Canary Island date palms affect-
ed by lethal decline in Texas [ J] . Plant Disease,
2002, 86(6): 676 -681.
[7] 　 Gao R, Zhang G M, Lan Y F, et al. Molecular cha-
racterization of phytoplasma associated with rose wit-
ches’ -broom in China [ J] . Journal of Phytopatholo-
gy, 2008, 156 (2): 93 -98.
[8] 　 Lee I M, Gundersen-Rindal D E, Davis R E, et al.
Revised classification scheme of phytoplasmas based on
RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein
gene sequences [J] . International Journal of Systema-
tic Bacteriology, 1998, 48( 4): 1153 -1169.
[9] 　 The IRPCM Phytoplasma / Spiroplasma Working Team.
‘Candidatus Phytoplasma’, a taxon for the wall-less,
non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and
insects [ J] . International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 2004, 54: 1243 -1255.
[10] Seemüller E, Marcone C, Lauer U, et al. Current sta-
tus of molecular classification of the phytoplasmas
[J] . Journal of Plant Pathology, 1998, 80: 3 -26.
[11] Lee I M, Martini M, Marcone C, et al. Classification
of phytoplasma strains in the elm yellows group
(16SrV) and proposal of ‘Candidatus Phytoplasmaul-
mi’ for the phytoplasm a associated with elm yellows
[J] . International Journal of Systematic and Evolution-
ary Microbiology, 2004, 54: 337 -347.
[12] Arnaud G, Malembic-Maher S, Salar P, et al. Multi-
locus sequence typing confirms the close genetic inter
relatedness of three distinct flavescence dorée phyto-
plasma strain clusters and group 16SrV phytoplasmas
infecting grapevine and alder in Europe [ J] . Applied
and Environmental Microbiology, 2007, 73 ( 12 ):
4001 -4010.
[13] Wei W, Lee I M, Davis R E, et al. Virtual RFLP a-
nalysis of 16S rDNA sequences identifies new sub-
groups in the clover proliferation phytoplasma group
[J] . Bulletin of Insectology, 2007, 60 (2): 349 -
350.
[14] Zhao Y, Sun Q R, Wei W, et al. ‘Candidatus Phyto-
plasma tamaricis ’, a novel taxon discovered in
witches’ -broom-diseased salt cedar (Tamarix chinensis
Lour. ) [ J] . International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 2009, 59: 2496 -2504.
[15] Smart C D, Schneide B R, Blomouistl, et al. Phyto-
plasma specific PCR primers based on sequences of the
16S-23S rRNA spacer region [J] . Applied and Enviro-
mental Microbiology, 1996, 18: 2988 -2993.
[16] Li Z N, Song J G, Zhang C P, et al. Berberis phyl-
lody is a phytoplasma-associated disease [ J] . Phyto-
parasitica, 2010, 38: 99 -102.
[17] Angelini E, Clair D, Borgo M, et al. Flavescence
dorée in France and Italy-occurrence of closely related
phytoplasma isolates and their near relationships to
Palatinate grapevine yellows and an alder yellows phy-
toplasma [J] . Vitis. , 2001,40: 79 -86.
[18] Walla J A, Guo Y H. Lilac witches’ -broom in North
Dakota [J] . Plant Disease, 1998, 12: 1404 -1404.
[19] Cai H, Wei W, Davis R E, et al. Genetic diversity
among phytoplasmas infecting Opuntia species: virtual
RFLP analysis identifies new subgroups in the peanut
witches’ -broom phytoplasma group [ J] . International
Journal of Systematic Bacteriology, 2008, 58: 1448 -
1457.
[20] Quaglino F, Zhao Y, Bianco P, et al. New 16Sr sub-
groups and distinct SNP lineages among grapevine Bois
noir phytoplasma populations [ J] . Annals of Applied
Biology, 2009, 154: 279 -289.
[21] Wei W, Lee I M, Robert E Davis, et al. Automated
RFLP pattern comparison and similarity coefficient cal-
culation for rapid delineation of new and distinct phyto-
plasma 16Sr subgroup lineages [J] . International Jour-
nal of Systematic and Evolutionary Microbiology,
2008, 58: 2368 -2377.
责任编辑:曾晓葳
831