全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#""")*"!$
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%
,
+-../+#""")*"!$+!"#$+##+!#$&
收稿日期$
!"#$)"$)!$
&修改稿收到日期$
!"#$)"0)"&
基金项目$国家天然橡胶产业技术体系"
1234)%*)56#
#&国家自然科学基金"
%#%""$"*
#
作者简介$吴绍华"
#07%
#!男!博士!助理研究员!主要从事橡胶树分子生物学研究
8)9:-;
$
<=.>:?>=:&"%
!
#(%+@?9
"
通信作者$田维敏!博士!教授!主要从事植物发育生物学研究
8)9:-;
$
<9A-:/
!
#(%+@?9
橡胶树
$%&&
蛋白编码基因
123!4
的克隆与表达分析
吴绍华!张世鑫!陈月异!田维敏"
"中国热带农业科学院橡胶研究所!农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室!省部共建国家重点实验室培育基地
)
海南
省热带作物栽培生理学重点实验室!海南儋州
$&#&%&
#
摘
!
要$该研究采用
3B)C13
与
3218
技术!从橡胶树(热研
&)%%)0&
)胶乳中克隆了
#
个
D8EE2
蛋白编码基因
!"#$%
"
5F/G:/H
登录号为
IB(0(*%0
#
!"#$%
全长
@DJ2
序列
!"$"K
L
!包含
#
个长
#7*!K
L
的完整开放阅读
框序列分析显示!
!"#$%
基因编码
(#%
个氨基酸!其推导的蛋白含有
D8EE2
和
5324
结构域!分子量为
((+*&(
HD
!理论等电点为
$+#0
!无跨膜结构域!属于亲水性蛋白进化树分析表明!
MK52N
蛋白与其他植物中
D8EE2
蛋
白具有较高的相似性!与麻疯树
O@52N
和蓖麻
3@52N
亲缘关系较近荧光定量
C13
结果显示!割胶和茉莉酸甲酯
处理下调胶乳中
!"#$%
基因的表达!乙烯利处理
*>
内显著上调胶乳中
!"#$%
基因的表达!表明
!"#$%
基因可
能在橡胶树割胶*茉莉酸*乙烯响应中发挥作用
关键词$巴西橡胶树&
!"#$%
&基因克隆&基因表达分析
中图分类号$
P&7$
&
P&7(
文献标志码$
2
()"*#*
+
,*!%-
.
/011#"**,)
2
1#1"3123!440*0#*
56770/8/00
"
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12B24&)%%)0&
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K
U
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Y
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L
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"
3218
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Y
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U
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L
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L
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U
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Y
F/FA-@:/:;
U
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MK52N<:.@;?.F;
U
VF;:AFW<-A>O@52N:/W3@52N+3F:;)A-9FC13:/:;
U
.-..>?
Y
F/FFS)
L
VF..-?/-/;:AFS<:.W?Y
=;:AFW.-
Y
/-X-@:/A;
U
K
U
@?/.F@=A-[FA:
LL
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Y
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U
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ZFO2
#
AVF:A9F/A+M?
FA>F
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#
AVF:A9F/AF/>:/@FWA>FFS
L
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Y
/-X-@:/A;
U
+B>FVF.=;A..=
YY
F.AFWA>:A!"#$%9-
Y
>A
L
;:
U
HF
U
V?;F.-/VF.
L
?/.F.?XA:
LL
-/
Y
!
,
:.)
9?/-@:@-W:/WFA>
U
;F/F-/V=KKFVAVFF+
=0
2
>"/!1
$
!&&(")(*+,+&-*+*Z=F;+2V
Y
+
&
!"#$%
&
Y
F/F@;?/F
&
Y
F/FFS
L
VF..-?/:/:;
U
.-.
!!
天然橡胶由于其良好的弹性*绝缘性*耐磨性*
气密性*可塑性等综合性能!是一种重要的工业原料
和战略物资虽然天然橡胶能在
!"""
多种植物中
合成!但是巴西橡胶树"
!&&(")(*+,+&-*+* Z=F;+
2V
Y
+
#因其经济寿命长!胶乳产量高*品质好*易采
收等优点成为天然橡胶的主要来源橡胶树是一种
典型的异花杂交树种!杂交
_
#
代就会性状分离!常
规的产量育种效率低*周期长解决这一问题的有
效途径之一是发展基于分子标记的早期筛选技术及
利用转基因技术改良橡胶树性状目前!对橡胶树
产排胶调控分子机理的研究还不够广泛和深入!限
制了分子标记辅助育种及转基因技术在橡胶树品种
改良上的应用
乙烯和茉莉酸"
O2
#信号途径在橡胶树产排胶
分子机制研究中占据主导位置乙烯利"
8B
!一种
乙烯释放剂#是天然橡胶生产上广泛应用且有效的
橡胶树采胶刺激剂
8B
刺激可促使胶乳产量增加
#+$
"
!+"
倍+#,
8B
刺激增产可能主要是通过增强
橡胶树的基础代谢和延长橡胶树的排胶时间来实现
的+!)*,
O2
是橡胶树次生乳管分化的诱导因子+$,
现有的研究在一定程度上证实天然橡胶的生物合成
可能受
O2
信号途径的调节+$)##,但到目前为止!对
8B
增产机制及
O2
调控天然橡胶生物合成的机理
了解的还较少赤霉素"
52
#是一种重要的植物激
素!在植物的生长发育和防卫响应中起着重要的作
用研究证实!
52
信号途径与
O2
*乙烯信号途径
存在交互作用因此!本研究从巴西橡胶树乳管细
胞中克隆了
D8EE2
蛋白编码基因
!"#$%
全长
@DJ2
!并分析了其在割胶*赤霉素*茉莉酸甲酯和
乙烯利处理下的表达模式!为进一步研究
52N
蛋白
在橡胶树胶乳中的作用奠定基础
#
!
材料和方法
?+?
!
材料与处理
供试材料橡胶树无性系(热研
&)%%)0&
"
12B24
&)%%)0&
#)由-国家农作物种质资源平台
)
国家橡胶树
种质资源子平台.提供选取树围一致的
7
年生未
开割树!按照半树周螺旋割线!
%W
割
#
次"
4
%
!W
%
%
#
的割制进行连续割胶处理!分别采集
$
棵树!前
%
刀
的胶乳用于
3J2
提取药剂处理材料为
#
年生萌
条在萌条稳定期!用
#""
#
9?;
%
E
赤霉素"
52
%
#*
"+"&`
茉莉酸甲酯"
ZFO2
#和
"+$`
乙烯利分别涂
抹第三伸长单位的节间树皮!
"+"&` ZFO2
处理的
对照为
(`
乙醇!
52
%
和
8B
的对照为灭菌水分
别于涂抹后的
!
**
7>
!及
#
*
!
和
%W
采集胶乳!每
个时间点处理
0
根萌条!将胶乳混合收集于
3J2
提取液中用于
3J2
提取
?:@
!
5A
提取及
<$A
合成
采用
3J2
L
VF
L
C=VF
多糖多酚植物总
3J2
提
取试剂盒"
BN2J58J
#提取橡胶树的胶乳
3J2
!试
剂盒附带的
DJ:.F
$
进行微量
DJ2
的消化提取
的
3J2
用
#`
琼脂糖凝胶电泳和
J:/?DV?
L
!"""
"
B>FV9?
!
Q42
#仪器进行完整性和纯度的检测
经检测的
3J2
采用
3F[FVA2-W_-V.A4AV:/W@DJ2
4
U
/A>F.-.I-A
"
B>FV9?
!
Q42
#进行
@DJ2
第一链的
合成
?:B
!
123!4
基因
5(%
扩增和全长
<$A
扩增
根据橡胶树胶乳转录组数据库"
>AA
L
$%%
<<<+/@)
K-+/;9+/->+
Y
?[
%
Y
F?
%
a
=FV
U
%
:@@+@
Y
-
/
:@@b548$007#+
#
的注释信息!获得
D8EE2
蛋白的
Q/-
Y
F/F
序列!根
据该序列设计
3218
引物"表
#
#!采用
4Z23B)
FV
BZ
3218@DJ2 29
L
;-X-@:A-?/ I-A
"
1;?/AF@>
!
Q42
#进行末端序列扩增以
3218
测序结果与
Q/-
Y
F/F
序列拼接的全长
@DJ2
序列设计引物"表
#
#!采用
!cCV-9F4B23Z:SCVF9-S
"
B:I:3:
#的
高保真聚合酶进行
3B)C13
的验证
C13
程序为$
0$d
预变性
%9-/
&
0*d
变性
%".
!
("d
退火
%".
!
&!d
延伸
%9-/
!共
%"
个循环&
!d
延伸
#"9-/
"+7`
琼脂糖凝胶电泳分离
C13
扩增产物!天根胶
回收试剂盒纯化目的条带!连接至
L
824T)G;=/A
表
?
!
本研究所用引物序列
B:K;F#
!
CV-9FV.F
a
=F/@F.=.FW-/A>-..A=W
U
引物名称
CV-9FV/:9F
引物序列
CV-9FV.F
a
=F/@F
"
$e
#
%e
#
$3218)52N)C 2BBB1152BBB5B5152B252552B
$3218)52N)JC 122521212B555B552BB2251B1
%3218)52N)C B1B2521155BB121B52251BBB5
%3218)52N)JC 2525512B52521BBB521B12BB55
_E)1DJ2)52N)_ 1BBB2B51B1BB1B1BB5BB11B11
_E)1DJ2)52N)3 212121BB52BB121B521BB51
PC13)52N)_ 551B5B111525B122521
PC13)52N)3 1121B152B21112B12115
PC13)2@A-/)_ 52BB115BB511125225B1
PC13)2@A-/)3 121121B12512122B5BB211
7$#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
4-9
L
;F1;?/-/
Y
fF@A?V
"
BV:/.5F/
#载体上!送
N/)
[-AV?
Y
F/
公司进行测序
?+C
!
生物信息学分析
利用
J1GN
网站
3^__-/WFV
软件"
>AA
L
$%%
<<<+/@K-+/;9+/->+
Y
?[
%
Y
?VX
%
Y
?VX+>A9;
#进行开
放阅读框预测及蛋白序列的推导
DJ2Z2J
软件
进行氨基酸序列的比对分析
CV?AC:V:9
软件"
>A)
A
L
$%%
:=+FS
L
:.
U
+?V
Y
%
A??;.
%
L
V?A
L
:V:9+>A9;
%#在线
分析蛋白的分子量与等电点
CV?A4@:;F
软件"
>A)
A
L
$%%
:.
U
+?V
Y
%
L
V?A.@:;F
%#分析蛋白亲水
性
BZMZZ 4FV[FV[+!+"
"
>AA
L
$%%
<<<+@K.+
WA=+WH
%
.FV[-@F.
%
BZMZZ
%#进行蛋白的跨膜结构
域分析
4^ CZ2
在线软件"
>AA
L
$%%
/>
,U
+>]:=+
FW=+@/
%
HF@>
%
.
,
:H
,
%
W-:/]-
%
G-?-/X&
%
8S
L
:.
U
%
8S
L
:.
U
7+>A9
#预测蛋白的二级结构从
J1GN
数
据库下载部分植物的
D8EE2
蛋白序列!利用软件
Z852*+"
采用
JF-
Y
>K?V)O?-/-/
Y
"
JO
#模型!进行
#"""
次
G??A.AV:
L
统计学检验构建
MK52N
蛋白的
系统进化树
?:D
!
实时荧光定量
E(5
分析
根据
!"#$%
基因的
%e
末端序列设计荧光定量
引物
PC13)52N)_
和
PC13)52N)3
"表
#
#!以不同
处理的胶乳
@DJ2
为模版!采用
1_g%7*
荧光定量
C13
系统"
G-?)3:W
!
Q42
#进行基因的相对定量表达
分析!内参基因为
!"$./+-
"
5F/G:/HMP!("(&*+#
#
#"
#
E
荧光定量反应体系中!包含
@DJ2
模板
#
#
E
!
B:I:3:!c4TG3CVF9-S8S0(
1
%
"
B;-3J:.FM
C;=.
#
$
#
E
和
#"
#
9?;
%
E
上*下游引物各
"+%
#
E
!
WWM
!
^%+*
#
E
C13
反应参数为$
0$d
预变性
%
9-/
&
0$d
变性
#".
!
("d
退火
!".
!
&!d
延伸
!"
.
!共
*"
个循环!
*"
个循环后进行溶解曲线分析
利用
1_g9:/:
Y
FV%+"
软件!以
!"$./+-
作为内参
基因!采用
!
&&
1
a算法分析相对表达量
?+F
!
统计分析
割胶处理荧光定量结果采用
?/F)<:
U
2J^ f2
比较各刀次样品之间基因表达量的差异显著性&
52
%
*
8B
和
ZFO2
处理采用
?/F)<:
U
2J^ f2
"
D=//FAA
)
.Z=;A-
L
;F1?9
L
:V-.?/BF.A
#比较处理与
对照样品的相对定量结果的差异显著性
!
!
结果与分析
@:?
!
123!4
基因全长
<$A
克隆与生物信息学分析
通过
3218
扩增!获得了长
#&$K
L
$e
末端序列
和
%0$K
L
%e
末端序列!通过拼接和测序!获得了
!"#$%
基因全长
@DJ2
序列
!"$"K
L
!包含
$e
非编
码区序列"
Q/AV:/.;:AFWVF
Y
-?/
!
QB3
#长
#*$K
L
!
%e)
QB3
长
(%K
L
!开放阅读框
#7*!K
L
!编码
(#%
个氨
基酸"图
#
#氨基酸序列分析显示!
MK52N
蛋白的
分子式为
1
!0#7
M
*$0#
J
7"%
^
0#*
4
!0
!分子量为
((+*&(
HD
!理论等电点为
$+#0
!无跨膜结构域!属于亲水性
图
#
!
橡胶树
!"#$%@DJ2
序列和推导氨基酸序列
_-
Y
+#
!
J=@;F?A-WF:/WWFW=@FW:9-/?:@-W.F
a
=F/@F.?X!"#$%
0$#!
##
期
!!!!!!!!!
吴绍华!等$橡胶树
D8EE2
蛋白编码基因
!"#$%
的克隆与表达分析
蛋白!由
*#+**`
)
螺旋*
#$+$"`
延伸链*
7+#(`
(
)
转角和
%*+0#`
无规则卷曲组成
@:@
!
123!4
推导氨基酸序列比对及进化树构建
MK52N
氨基酸序列与其他植物
52N
蛋白氨基
酸序列的比对结果显示!
MK52N
氨基酸序列与其他
物种
52N
氨基酸序列具有较高相似性!与麻疯树
"
2(/)3
4
5(.6).(*
!
gC
0
"#!"&&&0!+#
#*蓖麻"
7+.+-6*
.3886-+*
!
gC
0
""!$%*"%"+#
#*胡杨"
93
4
6,6*&6
4
5:
)(/+.(
!
gC
0
"##""!&7$+#
#*拟南芥 "
$)("+;3
4
*+*
/5(,+(-(
!
288!0!*!+#
#和 水 稻 "
<)
=
>(*(/+(
!
G220"&*0+#
#的相似性分别为
&7+**`
*
&&+!#`
*
&%+0!`
*
$(+*!`
和
$&+!%`
"图
!
#结构上具有
图
!
!
!"#$%
推导的氨基酸序列与其他植物
$
个
D8EE2
蛋白序列比对
图中从上至下依次排列的是橡胶树*麻疯树*蓖麻*胡杨*拟南芥*水稻中相应的
52N
氨基酸序列&划线部分为保守结构域
_-
Y
+!
!
2;-
Y
/9F/A?XWFW=@FW:9-/?:@-W.F
a
=F/@F?X!"#$%<-A>X-[FD8EE2
L
V?AF-/.?X?A>FV
L
;:/A.
B>F:9-/?:@-W.F
a
=F/@F.-/A>F9:
L
<>-@>XV?9A>FA?
L
A?A>FK?AA?9VF
L
VF.F/A:VF
$
!&&(")(*+,+&-*+*
!
2(/)3
4
5(.6).(*
!
7+.+-6*.3886-+*
!
93
4
6,6*&6
4
5)(/+.(
!
$)("+;3
4
*+*/5(,+(-(:/W<)
=
>(*(/+(+B>F@?/.FV[FWVF
Y
-?/.:VF9:VHFW<-A>;-/F.
"(#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
5324
家族的典型结构域$
J
末端具有
52
信号感
知区的
D8EE2
和
BfMTJC
酸性结构域!
1
末端
具有发挥阻遏作用的阻遏区域
3f83
和
426
!以
及中心区
fMfND
*核定位区域
JE4
!起调节作用的
ER
"亮氨酸重复序列#和
C?;
U
4
%
B
%
f
"丝氨酸%苏氨
酸%缬氨酸富集区#区域"图
!
#此外!通过
Z852
*+"
软件构建的系统进化树显示!橡胶树
MK52N
氨基酸序列与麻疯树
O@52N
和蓖麻
3@52N
归为一
类!亲缘关系较近"图
%
#
@:B
!
123!4
基因表达分析
采用
3F:;A-9FC13
技术分析了割胶及
52
%
*
8B
和
ZFO2
处理对胶乳中
!"#$%
基因表达的影
响"图
*
#结果显示!胶乳中
!"#$%
基因表达受割
胶显著下调!各刀次间的表达量差异达显著性水平
"图
*
!
2
#此外!与对照相比!
52
%
处理
*>
小幅上
调
!"#$%
基因表达!但未达到显著差异"图
*
!
G
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图
%
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MK52N
与其他物种
D8EE2
蛋白的进化分析
图中分支点的数字表示
G??A.AV:
L
验证中基于
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%
处理&
1+8B
处理&
D+ZFO2
处理不同小写字母代表各刀次割胶间的显著性差异"
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#&
"
和
""
分别表示每个时间点处理与对照之间在
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和
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处理
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*>
上调至
最高!
#
"
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8B
处理显著下调"图
*
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1
#&
ZFO2
处理
*>
显著下调
!"#$%
基因表达!其他时
间点的表达量与对照无显著性差异"图
*
!
D
#
%
!
讨
!
论
D8EE2
蛋白是
52
信号途径中一类重要的负
调节因子当
D8EE2
蛋白上的
52
信号感知区接
收到
52
信号后!这种蛋白在核内通过泛素蛋白体
通道迅速降解+#!)#*,!其阻遏作用从而被解除!植株表
现出正常的
52
反应目前!拟南芥中发现了
$
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D8EE2
蛋 白$
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和
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52N
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蛋白功能上高度冗余
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是茉莉酸信号途径中的
%
个
核心组件!
O2R
蛋白是
O2
信号中的抑制剂!
ZT1!
是
O2
信号的一个关键的转录激活因子研究发
现!拟南芥中
D8EE2.
可竞争性地阻止阻遏蛋白
O2R
与转录激活因子
ZT1!
的结合!即在缺乏
52
的条件下!稳定的
D8EE2
与
O2R
结合来释放
ZT1!
!促进
O2
信号途径相反!
52
存在时!
D8EE2
蛋白被降解!释放的
O2R
与
ZT1
结合!抑
制了依赖于
ZT1!
的
O2
信号的输出+#(,
此外!
6-;W
等+#&,发现
35E%
蛋白对于
O2
介导
的响应是必不可少的!并证实
ZT1!
能直接与
35E%
启动子结合而且!跟其他
D8EE2
蛋白一
样!
35E%
也能与
O2R
蛋白互作!表明
D8EE2
蛋白
功能的多样性
6-;W
等+#7,还证实
35E%
也能通过
竞争性结合
O2R
蛋白来增强
8NJ%
的活性!在
8B
介导的防卫反应中起重要的作用在玫瑰花瓣发育
研究中发现!
3>8NJ%)%
能直接结合
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基因
启动子+#0,乙烯显著增强
75#$%#
基因的表达!乙
烯处理
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!
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的表达量达到对照的
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倍&
处理
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!
75#$%#
的表达量上调至对照的
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倍
本研究中!
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基因对
8B
响应模式与
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具有相似性
8B
处理
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!
!"#$%
基因表达上调&
8B
处理
*>
!
!"#$%
基因表达上调至最高另外!
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处理
*>
显著下调
!"#$%
的表达
众多的研究表明!
52
*
O2
和
8B
这
%
种植物激
素介导的信号途径存在交互作用+!")!(,!
D8EE2
蛋
白在其中起着重要的作用而且!
D8EE2
蛋白除
了参与器官发育及防御反应外!也参与次生代谢产
物的合成如拟南芥
ZT1!
通过直接结合倍半萜
烯合成酶基因
09?!#
和
09?##
的启动子激活其
表达!而
D8EE2
蛋白
352
通过结合
ZT1!
抑制
倍半萜烯的生物合成+!&,结合
!"#$%
对割胶*
8B
*
ZFO2
的响应特点及植物中
52N
和
352
蛋白
功能上高度冗余性!推测
D8EE2
蛋白成员
MK52N
可能通过
O2
或
8B
信号途径在胶乳中发挥一定的
作用!但是具体作用机制还有待于进一步的证实
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