全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４３(４): ３４４￣３４９(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０９￣２５ꎻ 修回日期: ２０１３￣０３￣３０
基金项目: 质检公益性行业科研专项(２００８１０５１７￣２￣２)ꎻ 天津农学院科学研究发展基金计划(２００９Ｄ０３)
通讯作者: 陈招荣ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事植物病毒及植物菌原体虫传机理研究ꎻ Ｔｅｌ: ０２２￣２３７９１３０１ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｃｈｅｎｚｒ２０００＠ｙａｈｏｏ. ｃｎꎮ
桃黄化病植原体昆虫介体的验证
及其带毒部位 ＰＣＲ检测
陈招荣１∗ꎬ 周 涛２ꎬ 赵文军３
( １天津农学院园艺系ꎬ 天津 ３００３８４ꎻ ２中国农业大学农学与生物技术学院植物病理系ꎬ 北京 １００１９３ꎻ
３中国检验检疫科学研究院ꎬ 北京 １０００２９)
摘要:利用植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ通用引物对采集的北京和天津黄化病桃树总 ＤＮＡ进行巢式 ＰＣＲ检测ꎬ证明发病样本的病原
为桃黄化病植原体ꎮ 经过检测昆虫总 ＤＮＡ和经取食过的人工培养液 ＤＮＡ中桃黄化病植原体的 １６Ｓ ｒＤＮＡꎬ结果表明桃黄
化病植原体的有效传播媒介昆虫为桃一点叶蝉ꎮ 将带毒桃一点叶蝉个体的头部、胸部以及腹部分离ꎬ分别在这些部位检测
到桃黄化病植原体的 １６Ｓ ｒＤＮＡꎬ说明桃一点叶蝉的头部、胸部以及腹部都可带毒ꎬ表明植原体可从植物汁液进入叶蝉的口
针、食道和肠道ꎮ
关键词:桃黄化病ꎻ 植原体ꎻ 昆虫介体ꎻ 桃一点叶蝉ꎻ 巢式 ＰＣＲ
Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｅｃｔ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐ. ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ
Ｐｅａｃｈ ｙｅｌｌｏｗ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐ. ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ＣＨＥＮ
Ｚｈａｏ￣ｒｏｎｇ１ꎬ ＺＨＯＵ Ｔａｏ２ꎬ ＺＨＡＯ Ｗｅｎ￣ｊｕｎ３ ( １Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｔｉａｎｊｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔｉａｎｊｉｎ
３００３８４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２９ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ａｒｅ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｂｙ ｐｈｌｏｅｍ￣ｆｅｅｄｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔｓ. Ｗｉｔｈ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎬ
ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｆｒｏｍ Ｂｅｉｊｉｎｇ ａｎｄ Ｔｉａｎｊｉｎ ｄｉｓｔｒｉｃｔ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｄ
ｐｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅｓ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｏｒ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ
ｉｎｓｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｓ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ ｓｕｄｒａ
ｗａｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｐｅａｃｈ ｙｅｌｌｏｗ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ. Ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｅｐｈａｌｏｓｏｍｅꎬ
ｔｈｏｒａｃｉｃ ａｎｄ ｕｒｏｓｏｍａｌ ｒｅｇｉｏｎｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｗｅｒｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉ￣
ｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｅ. ｓｕｄｒａ. Ｉｔ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｗｅｒｅ ｉｎｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔ ｓａｐ ａｎｄ ｍｏｖｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ
ｓｔｙｌｅｔ’ｓ ｆｏｏｄ ｃａｎａｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｅａｃｈ ｙｅｌｌｏｗ ｄｉｓｅａｓｅꎻ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎻ ｉｎｓｅｃｔ ｖｅｃｔｏｒꎻ Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ ｓｕｄｒａꎻ ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３６. ６２１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０４￣０３４４￣０６
世界范围内植原体可引起 １ ０００ 多种植物系
统性病害ꎬ我国已报道 １００ 多种植物病害与植原
体有关[１] ꎮ 如ꎬ枣疯病、泡桐丛枝病、竹子丛枝病
和桃黄化病在我国分布广泛ꎬ危害严重ꎮ 桃黄化
病的危害日趋严重ꎬ导致树势衰弱ꎬ产量和品质
下降[２] ꎮ 桃树黄化病植原体侵染植物后ꎬ引起寄
主植物代谢紊乱ꎬ使植物叶片产生明显黄化ꎬ通
常是叶片中央向叶缘变黄ꎬ出现不规则黄绿斑驳
４ 期 陈招荣ꎬ等:桃黄化病植原体昆虫介体的验证及其带毒部位 ＰＣＲ检测
或全叶变黄ꎬ常伴有节间缩短等症状ꎬ此外还伴
生衰退、簇生、矮化、小叶等症状ꎮ Ｈｕａｎｇ 等[３]确
定四川桃黄化病病原为植原体ꎬ通过分子生物学
检测结果表明ꎬ樱桃致死黄化病植原体与桃黄化
病植原体同属于 １６ＳｒＶ 组成员ꎬ与枣疯病植原体
同源性较高ꎮ
自然条件下ꎬ植原体主要以韧皮部饲食昆虫为
媒介进行扩散传播ꎬ该类昆虫主要有叶蝉、飞虱、和
木虱等[４]ꎮ 国内广泛发生的植原体中ꎬ泡桐丛枝
植原体的传播昆虫有:大青叶蝉 (Ｃｉｃａｄｅｌｌａ ｖｉｒｉ￣
ｄｉｓ)、茶翅蝽(Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ ｐｉｃｕｓ)、烟草盲蝽(Ｃｙｒ￣
ｔｏｐｅｌｔｉｓ ｔｅｎｕｉｓ) [５]ꎻ枣疯病植原体的传播介体主要
有 ３ 种叶蝉:缘菱纹叶蝉 ( Ｈｉｓｈｉｍｏｎｕｓ ｓｅｌｌａｔｕｓ
Ｕｈｌｅｒ)、橙带拟菱纹叶蝉(Ｈｉｓｈｉｍｏｎｏｉｄｅｓ ａｕｒｉｆａｃｉａ￣
ｌｅａ Ｋｕａｈ)、红闪小叶蝉(Ｔｙｐｈｌｏｃｙｐａ ｓｐｐ. )ꎮ Ｎｉｓｈｉ￣
ｇａｗａ 等[６] (２００２)将洋葱黄化植原体通过叶蝉传
播到多汁植物茼蒿上ꎬＢａｉ等[７] (２００６)将翠菊黄化
丛枝植原体通过叶蝉分别传播到莴苣(Ｌａｃｔｕｃａ ｓａ￣
ｔｉｖａ Ｌ. )、拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)和本生烟
(Ｔａｂａｃｕｍ ｂｅｎｔｈｅｍｉａｎａ)上ꎬ方便了植原体的提纯
和植原体 ＤＮＡ 的提取ꎮ 目前国内对桃黄化病植
原体昆虫介体的研究还很少ꎮ
本研究以桃树黄化病植原体为材料利用人工
培养液筛选桃黄化病植原体的昆虫介体ꎬ巢式
ＰＣＲ检测植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡꎬ在显微镜下解剖昆虫
体将口针和肠道部位分离ꎬ分别进行巢式 ＰＣＲ 检
测ꎬ研究植原体在昆虫体内的循回情况ꎬ并探讨媒
介昆虫传毒机制ꎮ
１ 材料与方法
１. １ 植物材料来源
发病桃树分别来源于北京市朝阳区以及天津
市大港油田团泊洼实验基地ꎮ 供试昆虫捕获于天
津市大港油田团泊洼实验基地发病桃园ꎮ
１. ２ 昆虫培养[８]
将捕获的昆虫培养在含有 ２９０ μＬ人工培养液
(配方:１００ ｍＬ的 ＴＥ缓冲液中加入 ５ ｇ蔗糖ꎬ湿热
灭菌 １２０℃ꎬ１５ ｍｉｎ)的 １. ５ ｍＬ 特制 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管
中[８]ꎮ 观察昆虫的取食行为和存活期ꎮ
培养管的制作方法:取黄色 １. ５ ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
管的管帽ꎬ加人 ２９０ μＬ 人工培养液(正好可将管
帽加满)ꎬ将 Ｐａｒａｆｉｌｍ膜拉伸的尽可能薄ꎬ覆盖在管
帽上ꎮ 另取一个无色透明的 １. ５ ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管
剪去管帽和管子底部ꎬ将管身倒扣在装有人工培养
液的管帽上压紧ꎮ 将昆虫从管底的切口引入ꎬ用棉
花堵塞孔口ꎮ 将装配好的培养管平放ꎬ管帽朝向光
源ꎬ室温培养 ５ ~ ７ｄꎮ
１. ３ 总 ＤＮＡ抽提
１. ３. １ 植物总 ＤＮＡ 的提取 分别取 ３ ｇ 桃树植
原体黄化病株及健康植株的叶脉ꎬ参照 Ｌｅｅ 等[９]
的方法提取 ＤＮＡꎮ 然后于 － ２０℃冰箱中保存备
用ꎮ
１. ３. ２ 昆虫虫体 ＤＮＡ 的提取 培养结束后ꎬ将
每 ５ 只昆虫放入研钵中研磨ꎮ 按照 Ａｎ 等[１０]的方
法抽提昆虫总 ＤＮＡꎬ最终溶于 ５０ μＬ ＴＥ缓冲液ꎮ
１. ３. ３ 人工培养液 ＤＮＡ 的提取 培养结束后ꎬ
将含有人工培养液的管帽从原管身取下ꎬ倒扣在另
一 １. ５ ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管上短暂离心ꎬ收集人工培
养液ꎮ 每种昆虫收集 １０ 个虫体的人工培养液ꎬ按
照 Ｔａｎｎｅ等[１１]的方法抽提昆虫在取食时可能分泌
到液体培养基中的植原体 ＤＮＡꎮ 将昆虫取食后的
培养液在 １２ ０００ ｇ条件下离心 １５ ｍｉｎꎬ保留沉淀ꎬ
在沉淀中加入 １０ μＬ ０. ５ ｍｏｌ / Ｌ ＮａＯＨꎬ然后加入
２０ μＬ １ ｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ缓冲液(ｐＨ ８. ０ꎬ含有 １％
十二烷基磺酸钠和 ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡ)ꎬ混合物在
６５℃下温育 １５ ｍｉｎꎬ最终溶于 ２０ μＬ ＴＥ 缓冲液ꎮ
加入 ２ 倍体积无水乙醇ꎬ在 － ２０℃保持 ３０ ｍｉｎ 充
分沉淀ꎮ 然后 １２ ０００ ｇ离心 ２０ ｍｉｎ 沉淀 ＤＮＡꎬ最
终溶于 ３０ μＬ ＴＥ缓冲液ꎮ
１. ３. ４ 昆虫虫体的解剖和 ＤＮＡ 的提取 取在病
株叶片上获取的桃一点叶蝉 ５ 头ꎬ在解剖镜下将其
头部、胸腔和腹部分别剥开ꎬ然后按照 Ａｎ 等[１０]的
方法抽提昆虫总 ＤＮＡꎬ最终溶于 ５０ μＬ ＴＥ 缓冲
液ꎮ
１. ４ ＰＣＲ检测
１. ４. １ １６Ｓ ｒＤＮＡ的 ＰＣＲ 扩增 根据植原体 １６Ｓ
ｒＤＮＡ保守区序列ꎬ参照 Ｌｅｅ 等[９]的序列合成植原
体检测特异引物ꎮ ＰＣＲ 引物对分别为 Ｒ１６ｍＦ２
( ５′￣ＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡ￣３′) 和 Ｒ１６ｍＲ２
(５′￣ＣＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＴＣＡＴＣＧＡＣ￣３′)ꎬ由宝生物
工程(大连)有限公司合成ꎮ 以北京桃黄化病病株
总 ＤＮＡ为阳性对照ꎬ桃健康株总 ＤＮＡ 为阴性对
５４３
植物病理学报 ４３ 卷
照ꎬ以超纯水为空白对照ꎮ ＰＣＲ 反应体系为 ５０
μＬꎬ其中 １０ × ｂｕｆｆｅｒ (无ＭｇＣｌ２) ５ μＬꎬ０. ２５ ｍｏｌ / Ｌ
ＭｇＣｌ２ ２５ μＬꎬ １０ ｍｍｏｌ ４ × ｄＮＴＰｓ ８ μＬꎬ模板 ＤＮＡ
２０ ｎｇꎬ１０ ｐｍｏｌ引物各 ２ μＬꎬＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０. ５
μＬꎬ灭菌去离子水 ２５. ５ μＬꎮ ＰＣＲ 扩增条件为:变
性 ９４℃ ４ ｍｉｎꎬ复性 ５０℃ １ ｍｉｎꎬ延伸 ７２℃ ２ ｍｉｎꎻ
然后变性 ９４℃ １ ｍｉｎ ３０ ｓꎬ５０℃复性 １ ｍｉｎ ３０ ｓꎬ
７２℃延伸 ２ ｍｉｎ ３０ ｓꎬ３５ 次循环ꎻ变性 ９４℃ ３０ ｓꎬ
５０℃复性 １ ｍｉｎ １５ ｓꎬ７２℃延伸 ２ ｍｉｎ ３０ ｓꎻ最后
７２℃保温 １０ ｍｉｎꎬ ４℃保存备用ꎮ 取 ５ μＬ ＰＣＲ 产
物进行 １％的琼脂糖凝胶(加 ０. ０５ μＬ / ｍＬ Ｇｏｌｄ￣
ｖｉｅｗ核酸染料)电泳ꎬ紫外检测仪 ２５４ ｎｍ 波长下
观察并拍照ꎮ
１. ４. ２ １６Ｓ ｒＤＮＡ 的巢式 ＰＣＲ ( ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ)扩
增 参照 Ｌｅｅ 等[９]的序列合成 ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ 的第二
对引物ꎬ引物对分别为 Ｒ１６Ｆ２ｎ (５′￣ＧＡＡＡＣＧＡＣＴ￣
ＧＣＴＡＡＧＡＣＴＧＧ￣３′)和 Ｒ１６Ｒ２ｎ (５′￣ＴＧＡＣＧＧＧ￣
ＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＣＣＣＣＧ￣３′)ꎮ 将Ｒ１６ｍＦ２/ Ｒ１６ｍＲ２
为引物 ＰＣＲ 扩增获得的产物稀释 ３０ 倍后作为
ＤＮＡ 模板ꎬ进行再次 ＰＣＲ 反应:９５℃ 预变性 ５
ｍｉｎꎻ９５℃ ３０ ｓꎬ５７℃ １ ｍｉｎꎬ ７２℃ １ ｍｉｎꎬ ４０ 次循
环ꎻ最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
１. ４. ３ ＤＮＡ 序列测定 ＰＣＲ 产物纯化后送至宝
生物工程(大连)有限公司测序分析ꎮ
２ 结果与分析
２. １ 发病桃树样品的 １６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ检测结果
采用植原体通用引物对 Ｒ１６ｍＦ２ / Ｒ１６ｍＲ２ 对
桃树黄化病病树、枣疯病病树和无病桃树各样品总
ＤＮＡ提取液进行 ＰＣＲ检测ꎬ从北京和天津团泊洼
的桃黄化病植株中获得 １. ４ ｋｂ 大小条带ꎬ阴性对
照与空白对照无相对条带出现ꎮ ＰＣＲ 产物纯化回
收稀释 ５０ 倍后ꎬ利用 ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ 引物进行扩增ꎮ
扩增出大小约为 １. ２ ｋｂ 条带ꎬ与 Ｈｕａｎｇ 等[３]结果
一致ꎮ 该片段测序结果与其发表的序列(ＧｅｎＢａｎｋ
登录号为 ｌｃｌ１￣１１０８３)同源性达 ９８. ８％ ꎮ 说明从北
京和天津团泊洼所采集的样品中含有同源性较高
的桃黄化植原体ꎮ
２. ２ 昆虫介体筛选鉴定
２. ２. １ 带毒昆虫 １６Ｓ ｒＤＮＡ的 ＰＣＲ检测结果 从
桃林中采集了 ５ 种常见的韧皮部取食昆虫ꎬ经室内
鉴定分别为桃一点叶蝉(Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ ｓｕｄｒａ)、桃
蚜(Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ)、二星叶蝉 ( Ｅ. ａｐｉｃａｌｉｓ Ｎａ￣
ｗａ)、绿盲蝽(Ｌｙｇｏｃｏｒｉｓ ｌｕｃｏｒｕｍ)和大青叶蝉(Ｃｉ￣
ｃａｄｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ)ꎮ
用巢式 ＰＣＲ法检测各种昆虫体以及其培养液
中植原体的 １６Ｓ ｒＤＮＡ片段ꎮ 结果显示每次检测 ５
只昆虫的总 ＤＮＡ 以及 １０ 只昆虫的培养液 ＤＮＡꎬ
只有桃一点叶蝉的体内和培养液中能扩增出目标
条带ꎬ大小约为 １. ２ ｋｂ(表 １、图 １)ꎬ说明在昆虫体
内含有桃黄化病植原体ꎮ
２. ２. ２ 培养液 １６Ｓ ｒＤＮＡ 的 ＰＣＲ 检测结果 昆
虫取食人工培养液后ꎬ在虫体 ＰＣＲ 为阳性的前提
下ꎬ如果对应的人工培养液的检测结果也呈阳性ꎬ
则表明该种类昆虫是植原体的传播介体ꎮ 试验结
果表明(图 ２):在桃一点叶蝉的培养液中检测到植
原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ片段ꎬ说明桃一点叶蝉为桃黄化病
植原体的有效传播介体ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｖａｒｉｏｕｓ ｉｎｓｅｃｔｓ
Ｉｎｓｅｃｔ ｖａｒｉｅｔｙ Ｔｅｓｔ ｔｉｍｅ
Ｔｉｍｅ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔ
Ｉｎｓｅｃｔ (５ ｐｅｒ ｔｉｍｅ) Ｍｅｄｉｕｍ (１０ ｐｅｒ ｔｉｍｅ)
Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ ｓｕｄｒａ ４ ４ ３
Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ ３ ０ ０
Ｅ. ａｐｉｃａｌｉｓ ３ ０ ０
Ｌｙｇｏｃｏｒｉｓ ｌｕｃｏｒｕｍ ３ ０ ０
Ｃｉｃａｄｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ ３ ０ ０
６４３
４ 期 陈招荣ꎬ等:桃黄化病植原体昆虫介体的验证及其带毒部位 ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ. １ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ￣
ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ
ｉｎｓｅｃｔ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ
Ｌａｎｅ Ｍ:Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １ꎬ ２. :Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ ｓｕｄｒａꎻ Ｌａｎｅ ３ :
Ｅ. ａｐｉｃａｌｉｓꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｌｙｇｏｃｏｒｉｓ ｌｕ￣
ｃｏｒｕｍ ꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｃｉｃａｄｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ.
Ｆｉｇ. ２ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｍ￣
ｐｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ ａｐｉｃａｌｉｓꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｅ.
ｓｕｄｒａꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｌｙｇｏｃｏｒｉｓ ｌｕｃｏｒｕｍꎻ
Ｌａｎｅ ５: Ｃｉｃａｄｅｌｌａ ｖｉｒｉｄｉｓ.
２. ３ 介体昆虫带毒部位的检测鉴定
分别剥离桃一点叶蝉的头部、胸部和腹部组
织ꎬ检测其总 ＤＮＡ 中植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ 片段ꎬ结
果如图 ３ 所示:桃一点叶蝉的 ３ 个部位均能扩增
出目标条带ꎬ大小约为 １. ２ ｋｂꎬ说明昆虫头部、胸
部和腹部均含有桃黄化病植原体ꎮ 分析叶蝉消
化系统ꎬ桃黄化植原体分布于桃一点叶蝉的口
针、唾液腺、肠道(中肠和直肠)中ꎮ
３ 讨论
利用植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ 通用引物对桃黄化病
植株的总 ＤＮＡ 进行了巢式 ＰＣＲ 扩增ꎬ获得了相
应大小的 ＤＮＡ 片段ꎬ将其与 Ｈｕａｎｇ 等[３]的检测
结果进行比较ꎬ序列比对同源性达 ９８. ８％ ꎮ 从分
子水平上证明了从北京和天津采集的桃黄化病
Ｆｉｇ. ３ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｍ￣
ｐｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ
Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ ｓｕｄｒａ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｃｅｐｈａｌｏｓｏｍｅꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｔｈｏｒａｃｉｃ
ｒｅｇｉｏｎꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｕｒｏｓｏｍｅ.
的病原与植原体序列枣疯病 ＪＷＢ、桃黄化病 ＰＹ￣
Ｉｎ 及油桃黄化病 ＮｅｃＹ￣Ｉｎ１ 高度同源ꎬ同属于
１６ＳｒＶ组成员ꎮ
由于植原体在自然条件下传播的主要方式是
以韧皮部饲食的昆虫作为媒介ꎬ叶蝉为其重要的
传播媒介昆虫[１１] ꎮ 本研究从发病桃园中捕捉了
５ 种刺吸式口器的昆虫ꎬ发现只有桃一点叶蝉带
毒ꎬ结合人工培养液室内检测结果ꎬ初步确定桃
一点叶蝉为桃黄化病植原体的有效传播介体ꎮ
桃一点叶蝉又名桃小绿叶蝉ꎬ体长 ３ ｍｍ ~ ３. ５
ｍｍꎬ每年 ３ 月初桃树现蕾时开始从田间杂草迁
移危害ꎬ夏季和初秋为危害高峰ꎬ有世代重叠现
象ꎬ是桃树的主要叶部害虫[１２] ꎮ 其为害初期至夏
季的高峰期都能携带并传播植原体ꎬ使桃黄化病
在夏季达到发病高峰ꎮ 本研究选用的昆虫桃一
点叶蝉、桃蚜、二星叶蝉、绿盲蝽和大青叶蝉个体
大小适中ꎬ对黄色都有一定的趋性ꎬ适合于人工
培养液法的培养和检测ꎬ可以在室内快速验证昆
虫的带毒能力ꎮ
植原体一般由昆虫介体以持久性方式传播ꎬ
可在昆虫体内繁殖[５] ꎮ Ｌａｂｒｏｕｓｓａａ 等[１６]认为植
物病原柔膜细菌ꎬ即植原体和螺原体ꎬ从植物韧
皮部通过口针取食进入昆虫介体细胞中ꎬ穿过肠
道壁再进入淋巴细胞中进行繁殖ꎬ最后再进入到
唾液腺中ꎬ完成在昆虫体内的循环ꎮ Ｈｏｇｅｎｈｏｕｔ
等[１３] (２００８)提出植原体在植物和昆虫体内的移
动假说ꎬ认为植原体通过昆虫口针吸取从植物的
韧皮部进入昆虫体内ꎬ依次通过昆虫消化系统的
７４３
植物病理学报 ４３ 卷
肠道、食道、前中肠、中肠、滤池、马氏管和后肠ꎬ
通过电镜在唾液腺的分泌细胞和中肠上皮细胞
可以观察到植原体ꎬ而且在含有植原体的细胞中
线粒体和内质网等细胞器都有不同程度的解体
和萎缩ꎬ说明植原体可能使昆虫细胞致病ꎬ甚至
进行繁殖ꎮ 植原体还可通过 ＡＭＰ 与肠道周围肌
肉细胞中的肌动蛋白、肌凝蛋白形成复合体ꎬ帮
助植原体细胞的定位[１４] ꎮ 此外ꎬ在植物病原螺原
体与介体昆虫叶蝉的互作研究中ꎬ人们发现螺原
体可通过叶蝉的唾液腺和肠道ꎬ而且其编码的磷
酸甘油酸激酶蛋白与叶蝉唾液腺细胞中的肌动
蛋白特异性互作识别ꎬ使得螺原体能够进入叶蝉
的细胞中[１５ꎬ１６] ꎮ 本试验将桃一点叶蝉的头部、胸
部和腹部分隔ꎬ头部主要含有口针、食道和唾液
腺ꎻ胸部含有胃囊和中肠ꎻ腹部包含了直肠部分ꎬ
结果证明这三部分都能检测到植原体 １６Ｓ
ｒＤＮＡꎬ可以推测桃黄化病植原体分布于桃一点
叶蝉的口针、唾液腺、肠道(中肠和马氏管)中ꎮ
本试验证实桃一点叶蝉的头部、胸部和腹部
检测到植原体ꎬ这些部位分别包含唾液腺、肠道、
血淋巴ꎬ说明桃黄化病植原体可能通过或定位于
叶蝉头部、胸部和腹部的相应器官中ꎮ 这为进一
步分析昆虫介体传播植原体的机制提供了重要
研究证据ꎬ对于植原体病害的防治具有重要的理
论和实践意义ꎮ
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责任编辑:于金枝
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