全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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#
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#"+*,",
%
-
+.//0+#""")$"!&+!"#$+"&+"$%
收稿日期$
!"#%)#!)!#
&修改稿收到日期$
!"#$)"%)!"
基金项目$国家自然科学基金"
%#!,"",%
#
作者简介$刘
!
蕾"
#1(
#!男!在读硕士研究生!主要从事植物代谢途径基因工程研究
2)34.5
$
647/801
!
#!,+983
"
通信作者$陈丽梅!教授!硕士生导师!主要从事植物代谢途径基因工程研究
2)34.5
$
9:;05.3;.<3
!
#!,+983
烟草
$%
合成调控转录因子
&$
应答甲醇
和乙醇刺激的分子机理初探
刘
!
蕾!杨志丽!陈丽梅"
"昆明理工大学 生命科学与技术学院 生物工程技术研究中心!昆明
,&"&""
#
摘
!
要$为了考察甲醇或乙醇促进植物生长与赤霉素"
=>
#的合成关系!该研究在
?@
固体培养基中培养并添加外
源
=>
和
=>
合成抑制剂多效唑"
A>B
#!分析其对
!3385
%
C
甲醇或乙醇促进烟草生长的影响及
=>
合成调控转
录因子
D@=
"
E8FF;
G
F;//.808E/:88H
I
F87H:
#应答甲醇或乙醇刺激的分子机理结果显示$"
#
#外源添加
=>
可增强
甲醇或乙醇对烟草生长的刺激作用!而添加
A>B
却抑制甲醇和乙醇对烟草生长的刺激作用"
!
#
#$)%)%
蛋白与
D@=
结合抑制
D@=
进入细胞核及其转录调控活性&甲醇和乙醇诱导烟草
#$)%)%
基因的转录和表达!对
D@=
蛋白
表达也有诱导作用"
%
#甲醇和乙醇可降低
#$)%)%
蛋白与
D@=
的相互作用!同时增强
D@=
与
=>!"8J#
启动子的
结合研究表明!甲醇和乙醇刺激烟草的生长可能通过增加
D@=
表达!且减弱
D@=
与
#$)%)%
蛋白的结合来增加
D@=
细胞核定位作用!从而增强
D@=
与
=>!"8J#
启动子的结合!最终增加
=>
的合成!从而促进烟草的生长!这
可能是甲醇和乙醇促进烟草生长的一种重要的分子机制
关键词$烟草&甲醇&乙醇&
D@=
转录因子&
=>
合成
中图分类号$
K*1
文献标志码$
>
$%
(
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123*,!4/3)-5/#
6
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6
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BQ2OC.3;.
"
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R.8H;9:0858
IS
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T49U5H
S
8EC.E;@9.;09;406V;9:0858
IS
!
WU03.0
I
M0.X;F/.H
S
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IS
!
WU03.0
I
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!
B:.04
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$
V8U06;F/H4067:;H:;F3;H:4085)8F;H:4085)
G
F838H;6
G
540H
I
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S
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I
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"
=>
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A>B
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0H:;/./
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80!3385
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I
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I
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5
S
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!
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S
0H:;/./)F;
I
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G
H.80E49H8F
!
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G
80/;H8
3;H:4085)406;H:4085)/H.3U54H.80.0H8Y4998+V:;F;/U5H//:87;6H:4H
$"
#
#
V:;466.H.808E;J8
I
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I
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/H.3U54H.80H8H8Y4998
I
F87H:+
"
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#
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I
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G
F8H;.0/7.H:D@=.0:.Y.H/D@=HF40/
G
8FH.0H80U)
95;U/406F;6U9;6.H/HF40/9F.
G
H.8045F;
I
U54H8F
S
49H.X.H
S
+?;H:4085406;H:4085.06U9;6HF40/9F.
G
H.80406;J)
G
F;//.808E#$)%)%
I
;0;/4/7;54/D@=
G
F8H;.0;J
G
F;//.80+
"
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#
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H.808E#$)%)%
G
F8H;.0/406D@=7:.5;;0:409;6H:;Y.06.0
I
8ED@=H8=>!"8J#
G
F838H;F+V:;/;F;/U5H/
.06.94H;6H:4H3;H:4085)406;H:4085)/H.3U54H;6H8Y4998
I
F87H:3.
I
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I
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95;4F58945.Z4H.808ED@=Y
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G
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G
F8H;.0/+B80/;
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G
F838H;F74/;0:409;6406=>
G
F8)
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S
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!
H:;F;Y
SG
F838H.0
I
H:;
I
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I
;/3.
I
:H980/./H8E40.3)
G
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S
.0
I
3;H:4085)406;H:4085)
G
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I
F87H:+
<,
(
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$
H8Y4998
&
3;H:4085
&
;H:4085
&
D@=HF40/9F.
G
H.80E49H8F
&
=>/
S
0H:;/./
!!
甲醇是植物体内产生并能通过
B#
代谢和光合
作用同化的一种
B#
化合物!很多研究发现甲醇能
刺激植物生长!缩短植物生育期!调控植物的光合作
用及基因的表达!目前关于甲醇刺激植物生长的机
制主要有以下几种假说和推测$碳源假说(增强光合
作用并抑制光呼吸假说(推动钙离子由成熟组织向
新生组织的转移(细胞分裂素介导和影响激素生成
假说)#*乙醇是植物细胞在无氧状态下由糖酵解产
生的一种产物!在能利用乙醇为碳源的微生物如构
巢曲霉"
!"
#
$%
&
(()"*+)(,*"
#中证实乙醇可以强
烈诱导与其代谢相关基因的表达)!*最近有研究报
道)%)$*在植物叶片上喷施乙醇和甲醇有相似的效果!
乙醇也能刺激植物生长!增加植物气孔的导度和光
合作用及生物量的积累!降低叶片中过氧化氢的含
量!提高质膜
Q
)>VA
酶的活性!有些研究还发现
乙醇对植物的生长及生理生化特性的影响比甲醇还
强烈
为了深入考察甲醇和乙醇促进植物生长的机
理!有些研究利用
]O>
芯片及其他分子生物学方
法分析甲醇和乙醇对植物基因表达的影响)&)**!结果
说明甲醇和乙醇在植物中可能作为信号分子或诱导
物起作用!调控很多基因的表达!且在
9]O>
芯片
的数据中发现和
=>
合成及其生理功能相关基因的
表达也受到甲醇和乙醇的调控!这说明甲醇和乙醇
的喷施可能也通过影响植物中
=>
的合成及生理作
用来调控植物的生长)**在烟草中
D@=
是一个含
有碱性亮氨酸拉链"
YPLA
#的
=>
合成调控转录因
子!通过调节
=>
合成关键酶
W^
"贝壳杉烯"
;0H)
<4U;0;
#氧化酶#和
=>!"8J#
"
=>#1
氧化酶#的表达
来控制内源
=>
含量)1*
D@=
与
=>!"8J#
启动子
的结合受烟草体内
=>
含量的反馈调节)*
#$)%)%
蛋白是植物体内一种重要的调控蛋白!通过与植物
中的多种信号传导相关蛋白相互作用来调节植物对
外界环境刺激的应答)#"*当烟草体内
=>
含量降
低或应用
A>B
"内源性
=>
合成抑制剂#抑制
=>
合成时!细胞质中的
#$)%)%
蛋白与
D@=
结合减少!
使
D@=
定位于细胞核中!
D@=
与
W^
和
=>!"8J#
启动子结合!提高它们的表达水平!
=>
的合成量增
加&反之!添加外源
=>
时则增强
#$)%)%
蛋白与
D@=
的结合使
D@=
定位到细胞质中!
D@=
与
-.
和
/!!"01#
启动子结合受到抑制!它们的表达水平
下降!
=>
的合成量减少)##*为了深入研究甲醇和
乙醇刺激植物生长的分子机理!本研究以烟草为实
验材料!通过比较甲醇和乙醇处理前后烟草鲜重和
根长的变化!考察甲醇和乙醇刺激对烟草中
#$)%)%
和
D@=
的转录和表达水平及它们相互作用(
D@=
与
=>!"8J#
启动子结合的影响!分析
D@=
应答甲
醇和乙醇的分子机理!为甲醇和乙醇作为植物生长
调节剂的广泛用提供理论依据
#
!
材料和方法
>+>
!
材料培养与处理
为了排除微生物干扰!烟草的培养及处理均在
无菌条件下进行烟草"
;98H
SG
;
!
2304,*,4,5,6
3)79X+_40H:
#种子经表面消毒后!播种到
?@
培养
基"含
#`
蔗糖!
G
Q&+*
#上!在培养箱培养"
!&a
!
持续光照!
#""
"
385
+
3
(!
+
/
(#
#
%
#
&6
!然后转入
温室条件下"日间
%" a
%夜间
!& a
!
#!:
光照!
#!""
"
385
+
3
(!
+
/
(#
#生长
!
周!选择大小均一的
植株切去根后转移至
?@
"
BW
#(
?@\!3385
%
C
甲
醇"或乙醇#(
?@\!3385
%
C
甲醇"或乙醇#
\#"
"
385
%
C=>
"或
"+&
"
385
%
CA>B
#的培养基中!培
养
#&6
后测量处理前后根伸长量和植株鲜重增
加量
>+?
!
方
!
法
>@?@>
!
&4.AB&
分析
!
有根的烟草幼苗转移至
?@
"
BW
#(
?@\!3385
%
C
甲醇"乙醇#(
?@\!3385
%
C
甲醇"乙醇#
\#"
"
385
%
C=>
"
+&
"
385
%
CA>B
#
的培养基中处理
"
(
#
(
%
(
&
(
*6
!收集叶片用
VDLZ85
$
D;4
I
;0H
"
L0X.HF8
I
;0
公司#提取总
DO>
!取
$
"
I
总
DO>
用
?)?CbD;X;F/;VF40/9F.
G
H4/;
"
AF83;
I
4
公司#反转录合成
9]O>
!分别用烟草
#$)%)%
和
89/
基因上下游引物"表
#
#进行
DV)ABD
!
DV)
ABD
分析以烟草
#1@FDO>
作为内参
>@?@?
!
C,-*,/);2"**#)
0
分析
!
烟草植株处理见
>+?+>
!各取
"+&
I
烟草叶片提取可溶性总蛋白!烟
$$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
>
!
&4.AB&
所用引物序列
V4Y5;#
!
AF.3;F/;
[
U;09;/U/;6.0DV)ABD4045
S
/./
基因
=;0;
引物
AF.3;F
序列
@;
[
U;09;
"
&c
!
%c
#
退火温度
V3
%
a
产物大小
AF86U9H/.Z;
%
Y
G
#$)%)%,
T8F74F6
D;X;F/;
>>V=>>===>=>VV>VV>B>==
>VV>B>>=B>B==VB>==>=
&!+1
&&+#
!##
#$)%)%5
T8F74F6
D;X;F/;
B>=>==>>BVB>B==V>=>==
BB>=VBB>>=VB==>V>===
&,+$
&+%
$!"
#$)%)%3
T8F74F6
D;X;F/;
VB=V==B=V>VV>VBVB>VB
>BVVVB>=B>=BBVBBVV>B
&+%
&%+
!,*
#$)%)%+
T8F74F6
D;X;F/;
V>=V=>V=VVV=V=BV==>>
>>V>>BV=B>V=>V>>===V=
&#+1
&!+$
%%
#$)%)%$
T8F74F6
D;X;F/;
>>==VB=B>>>=>B>=V>=>V=
>>V===>BVB>>==>==VVB
&,+,
&&+$
!$$
#$)%)%
:
T8F74F6
D;X;F/;
VBV=V>>B==V>VBBVB>>=B
>V=VBB=>==VBB>B>>>=V
&$+*
&,+&
$#1
#$)%)%
&
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D;X;F/;
>=BB=>>B=BV>V=>>=>>>
>=>>=B>=>V==B>B=>=>V
&*+
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%"#
#$)%)%;
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D;X;F/;
==>>BV>>BB=VB=>>=>>B
VV>>>BVB>=BB>>>V>=B=
&$+"
&%+
%"%
#$)%)%
T8F74F6
D;X;F/;
===VBVBBVV=>=VBBB>VVV
B>=B>VBBVBB=B>VV>VBV
&+&
&*+*
$#,
89/
T8F74F6
D;X;F/;
>V==>BBB=>>=VVB>=B==>>>=B
VB>>BBBBV=VV>VV=>>=VVB>V=
*!+$
,!+$
#"*,
#1@FDO>
T8F74F6
D;X;F/;
===B>VVB=V>VVVB>V>=VB>=
>>===>V>BBVBB=B>V>=B
&1+,
&1+&
!1*
草叶片分别在液氮中充分研磨至粉末状!加入
#"
3C
蛋白抽提液"
#""3385
%
CVF./)QB5
!
&` AbA
!
#3385
%
CA?@T
!
#"3385
%
C
巯基乙醇!
#"`
甘
油#!继续研磨至充分混匀抽提液转移到
!3C
离
心管中!在
$a
(
#!"""F
%
3.0
下!离心
#&3.0
收
集上清液加入固体硫酸铵至终浓度约
#+385
%
C
!
沉淀蛋白在
$a
(
#!"""F
%
3.0
离心
#&3.0
收
集的蛋白沉淀物溶解于
&""
"
CAR@YUEE;F
"
!+*
3385
%
C WB5
!
#%& 3385
%
C O4B5
!
#+* 3385
%
C
WQ
!
A^
$
!
#"3385
%
CO4
!
QA^
$
+
#!Q
!
^
#中蛋
白质浓度用
RF46E8F6
法测定
取可溶性总蛋白
&"
"
I
进行
d;/H;F0Y58HH.0
I
分析!总蛋白通过
#!` @]@)A>=2
分离后转移至
Ab]T
膜"
?.5.
G
8F;
公司#上由于大豆
#$)%)%
蛋
白氨基酸序列和烟草的一致性极高!因此分别用大
豆
#$)%)%4
蛋白"
40H.)#$)%)%4
#或烟草
40H.)D@=
蛋
白的兔抗作为一抗与
Ab]T
膜进行孵育!孵育后的
膜分别与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗进行结
合反应最后用
2BC
"北京康为世纪生物科技有限
公司#发光试剂盒在成像系统
B:;3.689_D@
"
R.8)
D46
公司#中观察结果
>+?+D
!
蛋白质免疫共沉淀分析
!
用免疫共沉淀
"
B8)LA
#技术分析磷酸化
D@=
与
#$)%)%
蛋白在烟草
叶片中的相互作用对甲醇和乙醇刺激的应答取
>+?+?
中提取的可溶性蛋白进行
B8)LA
分析!在
&""
"
I
总蛋白里加入
%"
"
C
有磷酸化修饰的烟草
D@=
特异多肽片段)
D@=
G
!
2@bbWCW=C]L]VLKKQN
"
G
)V
#
b
*制备的多克隆抗体"兔抗
40H.)D@=
G
#沉淀
与
D@=
结合的蛋白!用
AR@YUEE;F
定容至
#3C
!室
温振荡"
$&F
%
3.0
#孵育
!:
!然后往蛋白混合液里加
入
%"
"
C
G
F8H;.0>
%
=
琼脂糖!
$a
振荡"
$&F
%
3.0
#
孵育过夜再将孵育后的蛋白混合液
$a
(
%&""
F
%
3.0
离心
&3.0
!收集的蛋白沉淀复合物用遇冷的
AR@YUEE;F
洗涤
%
次!蛋白沉淀物溶解于
$"
"
C#e
电泳上样缓冲液中!加入
1
"
C
蛋白上样缓冲液并于
沸水中加热处理
13.0
!经冰浴后取
!"
"
C
蛋白沉
淀复合物通过
#!` @]@)A>=2
分离后转移到
Ab]T
膜上!膜首先用
40H.)#$)%)%4
或
40H.)D@=
G
抗
体作为一抗进行
d;/H;F0Y58H
分析!然后加入
&
"
C
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗"北京康为世纪
生物科技有限公司#后用
2BC
试剂盒显影观察
结果
>+?+E
!
染色质免疫共沉淀分析
!
烟草植株的处理
同
DV)ABD
分析!取
#+&
I
烟草叶片放入含
%&3C
9F8//.0
I
YUEE;F
"
"+$ 3385
%
C
蔗糖!
#" 3385
%
C
VF./)QB5
"
G
Q1+"
#!
#3385
%
C2]V>
!
#3385
%
C
A?@T
!
#`
甲醛#中!于真空干燥器中交联
#&3.0
后!加入
!+&3C#385
%
C
甘氨酸抽真空
&3.0
终止
交联!用超纯水清洗
!
#
%
次后!投入液氮中!
(1"
a
保存备用用染色质免疫共沉淀"
B:LA
#分析
&$
&
期
!!!!!!!
刘
!
蕾!等$烟草
=>
合成调控转录因子
D@=
应答甲醇和乙醇刺激的分子机理初探
D@=
和
=>!"8J#
启动子的结合对甲醇和乙醇刺激
的应答!
B:LA
参照
D.94F6.
等)#!*的方法进行!在
B:LA
分析中用
40H.)D@=
G
抗体沉淀与
D@=
结合的
=>!"8J#
启动子
]O>
片段!以
B:LA
沉淀的
]O>
片段为模板进行
ABD
反应!在
ABD
反应中使用
=>!"8J#
启动子引物
T8F74F6
"
&c)H
I
H
II
44HH44
I
H4H)
H494H944H9)%c
#和
D;X;F/;
"
&c)HH44
I
4H444H49449
I
9H)
9
I
4499)%c
#扩增包含
D@=
结合位点的
]O>
片段!用
图像分析软件
L34
I
;f
对
ABD
扩增条带的亮度进行
相对定量分析
>+D
!
数据处理
所有的生理生化指标分析均进行
%
次生物学重
复图中的数值为
%
组独立实验的均值
g@]
!用
]A@
"软件#中
C@]
法进行统计学和差异显著性分
析不同字母表示不同处理后指标间的显著性差异
"
<
#
"+"&
#
!
!
结果与分析
?@>
!
烟草应答甲醇和乙醇刺激的表型变化与
$%
相关性分析
本研究的前期实验结果说明!在
?@
培养基中
添加
!3385
%
C
甲醇或乙醇都能促进烟草幼苗的生
长)#%*为了分析甲醇和乙醇刺激烟草的生长与
=>
合成是否有关联!根据相关文献报道
A>B
和
=>
用
量)#$*!在含有
!3385
%
C
甲醇或乙醇的
?@
培养基
上添加
#"
"
385
%
C=>
或
"+&
"
385
%
CA>B
!比较在
?@
"对照!
BW
#(
?@\!3385
%
C
甲醇"乙醇#及
?@
\!3385
%
C
甲醇"乙醇#
\A>B
"
=>
#的培养基上
处理
#&6
"约
!
周#后烟草鲜重的相对增长量"图
#
!
>
#和根的相对生长量"图
#
!
R
#图
#
!
>
的数据说
明在含甲醇和乙醇的
?@
培养基中!烟草鲜重增长
量分别是
BW
的
#+!1
和
#+!%
倍!在添加甲醇或乙
醇及
A>B
的
?@
培养基中!烟草鲜重显著降低!约
为
BW
的
"+1!
和
"+1*
倍!而在同时添加有甲醇"乙
醇#及
=>
的
?@
培养基中!烟草鲜重增加的量比单
独添加甲醇和乙醇的培养基显著!分别为仅添加甲
醇"乙醇#处理的
#+%
和
#+!&
倍这些结果说明
A>B
的存在降低甲醇和乙醇对烟草生长的刺激作
用!添加
=>
增强甲醇和乙醇对烟草生长的刺激作
用图
#
!
R
的数据表明在含有甲醇和乙醇的
?@
培
养基中!烟草根的相对生长量分别为对照组
BW
的
#+$!
和
#+%&
倍"图
#
!
R
#!在同时添加有甲醇"乙
醇#及
=>
的
?@
培养基中!烟草根相对生长量分别
为
BW
的
#+*&
和
#+,$
倍!而在同时添加有甲醇或
乙醇及
A>B
的
?@
培养基中!烟草根相对生长量明
显减少!分别为只添加甲醇和乙醇的
"+1$
和
"+1,
倍这些结果表明添加
=>
增强甲醇和乙醇对烟草
根生长的刺激作用!而添加
A>B
抑制甲醇和乙醇对
烟草生长的刺激作用以上这些结果证实甲醇和乙
醇可能是通过增加植物内源性
=>
的合成来促进烟
草的生长!且甲醇刺激烟草生长的效果比乙醇更
显著
?@?
!
甲醇和乙醇对烟草
>E.D.D
和
&$
基因转录及
表达水平的影响
分析甲醇"乙醇#对烟草中
#$)%)%
和
D@=
基因
的 转录"图
!
!
>
#和蛋白表达"图
!
!
R
#的影响结果
图
#
!
添加
A>B
和
=>
对
!3385
%
C
甲醇"乙醇#刺激烟草鲜重增长量"
>
#和根伸长量"
R
#的影响
B
表示对照处理&
?
(
?A
和
?=
分别表示甲醇(甲醇
\A>B
和甲醇
\=>
处理
#&6
&
>
(
>A
和
>=
分别表示乙醇(
乙醇
\A>B
(乙醇
\=>
处理
#&6
&不同小写字母表示处理间在
"+"&
水平存在显著性差异&图上的棒线表示标准差"
*h%
#
T.
I
+#
!
2EE;9H/8EA>B406=>466.H.80/80!3385
%
C3;H:4085)8F
;H:4085);0:409;6EF;/:7;.
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F87H:.0H8Y4998
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&
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!
?A406?=.06.94H;3;H:4085
!
3;H:4085\A>B4063;H:4085\=>HF;4H3;0HE8F#&6
!
F;/
G
;9H.X;5
S
&
?
!
?A406?=.06.94H;;H:4085
!
;H:4085\A>B406;H:4085\=>HF;4H3;0HE8F#&6
!
F;/
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;9H.X;5
S
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物
!
学
!
报
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%$
卷
表明!随着甲醇"乙醇#处理时间的增加!几乎所有
#$)%)%
蛋白基因的转录都呈上调趋势"图
!
!
>
#!其
中
#$6%6%,
(
#$6%6%+
(
#$6%6%$
(
#$6%6%
:
(
#$6%6%
&
和
#$6%6%
的上调较显著!这说明大部分
#$)%)%
基
因的转录都被甲醇和乙醇刺激诱导!
D@=
转录水平
变化不明显"图
!
!
>
#!说明
D@=
转录对甲醇"乙醇#
刺激不产生应答
d;/H;F0Y58HH.0
I
分析结果表明!
随着甲醇和乙醇处理时间的增加!
#$)%)%
蛋白表达
量也逐渐增加!
D@=
蛋白的表达水平也上升"图
!
!
R
#!这说明甲醇"乙醇#刺激增强
#$)%)%
和
D@=
蛋
白的表达
?@D
!
甲醇和乙醇对
>E.D.D
蛋白与
&$
互作水平的
影响
在烟草体内
#$)%)%
蛋白通过与
D@=
结合来调
控
D@=
进入细胞核的水平!从而控制
=>
合成
量)#&*研究表明
D@=
需要被磷酸化修饰后才能与
#$)%)%
蛋白结合!
B8)LA
分析甲醇和乙醇处理烟草
叶片中
#$)%)%
蛋白和
D@=
相互作用结果表明随
着处理时间的增加!甲醇或乙醇"图
%
#处理烟草叶
片中
#$)%)%
蛋白和
D@=
互作水平逐渐降低!说明
甲醇或乙醇的刺激减弱烟草叶片中
#$)%)%
蛋白和
D@=
的相互作用
?@E
!
甲醇和乙醇对
&$
与
$%?F"G>
启动子结合
水平的影响
L
I
4F4/:.
等)#&*的研究用来普霉素
R
"
C;
G
H83
S
)
9.0R
!出核转运抑制剂#处理
D@=)=TA
转基因烟草
叶片!发现当
#$)%)%
蛋白与
D@=
结合增加时!进入
细胞 核 的
D@=
量 会 相 应 减 少!从 而
D@=
与
=>!"8J#
启动子的结合水平也会相应降低用
D@=
G
抗体做
B:LA
分析甲醇和乙醇处理烟草叶片
图
!
!
!3385
%
C
甲醇"乙醇#处理后烟草
#$)%)%
和
D@=
基因转录"
>
#及蛋白表达水平"
R
#
T.
I
+!
!
VF40/9F.
G
H.80406;J
G
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%
C3;H:4085
"
;H:4085
#
HF;4H3;0H
图
%
!
!3385
%
C
甲醇"乙醇#对烟草叶片
#$)%)%
和
D@=
互作水平的影响
T.
I
+%
!
2EE;9H/8E!3385
%
C3;H:4085
"
;H:4085
#
80H:;.0H;F49H.808E#$)%)%
G
F8H;.0406D@=
*$
&
期
!!!!!!!
刘
!
蕾!等$烟草
=>
合成调控转录因子
D@=
应答甲醇和乙醇刺激的分子机理初探
图
$
!
!3385
%
C
甲醇"乙醇#对烟草
D@=
与
=>!"8J#
启动子结合的影响
T.
I
+$
!
2EE;9H/8E!3385
%
C3;H:4085
"
;H:4085
#
80D@=Y.06.0
I
7.H:=>!"8J#
G
F838H;F
中
D@=
和
=>!"8J#
启动子序列的结合水平结果
表明随着甲醇和乙醇处理时间的增加!烟草
D@=
与
=>!"8J#
启动子序列结合水平逐渐增加"图
$
#
ABD
扩增相对定量分析结果说明在处理的第
*
天
二者结合的水平分别为对照的
!+%1
和
#+,
倍"图
$
#!这说明甲醇和乙醇刺激能显著增加
D@=
与
=>!"8J#
启动子的结合水平
%
!
讨
!
论
=>
是植物体内一种重要的生长调控因子!参
与植物发育和生长的每个环节的调节!包括种子萌
发!根和茎的伸长!叶片和叶毛的产生(花器官形成
的诱导及雄蕊和果实的发育等)#,)#1*之前的一些研
究报道叶片喷施甲醇可以刺激烟草的生长)#%*!叶片
喷施甲醇或乙醇都能促进西红柿(油菜(万年青的光
合作用和叶片的生长)%*与这些报道的结果一致!
本研究证实在
?@
培养基上添加低浓度"
!3385
%
C
#甲醇和乙醇也刺激烟草幼苗的生长!且添加外源
活性
=>
和
=>
合成抑制剂
A>B
的实验结果说明
甲醇和乙醇刺激烟草的生长和
=>
的合成有关
@3.H:
)
#
*的研究结果表明
D@=
通过控制内源
=>
的含量影响植物的生长!过量表达没有激活域
或
]O>
结合域的
D@=
抑制烟草中正常
D@=
的作
用!严重影响转基因烟草茎细胞的伸长和植株的生
长)#**
D@=
在烟草中的表达没有很强的组织特异
性!因此有人推测
D@=
应该受到转录或翻译后调
控!
L
I
4F4/:.
等)#&*的研究证明
#$)%)%
蛋白参与
D@=
的翻译后调控!
D@=
与
#$)%)%
蛋白的结合抑制
D@=
的细胞核定位作用!不能与
#$)%)%
蛋白结合的
D@=
突变体的转录活性比野生型
D@=
的高!
D@=
突变体主要定位于细胞核中!而野生型
D@=
分布在
整个细胞中!
#$)%)%
蛋白是
D@=
的负调控蛋白!通
过控制它的亚细胞定位控制内源
=>
的含量
D@=
分子中
@;F##$
必须被磷酸化修饰后才能与
#$)%)%
蛋白结合!
LH8
等)!"*的研究鉴定负责对
D@=
进行磷
酸化修饰的蛋白激酶"
B]AW#
#!体内体外的实验结
果表明
B]AW#
与
D@=
的结合需要钙离子本研
究的实验结果说明甲醇或乙醇的刺激虽然都增加
#$)%)%
基因转录和蛋白表达水平!但却减弱
#$)%)%
蛋白与
D@=
的相互作用!因此推测甲醇或乙醇的刺
激可能会减弱
B]AW#
的表达量或抑制其激酶活
性!因而减少
D@=
的磷酸化作用!从而减少其与
#$)
%)%
蛋白的结合
=>#
是烟草中的一种主要活性
=>
)
#
*
!在转基
因烟草过量表达没有激活域或
]O>
结合域的
D@=
抑制原有
D@=
的功能!使转基因烟草中
=>#
的含
量只有野生型的
#&`
!在转基因烟草叶片上喷施
=>#1
可以恢复烟草细胞的伸长作用)!#*
=>#1
是
一种没有生物学活性的
=>
!但是可以通过
=>!")
8J.64/;
的顺序氧化作用氧化为有活性的
=>#
)
!!
*
!
因此
=>)!"
氧化酶"
=>)!"8J.64/;
#是一种重要的
=>
生物合成调控酶
=>!"8J#
的启动子区含有
能与
D@=
结合的顺式作用元件!
D@=
结合顺式元
件的突变可以消除转基因烟草
D@=
与
=>!"8J#
启
动子的结合!
B:LA
分析结果说明
D@=
与
=>!"8J#
启动子的结合可以对
=>
含量的变化产生应答!
=>
含量减少增加二者的结合!促进
=>
合成!反之亦
然本研究发现甲醇或乙醇处理能显著增强
D@=
与
=>!"8J#
启动子的结合!说明甲醇和乙醇刺激烟
草的生长可能通过降低
#$)%)%
蛋白与
D@=
的结
合!增 强
D@=
的 细 胞 核 定 位 作 用 和
D@=
与
=>!"8J#
启动子的结合!增加
=>
的合成!从而促
进烟草生长!这可能是甲醇和乙醇促进植物生长的
一种重要的分子机制
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