全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#&)##)#%
&修改稿收到日期$
!"#$)"#)#!
基金项目$国家天然橡胶产业技术体系"
0123)%&)45#
#&国家自然科学基金"
%#%""$"&
#
作者简介$吴绍华"
#67%
#!男!博士!助理研究员!主要从事橡胶树分子生物学研究
8)9:-;
$
<=.>:?>=:*"%
!
#(%+@?9
"
通信作者$田维敏!博士!教授!主要从事植物发育生物学研究
8)9:-;
$
<9A-:/
!
#(%+@?9
巴西橡胶树
12344$
基因的克隆及表达分析
吴绍华#!张世鑫#!!杨署光#!田维敏#"
"
#
中国热带农业科学院橡胶研究所!农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室!省部共建国家重点实验室培育基地
)
海
南省热带作物栽培生理学重点实验室!海南儋州
$*#*%*
&
!
海南大学 园艺园林学院!海口
$*"!!7
#
摘
!
要$采用
2108
技术!从橡胶树(热研
*)%%)6*
)中克隆了
#
个促分裂原活化蛋白激酶的激酶"
BCC
#基因
!"#
$%%&
该基因全长
@DE1
序列
#$7"F
G
!编码框
#"$6F
G
!编码
%$!
个氨基酸!含有
3
*
HC@
结构域!其编码蛋白的
分子量为
%7+7%ID
!理论等电点为
6+%(
实时荧光定量
J02
结果显示!
!"$%%&
在橡胶树的根+树皮+胶乳及叶
片中均有表达割胶+茉莉酸甲酯和乙烯利均能上调胶乳中
!"$%%&
基因的表达!基因相对表达量分别在割胶后
!>
+茉莉酸甲酯处理
7>
和乙烯利处理
&>
后达到最高研究结果推测
!"$%%&
可能通过
B1JC
信号途径参与
茉莉酸信号途径的响应!可能在天然橡胶生物合成调控中起关键作用
关键词$巴西橡胶树&
!"$%%&
&基因克隆&基因表达分析
中图分类号$
K*7(
文献标志码$
1
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.
*-!/0
1
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3+"41)5)$2($6-*-)/6-6
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V
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V
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V
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Q
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V
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FSTATSS@;?/S
(
01H13*)%%)6*
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F
V
2108+RA<:.#$7"F:.S
G
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"
F
G
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Q
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Q
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G
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G
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_
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HC@U?9:-/+0?9
G
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Q
U-WWSTS/A
A-..=S..>?:A!"$%%&<:.SO
G
TS..SU-/T??A
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G
A;SZS;.
Q
/-W-@:/A;
V
=
G
TS
Q
=;:ASU-/;:ASOF
V
A:
GG
-/
Q
!
9SA>
V
;
,
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G
>?/ATS:A9S/AW?TT=FFST
ATSS+H>SAT:/.@T-
G
A;SZS;.
G
S:ISU-/!>?=T.F
V
A:
GG
-/
Q
!
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V
9SA>
V
;
,
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V
SA>S
G
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TS.
G
S@A-ZS;
V
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QQ
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!
9-
Q
>A
G
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V
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V
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G
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V
-/T=FFSTATSS+
;
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$
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&
!"$%%&
&
Q
S/S@;?/S
&
Q
S/SSO
G
TS..-?/:/:;
V
.-.
!!
橡胶作为世界四大工业原材料之一!是一种重
要的战略物资目前!
66a
以上的天然橡胶来源于
巴西橡胶树"
!&&(")(*+,+&-*+*
#巴西橡胶树原产
于高温+高湿+静风的巴西亚马逊河流域!是典型的
热带雨林树种中国种植橡胶树的区域主要位于
E
#7b
"
!&b
的热带北缘地区"主要是海南+云南和广
东#橡胶树是一种异花授粉高度杂合的多年生木
本经济作物!传统的杂交育种周期长!从人工授粉苗
开始到选出一个供生产上大规模推广种植的品种一
般需要
%"
年时间为了缩短育种年限!提高选种效
率!减少土地+人力+物力的消耗!发展对杂交后代的
早期筛选技术及从分子水平上改良橡胶树品质是行
之有效的方法由于对橡胶树产量调控分子机理缺
乏足够的了解!在分子标记辅助育种及转基因改良
橡胶树品质上难以取得突破!限制了橡胶树产量育
种的进程因此!天然橡胶生物合成调控分子机理
的研究就显得迫切而重要早在
!"""
年!郝秉中
等,#-研究证明茉莉酸类物质"
,
:.9?/:AS.
!
1`
#是调
节巴西橡胶树乳管分化的关键信号分子外施
1`
可显著上调橡胶生物合成关键酶的基因表达!并能
提高胶乳的干胶含量,!-据此!推测天然橡胶的生
物合成可能受茉莉酸信号途径的调节但到目前为
止!对于
1`
如何调控天然橡胶生物合成的机理了
解的较少促分裂原活化蛋白激酶"
9-A?
Q
S/:@A-)
Z:ASU
G
T?AS-/I-/:.S
!
B1JC
#级联途径是真核生物
中保守的信号途径!由促分裂原活化蛋白激酶
"
B1JC
#+促分裂原活化蛋白激酶的激酶"
B1JC
I-/:.S
!
B1JCC
%
BCC
#+促分裂原活化蛋白激酶的
激酶之激酶"
B1JCI-/:.SI-/:.S
!
B1JCCC
#
%
个
组分组成,%-!由
B1JCCC)B1JCC)B1JC
依次
磷酸化传递信号,&)$-有研究表明!
B1JC
级联途
径与
1`
信号途径具有交互作用!在植物发育及防
御应答中起着重要的作用,()##-因此!本研究从巴
西橡胶树乳管细胞中克隆了
B1JC
级联途径组分
中的
BCC
家族成员
!"$%%&
的全长
@DE1
!并
分析了其在橡胶树不同组织中的表达特性及其在割
胶及茉莉酸甲酯和乙烯利处理下的表达特点!以期
了解其在橡胶生物合成中的功能!为进一步研究
B1JC
级联途径如何通过
1`
信号途径调控橡胶的
生物合成打下良好的基础
#
!
材料和方法
>+>
!
材料与处理
实验材料为种植于中国热带农业科学院实验场
的(热研
*)%%)6*
"
01H13*)%%)6*
#)橡胶树实生苗+
一年生萌条和割龄为
%
年的开割树(热研
*)%%)
6*
)实生苗用于分析基因表达的组织特异性!选生长
状态相近的根+树皮+胶乳+叶片!液氮冻存用于
2E1
提取割胶处理采用割龄为
%
年的开割树!选
树围一致!割线离地高度一致的(热研
*)%%)6*
)开割
树进行割胶处理+割线为
#
%
!
树围螺旋割线!第一刀
采集的胶乳作为对照!然后分别在第一刀割胶处理
后的
"+$>
+
!>
+
(>
+
#!>
+
#&>
+
#U
+
!U
和
%U
割第
二刀!采集的胶乳作为处理样品!每时间点采集
$
棵
树!
$
棵树的
@DE1
等量混合用于基因表达分析
乙烯利"
SA>S
G
>?/
!
8H
#及茉莉酸甲酯"
9SA>
V
;
,
:.)
9?/:AS
!
BS`1
#处理采用的是
#
年生萌条!选大小
及生理状态相近+叶篷稳定的(热研
*)%%)6*
)的萌条
为材料!用
"+"*a BS`1
涂抹第三伸长单位的节间
树皮!作为处理组!对照为用于溶解
"+"*a BS`1
的水剂&另外!用含
"+$a 8H
的溶液涂抹第三伸长
单位节间树皮!作为乙烯利处理组!对照为用于溶解
"+$a8H
的水剂分别于处理后的
#>
+
!>
+
&>
+
7
>
+
#U
+
!U
+
%U
和
$U
用刀片割开树皮!每时间点处
理
6
根萌条!将混合胶乳采集于
2E1
提取液中
>+?
!
方
!
法
>@?@>
!
总
6A9
提取与
(BA9
合成
!
橡胶树的根+
树皮+叶片+胶乳
2E1
的提取均参照天根公司
2E1
G
TS
G
J=TS
多糖多酚植物总
2E1
提取试剂盒
的操作说明进行!柱上消化
2E1
样品中残留的微
量
DE1

@DE1
第一链合成参照
S^T9S/A.
公司反
转录试剂盒"
2SZSTA1-U -^T.A3AT:/U@DE13
V
/A>S)
.-.C-A
#的说明书进行
>@?@?
!
12344$
基因的
69,/
扩增和全长
(BA9
扩增
!
从巴西橡胶树胶乳转录组数据库中得到一段
BCC
的
L/-
Q
S/S
序列!根据该序列设计
2108
引
物!采 用
0;?/AS@>
公 司 的 试 剂 盒
3B12HST
HB
2108@DE119
G
;-W-@:A-?/C-A
进行序列的
2108
扩增其中
$c)2108
引物为
$)43J#
"
$c)H114H)
H004HHH00H44H0HH4HHH0)%c
#和
$)43J!
"
$c)
1H410H0041H4041H1141HHH41)%c
#&
%c)
2108
引物为
%)43J#
"
$c)0HH44444H41401H)
1HH4414HH0H)%c
#和
%)43J!
"
$c)1H011441)
1H14H4414400111414)%c
#以
2108
测
序片段与
L/-
Q
S/S
序列拼接的序列设计全长
@DE1
的扩 增 引 物
X^)0DE1)^
"
$c)040HHHH0H0H)
0100H401114)%c
#和
X^)0DE1)2
"
$c)H4HH)
4111001441401H4110)%c
#全长
@DE1
扩
增体系$
H:I:T:JT-9S3H12 B:OJTS9-O
"
!d
#
!$
#
X
!
X^)0DE1)^
"
#"
#
9?;
.
X
#
#
!+$
#
X
!
X^)0D)
E1)2
"
#"
#
9?;
.
X
#
#
!+$
#
X
!
@DE1
模板
#
#
X
!灭
菌水补足
$"
#
X
扩增程序为$
6$e
预变性
%9-/
&
6&e
变性
%".
!
("e
退火
%".
!
*!e
延伸
!9-/
!共
%"
个循环&
*!e
延伸
#"9-/

"+7a
琼脂糖凝胶电
#&&
%
期
!!!!!!!!!!!!
吴绍华!等$巴西橡胶树
!"$%%&
基因的克隆及表达分析
泳分离
J02
扩增产物!天根胶回收试剂盒纯化目的
条带!克隆到全式金公司的
G
813P)Y;=/A3-9
G
;S
0;?/-/
Q
fS@A?T
载体上!送
R/Z-AT?
Q
S/
公司测序
>+?+C
!
生物信息学分析
!
利用
E0YR
网站
]2^
-^/UST
软 件 "
>AA
G
$%%
<<<+/@F-+/;9+/->+
Q
?Z
%
Q
?TW
%
Q
?TW+>A9;
#进行开放阅读框"
]2^
#预测!同时
翻译成蛋白序列
DE1B1E
软件对基因的编码氨
基酸进行比对分析用
JT?AJ:T:9
软件"
>AA
G
$%%
:=+SO
G
:.
V
+?T
Q
%
A??;.
%
G
T?A
G
:T:9+>A9;
%#在线分析
该蛋白的分子量与等电点
3]JB1
在线软件预测
蛋白的二级结构
ESAJ>?.!+"3STZST
在线预测氨
基酸的磷酸化位点从
E0YR
数据库下载不同植物
的
BCC
蛋白序列!利用软件
B841&+"
采用
ES-
Q
>F?T)`?-/-/
Q
"
E`
#模型!并进行
#"""
次
Y??A)
.AT:
G
统计学检验构建包括
NFBCC&
蛋白序列在
内的植物
BCC
蛋白系统进化树
>@?@$
!
实时荧光定量
5,6
分析
!
采用
Y-?)2:U
公
司的
0^ g
实时荧光定量
J02
系统进行基因的相对
定量表达分析取
#
#
Q
2E1
!逆转录合成
@DE1
第一链!稀释
#"
倍后作为实时定量
J02
分析的模
板
!"$%%&
荧光定量引物为
BCC&)^
"
$c)H4H)
H40H4HH4HH1HH4HH44H4)%c
#和
BCC&)2
"
$c)100001HH00001HHH0HHH0H)%c
#内参
基因引物为
1@A-/)^
"
$c)41HH004HH4000141)
14H0)%c
#和
1@A-/)2
"
$c)010010H01401011)
H4HH100)%c
#
!"
#
X
荧光定量反应体系中!包含
#
#
X@DE1
模板!
#"
#
XH:I:T:!d3PY2JTS9-O
8O.(
/
$
"
H;-2E:.SNJ;=.
#和每条引物
#"
#
9?;
.
X
#各
"+(
#
X
"引物终浓度为
"+%
#
9?;
.
X
#
#
J02
反应程序为$
6$e
预变性
%".
&
6$e
变性
#"
.
!
("e
退火
!".
!
*!e
延伸
!".
!共
&"
个循环利
用
0^ g9:/:
Q
ST%+"
软件自动进行基线和
0
_
值分
析以
!"123+-
作为内参基因!采用
!

##
0
_算法分
析相对表达量
采用
3
测验对处理与对照样品的相对定量结果
进行统计分析
!
!
结果与分析
?@>
!
12344$
基因全长
(BA9
的克隆及生物信息
学分析
本研究通过
$c)2108
扩增!获得了
%"$F
G
非
编码区序列"
=/AT:/.;:ASUTS
Q
-?/
!
LH2
#!通过
%c)
2108
获得长
%%(F
G
序列"图
#
#!将两端序列与
L/-
Q
S/S
序列进行拼接!并设计全长
@DE1
引物!对
拼接序列进行
2H)J02
和测序验证结果显示
!"$%%&
基因"
4S/Y:/I
登录号
CJ!(!$"#
#全长
@DE1
序列
#$7"F
G
!其中
$c)LH2
长
%"$F
G
!
%c)
LH2
长
!#(F
G
!
]2^
编码框
#"$6F
G
!编码
%$!
个
氨基酸"图
!
#
保守结构域分析表明!该基因编码的蛋白含有
3
*
HC@
结构域"
3ST-/S
%
H>TS./-/S
G
T?AS-/I-/:.S.
!
@:A:;
V
A-@U?9-/S
#!具有激酶活性位点+
1HJ
结合位
点和底物结合位点!属于
JC0
超家族在线软件磷
图
#
!
!"$%%&
基因
2108
及全长
@DE1
"
X^)@DE1
#电泳结果
-^
Q
+#
!
H>S:
Q
:T?.S
Q
S;S;S@AT?
G
>?TS.-.?W!"$%%&
2108:/UW=;);S/
Q
A>@DE1
"
X^)@DE1
#
图
!
!
橡胶树
!"$%%&
基因序列和推导氨基酸序列
-^
Q
+!
!
E=@;S?A-US:/UUSU=@SU:9-/?:@-U
.S
_
=S/@S.?W!"$%%&
!&&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
%
!
!"$%%&
推导的氨基酸序列与其他植物
BCC
蛋白序列比对
图中从上至下依次代表麻疯树+毛果杨+蓖麻+荷兰芹+葡萄+拟南芥中相应的
BCC
氨基酸序列&
下划线表示
3
*
HC@
结构域&
"
显示磷酸化位点
-^
Q
+%
!
H>SUSU=@SU:9-/?:@-U.S
_
=S/@S.?W!"$%%&@?9
G
:TSU<-A>?A>ST
G
;:/ABCC.
H>S:9-/?:@-U.S
_
=S/@S-/A>S9:
G
.<>-@>WT?9A>SA?
G
A?A>SF?AA?9TS
G
TS.S/A
$
4(3)5
6
7(28)2(*
!
95
6
8,8*3)+2752()
6
(
!
:+2+-8*25;;8-+*
!
9&3)5*&,+-8;2)+*
6
8;
!
<+3+*+-+
=
&)(
!
1)("+>5
6
*+*37(,+(-(+H>S3
*
HC@U?9:-/-.=/UST;-/SU+
J>?.
G
>?T
V
;:A-?/.-AS.
G
TSU-@ASUF
V
ESAJ>?.!+"3STZST:TS-/U-@:ASUF
V
:.AST-.I.
酸化位点预测结果显示!该蛋白共有
#&
个磷酸化位
点!其中
6
个丝氨酸"
3ST)3
#位点!
&
个苏氨酸"
H>T)
H
#位点!
#
个酪氨酸"
H
V
T)P
#位点"图
%
#
JT?A)
J:T:9
软件预测结果显示!该基因编码蛋白分子式
为
0
#*""
N
!*#7
E
$"7
]
$"6
3
#%
!分子量为
%7+7%ID
!理论
等电点为
6+%(
!不稳定系数为
$"+6&
!属于不稳定类
蛋白在线软件预测结果显示!该氨基酸序列由
%"+##a
%
)
螺旋+
#%+(&a
延伸链+
&+!(a
&
)
转角和
$#+66a
无规则卷曲组成另外!该蛋白无导肽+无
跨膜结构域+属于亲水性蛋白
?@?
!
12344$
推导的氨基酸序列比对及进化树
构建
根据橡胶树
!"$%%&
推导氨基酸序列!与
E0YR
数据库中部分
BCC
蛋白氨基酸序列进行比
对结果显示!该基因编码氨基酸序列与其他物种
BCC
氨基酸序列具有较高相似性!其中与麻疯树
"
4(3)5
6
7(28)2(*
#假定蛋白
0`4M
*
#67!7
"
CDJ)
!**"$+#
#+毛果杨"
95
6
8,8*3)+2752()
6
(
#
JABCC&
"
gJ
*
""(%*6&"$+#
#和蓖麻"
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和
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#聚为一类!亲缘关系最近"图
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12344$
基因表达分析
采用实时荧光定量
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技术!以
!"123+-
基
因为内参!检测了
!"$%%&
基因表达的组织特异
%&&
%
期
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吴绍华!等$巴西橡胶树
!"$%%&
基因的克隆及表达分析
图
&
!
NFBCC&
与其它物种
BCC
蛋白的进化分析
图中分支点的数字表示
Y??A.AT:
G
验证中基于
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次重复该节点可信度的百分比&
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(
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基因表达的影响
"
和
""
分别表示每个时间点处理与对照之间在
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和
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水平存在显著性差异
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"
8H
#处理下胶乳中的表达模式"图
(
#结果显示!
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在橡胶树的根+树皮+胶乳及叶片中均有
表达!其中在根中的表达最高!树皮及胶乳中的表达
相近!淡绿期及成熟期叶片相对古铜期及变色期表
达有所上升"图
$
#
割胶显著上调胶乳中
!"$%%&
基因的表达!
基因相对表达量在割胶后
!>
达到最高!是对照的
!
倍多!达极显著水平!在割胶处理
(>
"
%U
!基因相
对表达量逐渐下调至对照水平茉莉酸甲酯显著上
调
!"$%%&
基因的表达!
BS`1
处理
#>
后!基因
相对表达量显著上调!在
7>
后达到最高!表达量是
对照
#+$
倍多!
#U
后!表达量逐渐下调至对照水平
另外!
8H
处理也能上调
!"$%%&
基因的表达!但
是上调的幅度比割胶+
BS`1
处理要小
8H
处理
&
>
后!基因相对表达量达到最高!仅是对照的
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
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卷
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8H
处理
!U
后!基因表达显著下调!相对
表达量是对照的
"+*
倍"图
(
#
%
!
讨
!
论
植物
B1JC
级联途径在植物的逆境胁迫及发
育中起着重要的调控作用研究发现!植物的
BCC&
主要参与植物的防卫反应及渗透胁迫如
拟 南 芥 中
B8CC#)BCC&
%
BCC$)BJC%
%
BJC(
级联途径通过磷酸化激活转录因子
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+
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和
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#的活性!参与拟南芥对细菌和真菌病原物的先天
免疫,#!-最近证实
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通过负调控
BCC&
%
BCC$)BJC%
%
BJC(
级联途径参与植物的先天免
疫,#%-另外!拟南芥
BCC&
通过调控
BJC%
活性
参与渗透胁迫响应,#&-
橡胶树树干树皮中的乳管是橡胶树合成和储存
天然橡胶的场所!也是橡胶树的一种防卫结构!其内
含物胶乳是一种重要的防御应答诱导的次生代谢产
物,#-!含有大量的防卫相关蛋白,#$)#*-
1`
是调节植
物次生代谢的关键信号分子!植物防卫反应可以诱
导体内
1`
的积累!
1`
通过调控次生代谢生物合成
相关基因的表达!促进次生代谢产物的合成,#7)!"-
郝秉中等,#-发现外施
1`
及其前体亚麻酸能够诱导
橡胶树的次生乳管分化!同时发现机械损伤可以诱
导乳管分化!其效应可被外施
1`
生物合成的抑制
剂阻断!表明机械伤害引起内源
1`
的合成和积累!
进而诱导乳管分化,!#-外施
1`
也可显著上调橡胶
生物合成关键酶的基因表达!并能提高胶乳的干胶
含量,!-因此!推测天然橡胶的生物合成可能受
1`
信号途径的调节
蛋白激酶或蛋白磷酸化抑制剂的药理学研究证
实蛋白的磷酸化及去磷酸化在
1`
信号途径中起着
重要的作用,!!-而且!
B1JC
级联途径与
1`
信号
途径具有交互作用!在植物发育及防御应答中起着
重要 的 作 用,()##-
H:I:>:.>-
等,7-揭 示
BCC%)
BJC(
组分在拟南芥茉莉酸信号中起着关键的作
用研究发现!受
1`
诱导的
BJC(
活性在突变体
;??%)#
植株中被抑制!而在
%$@#$%%%
植株中被
增强!表明受
1`
诱导的
BJC(
活性依赖于
BCC%

同时!
B1JC
级联途径也参与乙烯的应答拟南芥
中
$%%&
%
$)BJC%
%
(
通过调控乙烯合成限速酶
103!
%
(
参与乙烯的合成,!%)!&-
P??
等,!$-研究证实
BCC6)BJC%
%
(
也参与乙烯的应答反应
本研究从乳管细胞中克隆了
!"$%%&
基因的
全长
@DE1
!并分析了其在割胶+
BS`1
+
8H
处理下
的基因表达模式!发现
!"$%%&
基因的表达受割
胶+
BS`1
+
8H
诱导目前!割胶是天然橡胶生产的
重要环节之一!而且能够促进乳管分化,!(-!也促进
天然橡胶生物合成,!*-乙烯利是一种人工合成的
乙烯释放剂!被广泛应用于橡胶树的刺激采胶!大幅
度提高了天然橡胶的产量研究证实!乙烯利刺激
增产主要是通过延长乳管的排胶时间和提高乳管细
胞的基础代谢来实现的,!7)!6-因此!
!"$%%&
基
因可能通过茉莉酸信号途径在橡胶树乳管防卫及橡
胶的生物合成中起着重要的作用!但是具体作用机
制还有待于进一步的鉴定
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巴西橡胶树乳管细胞茉莉酸信号途径对橡胶生物合成调节的研究,
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