全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(４): ３５０￣３５３(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０９￣１６ꎻ 修回日期: ２０１３￣０４￣１５
基金项目: 国家质检总局科技计划项目(２００６ＩＫ２１８)
通讯作者: 李 鑫ꎬ农艺师ꎬ博士ꎬ主要从事植物病害检疫技术研究ꎻ Ｔｅｌ: ０４１１￣８２５８３５２９ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｉｘｉｎ８２０６１０＠１６３. ｃｏｍꎮ
梨衰退植原体 Ｃｙｃｌｅａｖｅ 实时荧光
ＰＣＲ检测方法的建立
李 鑫∗ꎬ 王有福ꎬ 刘卉秋ꎬ 曹冬梅ꎬ 胡 强ꎬ 王秀芬
(辽宁出入境检验检疫局ꎬ 大连 １１６００１)
摘要:根据植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ 保守区设计 Ｃｙｃｌｉｎｇ 探针 ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ及引物ꎬ建立了梨衰退植原体 Ｃｙｃｌｅａｖｅ实时荧光 ＰＣＲ检
测方法ꎮ 结果表明ꎬ探针 ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ 能特异的检测梨衰退植原体ꎬ供试同一组内不同亚组植原体及参试病原细菌均为阴
性ꎬ检测灵敏度可达 ０. ５ ｐｇ / μＬꎮ 该 Ｃｙｃｌｅａｖｅ实时荧光 ＰＣＲ检测方法可用于梨衰退植原体的快速检测ꎬ并为其他有害生物
鉴定提供借鉴依据ꎮ
关键词:梨衰退植原体ꎻ 实时荧光 ＰＣＲꎻ Ｃｙｃｌｉｎｇ 探针
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｅａｒ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｂｙ Ｃｙｃｌｅａｖｅ ｒｅａｌ￣
ｔｉｍｅ ＰＣＲ 　 ＬＩ Ｘｉｎꎬ ＷＡＮＧ Ｙｏｕ￣ｆｕꎬ ＬＩＵ Ｈｕｉ￣ｑｉｕꎬ ＣＡＯ Ｄｏｎｇ￣ｍｅｉꎬ ＨＵ Ｑｉａｎｇꎬ ＷＡＮＧ Ｘｉｕ￣ｆｅｎ
(Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｄａｌｉａｎ １１６００１ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅａｒ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｗｉｔｈ Ｃｙｃｌｅａｖｅ ｐｒｏｂｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｅｓ￣
ｔａｂｌｉｓｈｅｄ. Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎬ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ ｎａｍｅｄ
ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｃａｎ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａꎬ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｐｅａｒ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｎ ｉｔｓ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｉｍｉｌａｒｉ￣
ｔｙꎬ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｐ ｔｏ ０. ５ ｐｇ / μＬ. Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｆａｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅａｒ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈｙｔｏ￣
ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｏｔｈｅｒ ｐｅｓｔｓ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:ｐｅａｒ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎻ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲꎻ ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ
中图分类号: Ｓ４１ꎻ Ｓ６６１. ２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０４￣０３５０￣０４
　 　 梨衰退植原体(Ｐｅａｒ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ)是一
种重要的昆虫传播植原体病害ꎬ主要发生在欧洲和
北美ꎮ 易感病梨树被侵染后ꎬ所结果实小而少ꎬ几
年内即可死亡[１]ꎮ 梨衰退植原体由苗木传带ꎬ我
国未见发生报道ꎬ因其对我国梨业生产的潜在风险
性ꎬ该病害已被列入我国新修订的«进境植物检疫
性有害生物名录» [２]ꎮ
由于植原体不能人工培养ꎬ其检测和鉴定主要
基于分子生物学特性[３]ꎮ 近年来ꎬ植原体的分子
检测技术取得了重要进展[４ ~ ７]ꎬ包括常规 ＰＣＲ、巢
式 ＰＣＲ(Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ)、免疫捕获 ＰＣＲ(Ｉｍｍｕｎｏ ｃａｐ￣
ｔｕｒｅ ＰＣＲꎬ ＩＣ￣ＰＣＲ)和循环 ＰＣＲ(Ｒｃｙｃｌｅｄ ＰＣＲꎬＲ￣
ＰＣＲ)等ꎮ 但这些检测方法也存在过程繁杂、易污
染和假阳性的弊端ꎮ Ｌｉａｏ 等[７]研发了针对植原体
检测的 ＴａｑＭａｎ 实时荧光 ＰＣＲ 方法ꎬ由于植原体
１６Ｓ ｒＤＮＡ的高度同源性ꎬ该探针仅能区分个别组
间的植原体ꎬ而针对同组内不同亚组的植原体则无
法分辨ꎮ Ｃｙｃｌｅａｖｅ 实时荧光 ＰＣＲ 方法是由 ＲＮＡ
和 ＤＮＡ构成的杂合探针(Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ)与 ＲＮａｓｅ
Ｈ 组合使用的高灵敏度检出法ꎮ 本文应用 Ｃｙ￣
ｃｌｅａｖｅ实时荧光 ＰＣＲ技术建立了针对梨衰退植原
体的高特异性检测方法ꎬ能准确的将其他组植原体
　
　 ４ 期 　 　 李 鑫ꎬ等:梨衰退植原体 Ｃｙｃｌｅａｖｅ 实时荧光 ＰＣＲ检测方法的建立
及其同组的苹果丛簇植原体区分开ꎬ操作简便、快
捷ꎬ准确率高ꎮ
１　 材料与方法
１. １　 材料
本试验所用 ８ 个植原体总 ＤＮＡ和 ４ 种细菌菌
株分别由美国农业部分子实验室和中国检验检疫
科学研究院提供ꎮ Ｃｙｃｌｉｎｅ探针合成及试验所需药
剂均购置于大连宝生物公司ꎮ
１. ２　 方法
１. ２. １　 ＰＣＲ Ｃｙｃｌｉｎｅ 特异性探针及引物设计　 从
ＧｅｎＢａｎｋ中调出全部植原体序列ꎬ根据植原体组内
保守而组间基因序列具有稳定性点突变区的特点ꎬ
序列比对后ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ 软件ꎬ针对梨衰
退植原体设计探针 ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ 及其引物(专利申
请号: ２０１０２１８４９９. ５ )ꎮ 探针 ( ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ ): ５′￣
(ＦＡＭ) ＡＴＴＣＴＧＡＣ Ｔ ＧＴＡ (Ｅｃｌｉｐｓｅ)￣３′(方框内
为 ＲＮＡ 碱 基 )ꎮ 上游引物 ＬＳＴ Ｐｒｉｍｅｒ￣Ｆ: ５′￣
ＡＣＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣ￣３′ꎻ下游引物 ＬＳＴ
Ｐｒｉｍｅｒ￣Ｒ: ５′￣ＧＡＴＡＡＣＧＣＴＴＧＣＣＣＣＣＴＡＴＧ￣３′ꎮ
探针和引物由大连宝生物公司合成ꎬ荧光基团为
６￣Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ( ＦＡＭ )ꎬ 淬灭基团为 Ｔｅｒ￣
ａｍｔｈｙｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ(ＴＡＭＲＡ)ꎮ
１. ２. ２　 ＰＣＲ体系和反应条件
(１)样品　 供试植原体及细菌(表 １)ꎮ
　 　 (２)细菌 ＤＮＡ样品的制备 采用细菌 ＤＮＡ 提
取试剂盒提取ꎬ具体步骤见说明书ꎬ送大连宝生物
公司进行质粒的制备ꎮ
(３)植原体样品的制备 以植原体基因组 ＤＮＡ
为模板ꎬ用引物 Ｒ１６ｍＲ１: ５′￣ＣＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＴ￣
ＣＡＴＣ￣３′ꎻＲ１６ｍＦ２:５′￣ＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡ￣
３′进行 ＰＣＲ扩增ꎬ得到大小约 １. ５ ｋｂ的产物ꎬ克隆
到 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体上ꎮ 提纯含 １６Ｓ ｒＤＮＡ 质粒ꎬ
－２０℃冰箱保存备用ꎮ
(４)实时荧光 ＰＣＲ 反应体系:２ × Ｃｙｃｌｅａｖｅ
ＰＣＲ 反应液ꎬ１２. ５ μＬꎻ引物混合液(１０ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ
１ μＬꎻ探针(３ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ１ μＬꎻ模板ꎬ１ μＬꎻｄｄＨ２Ｏꎬ
９. ５ μＬꎬ总体积为 ２５ μＬꎮ 反应条件: ９５℃预变性
１０ ｓꎻ ９５℃变性 ５ ｓꎬ ５５℃退火 １０ ｓꎬ４５ 个循环ꎻ
７２℃延伸 １５ ｓꎮ
１. ２. ３　 探针和引物灵敏度检测　 将纯化的梨衰退
植原体质粒 ＤＮＡ按 １０ 倍比例系列稀释 ７ 个浓度
梯度 ５００ ｎｇ / μＬ、５０ ｎｇ / μＬ、５ ｎｇ / μＬ、５００ ｐｇ / μＬ、
５０ ｐｇ / μＬ、５ ｐｇ / μＬ、０. ５ ｐｇ / μＬꎬ分别加入相同的
特异性引物和 ｃｙｃｌｉｎｇ探针ꎬ在其他条件不变ꎬ退火
温度为 ５５ ℃下进行扩增ꎬ检测该探针的灵敏度ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ａ Ａｐｐｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｐｐｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ(１６ＳｒⅩ￣Ａ)
Ｐ Ｐｅａｒ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｐｐｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ(１６ＳｒⅩ￣Ｃ)
ＸＴＬＪ Ａｓｈ ｙｅｌｌｏｗｓ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｐｐｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ(１６ＳｒⅦ￣Ａ)
Ｃ Ｃｈｅｒｒｙ ｌｅｔｈａｌ ｙｅｌｌｏｗｓ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｓｈ ｙｅｌｌｏｗｓ ｇｒｏｕｐ(１６ＳｒⅤ￣Ｂ)
Ｘ Ｐｅａｃｈ Ｘ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ Ｘ￣ｄｉｓｅａｓｅ ｇｒｏｕｐ(１６ＳｒⅢ￣Ａ)
Ｇ３ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｙｅｌｌｏｗｓ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ Ｓｔｏｌｂｕｒ ｇｒｏｕｐ(１６ＳｒⅫ￣Ｂ)
Ｇ５ Ｖｉｒｇｉｎｉａ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｙｅｌｌｏｗｓ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ Ｘ￣ｄｉｓｅａｓｅ ｇｒｏｕｐ(１６ＳｒⅢ￣Ａ)
Ｇ１２ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｃｅ ｄｏｒéｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ Ｅｌｍ ｙｅｌｌｅｗｓ ｇｒｏｕｐ(１６ＳｒＶ￣Ｃ)
Ｂａｃｔｅｒｉａ￣１ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
Ｂａｃｔｅｒｉａ￣２ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｅｒｗｉｎｉａ
Ｂａｃｔｅｒｉａ￣３ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
Ｂａｃｔｅｒｉａ￣４ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
Ｂａｃｔｅｒｉａ￣５ Ｃｌａｖｉｂａｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ
１５３
　
植物病理学报 ４３ 卷
２　 结果与分析
２. １　 探针 ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ检测特异性
试验结果表明:ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ 能区分植原体和细
菌ꎬ在供试的 ８ 种植原体中能准确检出梨衰退植原
体ꎬ其余参试植原体及清水对照均为阴性ꎻ
ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ对梨衰退植原体有较强的特异性ꎬ在区
分植原体与细菌的基础上ꎬ也能将同一组内不同亚
组的植原体进行鉴别(表 ２、图 １)ꎮ
２. ２　 探针 ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ 检测灵敏度
灵敏度测试结果表明(图 ２):随模板稀释倍数
的增加ꎬ该探针检测的灵敏度随之减弱ꎬ当 ＤＮＡ
浓度稀释至 ０. ５ ｐｇ / μＬ时ꎬＣｔ 值已达到 ３５ꎬ扩增效
率降到最低ꎬ说明探针 ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ 检测灵敏度达
０. ５ ｐｇ / μＬꎮ
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ
Ｓａｍｐｌｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｒｅｓｕｌｔ
１ Ｈ２Ｏ －
２ Ｇ５ －
３ Ｇ３ －
４ Ｇ１２ －
５ Ｘ －
６ Ａ －
７ Ｃ －
８ Ｐｅａｒ ｄｅｃｌｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ＋
９ Ｂａｃｔｅｒｉａ￣１ －
１０ Ｂａｃｔｅｒｉａ￣２ －
１１ Ｂａｃｔｅｒｉａ￣３ －
１２ Ｂａｃｔｅｒｉａ￣４ －
１３ Ｂａｃｔｅｒｉａ￣５ －
Ｎｏｔｅ: “ ＋ ” ｍｅａｎｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅꎻ “ － ” ｍｅａｎｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ.
Ｆｉｇ. １　 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｌｉｎｅ ｏｆ ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ
Ｆｉｇ. ２　 ＬＳＴ２ｐｒｏｂｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ
Ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｒｏｍ ｌｅｆｔ ｔｏ ｒｉｇｈｔ ｗｅｒｅ ５００ ｎｇ / μＬ、５０ ｎｇ / μＬ、５ ｎｇ / μＬ、５００ ｐｇ / μＬ、
５０ ｐｇ / μＬ、５ ｐｇ / μＬ、０. ５ ｐｇ / μＬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
３　 结论与讨论
梨衰退植原体除危害梨树外ꎬ还可危害苹果、
榅桲、桃树和其他一些蔷薇科果树ꎮ １９４５ ~ １９４７
年因其危害意大利 ５ 万株梨树被毁ꎮ 梨和苹果在
我国种植面积大、范围广ꎬ这些果树种植地区都是
该病原物的适生范围ꎮ 此外ꎬ感染梨衰退植原体苗
木多隐症带菌ꎮ 随着国际贸易往来的增加ꎬ一旦该
病原随无症带菌苗木调运传入我国ꎬ势必给我国的
水果产业带来不可估量的损失ꎮ
由于植原体不能分离培养ꎬ长期以来该类病原
鉴定存在较大困难ꎬ多采用电镜观察、血清检测、
ＲＦＬＰ分析等方法ꎬ而这 ３ 种不同的检测方法难以
满足我国口岸快速检测需求ꎮ 随着检测技术的不
断发展和完善ꎬＰＣＲ 方法以灵敏度高、检测数量
多、快速等优势在植原体检测和鉴定方面被广泛应
２５３
　
　 ４ 期 　 　 李 鑫ꎬ等:梨衰退植原体 Ｃｙｃｌｅａｖｅ 实时荧光 ＰＣＲ检测方法的建立
用ꎬ目前应用较多的是巢氏 ＰＣＲ 和 ＴａｑＭａｎ 实时
荧光 ＰＣＲꎬ但由于植原体保守区同源性相对较高ꎬ
这些 ＰＣＲ方法仅能区分个别组间植原体ꎬ而针对
同组内不同亚组的植原体则无法进行明确鉴别ꎮ
本研究建立的梨衰退植原体 Ｃｙｃｌｅａｖｅ 实时荧
光 ＰＣＲ检测方法ꎬ不仅具备了实时荧光 ＰＣＲ 法的
快速、可定量的特点ꎬ还具有特异性高的优势ꎬ能区
分仅个别碱基存在差异的植原体ꎬ灵敏度高达 ０. ５
ｐｇ / μＬꎮ 此方法的研发提高了梨衰退植原体的检
出率及检测速度ꎬ操作简便ꎬ大大降低了污染的风
险ꎮ 该方法的应用也是首次将医学中常用的检测
技术引入植物检疫领域ꎮ
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ｍｉｘｅｄ￣ＭＬＯ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔ[ Ｊ] . Ｐｈｙ￣
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责任编辑:于金枝
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