全 文 ：书西北植物学报!
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收稿日期$!"#$)"$)!$
&修改稿收到日期$!"#$)"0)"&
基金项目$国家天然橡胶产业技术体系" 1234)%*)56# #&国家自然科学基金" %#%""$"*
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作者简介$吴绍华" #07% #!男!博士!助理研究员!主要从事橡胶树分子生物学研究 8)9:-;$
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通信作者$田维敏!博士!教授!主要从事植物发育生物学研究 8)9:-;$
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#(%+@?9
橡胶树
$%&& 蛋白编码基因 123!4 的克隆与表达分析 吴绍华!张世鑫!陈月异!田维敏" "中国热带农业科学院橡胶研究所!农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室!省部共建国家重点实验室培育基地 ) 海南 省热带作物栽培生理学重点实验室!海南儋州$&#&%&
#
摘
!
要$该研究采用 3B)C13 与 3218 技术!从橡胶树(热研 &)%%)0& )胶乳中克隆了 # 个 D8EE2 蛋白编码基因 !"#$%
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登录号为
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!包含
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个长
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的完整开放阅读
框序列分析显示!
!"#$% 基因编码 (#% 个氨基酸!其推导的蛋白含有 D8EE2 和 5324 结构域!分子量为 ((+*&( HD !理论等电点为$+#0
!无跨膜结构域!属于亲水性蛋白进化树分析表明!
MK52N
蛋白与其他植物中
D8EE2
蛋
白具有较高的相似性!与麻疯树
O@52N
和蓖麻
3@52N
亲缘关系较近荧光定量
C13
结果显示!割胶和茉莉酸甲酯
处理下调胶乳中
!"#$% 基因的表达!乙烯利处理 *> 内显著上调胶乳中 !"#$%
基因的表达!表明
!"#$% 基因可 能在橡胶树割胶*茉莉酸*乙烯响应中发挥作用 关键词$巴西橡胶树&
!"#$% &基因克隆&基因表达分析 中图分类号$
P&7$& P&7( 文献标志码$
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天然橡胶由于其良好的弹性*绝缘性*耐磨性*
气密性*可塑性等综合性能!是一种重要的工业原料
和战略物资虽然天然橡胶能在
!"""
多种植物中
合成!但是巴西橡胶树"
!&&(")(*+,+&-*+* Z=F;+
2V
Y
+
#因其经济寿命长!胶乳产量高*品质好*易采
收等优点成为天然橡胶的主要来源橡胶树是一种
典型的异花杂交树种!杂交
_
#
代就会性状分离!常
规的产量育种效率低*周期长解决这一问题的有
效途径之一是发展基于分子标记的早期筛选技术及
利用转基因技术改良橡胶树性状目前!对橡胶树
产排胶调控分子机理的研究还不够广泛和深入!限
制了分子标记辅助育种及转基因技术在橡胶树品种
改良上的应用
乙烯和茉莉酸"
O2
#信号途径在橡胶树产排胶
分子机制研究中占据主导位置乙烯利"
8B
!一种
乙烯释放剂#是天然橡胶生产上广泛应用且有效的
橡胶树采胶刺激剂
8B
刺激可促使胶乳产量增加
#+$" !+" 倍+#, 8B 刺激增产可能主要是通过增强 橡胶树的基础代谢和延长橡胶树的排胶时间来实现 的+!)*, O2 是橡胶树次生乳管分化的诱导因子+$,
现有的研究在一定程度上证实天然橡胶的生物合成
可能受
O2
信号途径的调节+$)##,但到目前为止!对 8B 增产机制及 O2 调控天然橡胶生物合成的机理 了解的还较少赤霉素" 52 #是一种重要的植物激 素!在植物的生长发育和防卫响应中起着重要的作 用研究证实! 52 信号途径与 O2 *乙烯信号途径 存在交互作用因此!本研究从巴西橡胶树乳管细 胞中克隆了 D8EE2 蛋白编码基因 !"#$%
全长
@DJ2
!并分析了其在割胶*赤霉素*茉莉酸甲酯和
乙烯利处理下的表达模式!为进一步研究
52N
蛋白
在橡胶树胶乳中的作用奠定基础
#
!
材料和方法
?+?
!
材料与处理
供试材料橡胶树无性系(热研
&)%%)0&
"
12B24
&)%%)0&
#)由-国家农作物种质资源平台
)
国家橡胶树
种质资源子平台.提供选取树围一致的
7
年生未
开割树!按照半树周螺旋割线!
%W
割
#
次"
4
%
!W
%
%
#
的割制进行连续割胶处理!分别采集
$棵树!前 % 刀 的胶乳用于 3J2 提取药剂处理材料为 # 年生萌 条在萌条稳定期!用 #"" # 9?; % E 赤霉素" 52 % #* "+"&` 茉莉酸甲酯" ZFO2 #和 "+$`
乙烯利分别涂
抹第三伸长单位的节间树皮!
"+"&` ZFO2
处理的
对照为
(`
乙醇!
52
%
和
8B
的对照为灭菌水分
别于涂抹后的
!
**
7>
!及
#
*
!
和
%W
采集胶乳!每
个时间点处理
0
根萌条!将胶乳混合收集于
3J2
提取液中用于
3J2
提取
?:@
!
5A
提取及
<$A 合成 采用 3J2 L VF L C=VF 多糖多酚植物总 3J2 提 取试剂盒" BN2J58J #提取橡胶树的胶乳 3J2 !试 剂盒附带的 DJ:.F$
进行微量
DJ2
的消化提取
的
3J2
用
#`
琼脂糖凝胶电泳和
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L
!"""
"
B>FV9?
!
Q42
#仪器进行完整性和纯度的检测
经检测的
3J2
采用
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4
U
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"
B>FV9?
!
Q42
#进行
@DJ2
第一链的
合成
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!
123!4
基因
5(%
扩增和全长
<$A 扩增 根据橡胶树胶乳转录组数据库" >AA L$%%
<<<+/@)
K-+/;9+/->+
Y
?[
%
Y
F?
%
a
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U
%
:@@+@
Y
-
/
:@@b548$007#+ # 的注释信息!获得 D8EE2 蛋白的 Q/- Y F/F 序列!根 据该序列设计 3218 引物"表 # #!采用 4Z23B) FV BZ 3218@DJ2 29 L ;-X-@:A-?/ I-A " 1;?/AF@> ! Q42 #进行末端序列扩增以 3218 测序结果与 Q/- Y F/F 序列拼接的全长 @DJ2 序列设计引物"表 # #!采用 !cCV-9F4B23Z:SCVF9-S " B:I:3: #的 高保真聚合酶进行 3B)C13 的验证 C13 程序为$
0$d 预变性 %9-/ & 0*d 变性 %". ! ("d 退火 %". ! &!d 延伸 %9-/ !共 %" 个循环& !d 延伸 #"9-/ "+7` 琼脂糖凝胶电泳分离 C13 扩增产物!天根胶 回收试剂盒纯化目的条带!连接至 L 824T)G;=/A 表 ? ! 本研究所用引物序列 B:K;F# ! CV-9FV.F a =F/@F.=.FW-/A>-..A=W U 引物名称 CV-9FV/:9F 引物序列 CV-9FV.F a =F/@F "$e
#
%e
#
$3218)52N)C 2BBB1152BBB5B5152B252552B$3218)52N)JC 122521212B555B552BB2251B1
%3218)52N)C B1B2521155BB121B52251BBB5
%3218)52N)JC 2525512B52521BBB521B12BB55
_E)1DJ2)52N)_ 1BBB2B51B1BB1B1BB5BB11B11
_E)1DJ2)52N)3 212121BB52BB121B521BB51
PC13)52N)_ 551B5B111525B122521
PC13)52N)3 1121B152B21112B12115
PC13)2@A-/)_ 52BB115BB511125225B1
PC13)2@A-/)3 121121B12512122B5BB211
7$#! 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷
4-9
L
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Y
fF@A?V
"
BV:/.5F/
#载体上!送
N/)
[-AV?
Y
F/
公司进行测序
?+C
!
生物信息学分析
利用
J1GN
网站
3^__-/WFV
软件"
>AA
L
$%% <<<+/@K-+/;9+/->+ Y ?[ % Y ?VX % Y ?VX+>A9; #进行开 放阅读框预测及蛋白序列的推导 DJ2Z2J 软件 进行氨基酸序列的比对分析 CV?AC:V:9 软件" >A) A L$%%
:=+FS
L
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U
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Y
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A??;.
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V?A
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分析蛋白的分子量与等电点
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软件"
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%
L
V?A.@:;F
%#分析蛋白亲水
性
BZMZZ 4FV[FV[+!+"
"
>AA
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$%% <<<+@K.+ WA=+WH % .FV[-@F. % BZMZZ %#进行蛋白的跨膜结构 域分析 4^ CZ2 在线软件" >AA L$%%
/>
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FW=+@/
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W-:/]-
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G-?-/X&
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8S
L
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%
8S
L
:.
U
7+>A9
#预测蛋白的二级结构从
J1GN
数
据库下载部分植物的
D8EE2
蛋白序列!利用软件
Z852*+"
采用
JF-
Y
>K?V)O?-/-/
Y
"
JO
#模型!进行
#"""
次
G??A.AV:
L
统计学检验构建
MK52N
蛋白的
系统进化树
?:D
!
实时荧光定量
E(5
分析
根据
!"#$% 基因的 %e 末端序列设计荧光定量 引物 PC13)52N)_ 和 PC13)52N)3 "表 # #!以不同 处理的胶乳 @DJ2 为模版!采用 1_g%7* 荧光定量 C13 系统" G-?)3:W ! Q42 #进行基因的相对定量表达 分析!内参基因为 !"$./+-
"
5F/G:/HMP!("(&*+#
#
#"
#
E
荧光定量反应体系中!包含
@DJ2
模板
#
#
E
!
B:I:3:!c4TG3CVF9-S8S0(
1
%
"
B;-3J:.FM
C;=.
#
$# E 和 #" # 9?; % E 上*下游引物各 "+% # E ! WWM ! ^%+* # E C13 反应参数为$
0$d 预变性 % 9-/ & 0$d
变性
#".
!
("d
退火
!".
!
&!d
延伸
!"
.
!共
*"
个循环!
*"
个循环后进行溶解曲线分析
利用
1_g9:/:
Y
FV%+"
软件!以
!"$./+- 作为内参 基因!采用 ! && 1 a算法分析相对表达量 ?+F ! 统计分析 割胶处理荧光定量结果采用 ?/F)<: U 2J^ f2 比较各刀次样品之间基因表达量的差异显著性& 52 % * 8B 和 ZFO2 处理采用 ?/F)<: U 2J^ f2 " D=//FAA ) .Z=;A- L ;F1?9 L :V-.?/BF.A #比较处理与 对照样品的相对定量结果的差异显著性 ! ! 结果与分析 @:? ! 123!4 基因全长 <$A
克隆与生物信息学分析
通过
3218
扩增!获得了长
#&$K L$e
末端序列
和
%0$K L %e 末端序列!通过拼接和测序!获得了 !"#$%
基因全长
@DJ2
序列
!"$"K L !包含$e
非编
码区序列"
Q/AV:/.;:AFWVF
Y
-?/
!
QB3
#长
#*$K L ! %e) QB3 长 (%K L !开放阅读框 #7*!K L !编码 (#% 个氨 基酸"图 # #氨基酸序列分析显示! MK52N 蛋白的 分子式为 1 !0#7 M *$0#
J
7"%
^
0#*
4
!0
!分子量为
((+*&(
HD
!理论等电点为
$+#0 !无跨膜结构域!属于亲水性 图 # ! 橡胶树 !"#$%@DJ2
序列和推导氨基酸序列
_-
Y
+#
!
J=@;F?A-WF:/WWFW=@FW:9-/?:@-W.F
a
=F/@F.?X!"#$% 0$#!
##
期
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吴绍华!等$橡胶树 D8EE2 蛋白编码基因 !"#$%
的克隆与表达分析
蛋白!由
*#+**`

)
螺旋*
#$+$"`
延伸链*
7+#(`
(
)
转角和
%*+0#`
无规则卷曲组成
@:@
!
123!4
推导氨基酸序列比对及进化树构建
MK52N
氨基酸序列与其他植物
52N
蛋白氨基
酸序列的比对结果显示!
MK52N
氨基酸序列与其他
物种
52N
氨基酸序列具有较高相似性!与麻疯树
"
2(/)3
4
5(.6).(*
!
gC
0
"#!"&&&0!+#
#*蓖麻"
7+.+-6*
.3886-+*
!
gC
0
""!$%*"%"+# #*胡杨" 93 4 6,6*&6 4 5: )(/+.( ! gC 0 "##""!&7$+#
#*拟南芥 "
$)("+;3 4 *+* /5(,+(-( ! 288!0!*!+# #和 水 稻 " <) = >(*(/+( ! G220"&*0+# #的相似性分别为 &7+**` * &&+!#` * &%+0!` *$(+*!`
和
$&+!%` "图 ! #结构上具有 图 ! ! !"#$%
推导的氨基酸序列与其他植物
$个 D8EE2 蛋白序列比对 图中从上至下依次排列的是橡胶树*麻疯树*蓖麻*胡杨*拟南芥*水稻中相应的 52N 氨基酸序列&划线部分为保守结构域 _- Y +! ! 2;- Y /9F/A?XWFW=@FW:9-/?:@-W.F a =F/@F?X!"#$%<-A>X-[FD8EE2
L
V?AF-/.?X?A>FV
L
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B>F:9-/?:@-W.F
a
=F/@F.-/A>F9:
L
<>-@>XV?9A>FA?
L
A?A>FK?AA?9VF
L
VF.F/A:VF
$!&&(")(*+,+&-*+* ! 2(/)3 4 5(.6).(* ! 7+.+-6*.3886-+* ! 93 4 6,6*&6 4 5)(/+.( !$)("+;3
4
*+*/5(,+(-(:/W<)
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Y
-?/.:VF9:VHFW<-A>;-/F.
"(#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 5324 家族的典型结构域$
J
末端具有
52
信号感
知区的
D8EE2
和
BfMTJC
酸性结构域!
1
末端
具有发挥阻遏作用的阻遏区域
3f83
和
426
!以
及中心区
fMfND
*核定位区域
JE4
!起调节作用的
ER
"亮氨酸重复序列#和
C?;
U
4
%
B
%
f
"丝氨酸%苏氨
酸%缬氨酸富集区#区域"图
!
#此外!通过
Z852
*+"
软件构建的系统进化树显示!橡胶树
MK52N
氨基酸序列与麻疯树
O@52N
和蓖麻
3@52N
归为一
类!亲缘关系较近"图
%
#
@:B
!
123!4
基因表达分析
采用
3F:;A-9FC13
技术分析了割胶及
52
%
*
8B
和
ZFO2
处理对胶乳中
!"#$% 基因表达的影 响"图 * #结果显示!胶乳中 !"#$%
基因表达受割
胶显著下调!各刀次间的表达量差异达显著性水平
"图
*
!
2
#此外!与对照相比!
52
%
处理
*>
小幅上
调
!"#$%
基因表达!但未达到显著差异"图
*
!
G
#&
图
%
!
MK52N
与其他物种
D8EE2
蛋白的进化分析
图中分支点的数字表示
G??A.AV:
L
验证中基于
#"""
次重复该节点可信度的百分比&标尺表示氨基酸替换率&括号内为氨基酸登录号
_-
Y
+%
!
C>
U
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Y
F/FA-@VF;:A-?/.>-
L
.KFAFV
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;:/AD8EE2.
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L
FV.-AF
&
B>F5F/K:/H:@@F..-?/J?+Y
-[F/-/KV:@HFA.
图
*
!
不同处理对胶乳
!"#$% 基因表达的影响 2+ 割胶& G+52 % 处理& 1+8B 处理& D+ZFO2 处理不同小写字母代表各刀次割胶间的显著性差异" 9$
"+"$#& " 和 "" 分别表示每个时间点处理与对照之间在 "+"$
和
"+"#
水平存在显著性差异
_-
Y
+*
!a
3B)C13:/:;
U
.-.?X!"#$%-/W-XXFVF/AAVF:AFWV=KKFVAVFF. 2+B: LL -/ Y & G+52 % & 1+8B & D+ZFO2+J?V9:;;FAAFV.9F:/.- Y /-X-@:/AW-XXFVF/@F:9?/ Y A>FX-V.AA: LL -/ Y " # #! .F@?/WA: LL -/ Y " ! # :/WA>-VWA: LL -/ Y " % #! 9$
"+"$
&
2.AFV-.H.-/W-@:AF:.-
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2J^ f2
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""
9
$"+"# #(#! ## 期 !!!!!!!!! 吴绍华!等$橡胶树
D8EE2
蛋白编码基因
!"#$% 的克隆与表达分析 8B 处理 !>!"#$%
基因表达显著上调!
*>
上调至
最高!
#
"
%W
后表达受
8B
处理显著下调"图
*
!
1
#&
ZFO2
处理
*>
显著下调
!"#$% 基因表达!其他时 间点的表达量与对照无显著性差异"图 * ! D # % ! 讨 ! 论 D8EE2 蛋白是 52 信号途径中一类重要的负 调节因子当 D8EE2 蛋白上的 52 信号感知区接 收到 52 信号后!这种蛋白在核内通过泛素蛋白体 通道迅速降解+#!)#*,!其阻遏作用从而被解除!植株表 现出正常的 52 反应目前!拟南芥中发现了$
个
D8EE2
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,
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52N
和
352
蛋白功能上高度冗余
1^ N#)O2R)ZT1!
是茉莉酸信号途径中的
%
个
核心组件!
O2R
蛋白是
O2
信号中的抑制剂!
ZT1!
是
O2
信号的一个关键的转录激活因子研究发
现!拟南芥中
D8EE2.
可竞争性地阻止阻遏蛋白
O2R
与转录激活因子
ZT1!
的结合!即在缺乏
52
的条件下!稳定的
D8EE2
与
O2R
结合来释放
ZT1!
!促进
O2
信号途径相反!
52
存在时!
D8EE2
蛋白被降解!释放的
O2R
与
ZT1
结合!抑
制了依赖于
ZT1!
的
O2
信号的输出+#(,
此外!
6-;W
等+#&,发现
35E%
蛋白对于
O2
介导
的响应是必不可少的!并证实
ZT1!
能直接与
35E%
启动子结合而且!跟其他
D8EE2
蛋白一
样!
35E%
也能与
O2R
蛋白互作!表明
D8EE2
蛋白
功能的多样性
6-;W
等+#7,还证实
35E%
也能通过
竞争性结合
O2R
蛋白来增强
8NJ%
的活性!在
8B
介导的防卫反应中起重要的作用在玫瑰花瓣发育
研究中发现!
3>8NJ%)%
能直接结合
75#$%# 基因 启动子+#0,乙烯显著增强 75#$%#
基因的表达!乙
烯处理
#>
!
75#$%# 的表达量达到对照的 #+0 倍& 处理 (> ! 75#$%#
的表达量上调至对照的
!+&$倍 本研究中! !"#$%
基因对
8B
响应模式与
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基因表达上调&
8B
处理
*>
!
!"#$% 基因表达上调至最高另外! ZFO2 处理 *> 显著下调 !"#$%
的表达
众多的研究表明!
52
*
O2
和
8B
这
%
种植物激
素介导的信号途径存在交互作用+!")!(,!
D8EE2
蛋
白在其中起着重要的作用而且!
D8EE2
蛋白除
了参与器官发育及防御反应外!也参与次生代谢产
物的合成如拟南芥
ZT1!
通过直接结合倍半萜
烯合成酶基因
09?!#
和
09?##
的启动子激活其
表达!而
D8EE2
蛋白
352
通过结合
ZT1!
抑制
倍半萜烯的生物合成+!&,结合
!"#$% 对割胶* 8B * ZFO2 的响应特点及植物中 52N 和 352 蛋白 功能上高度冗余性!推测 D8EE2 蛋白成员 MK52N 可能通过 O2 或 8B 信号途径在胶乳中发挥一定的 作用!但是具体作用机制还有待于进一步的证实 参考文献! + # , ! CQO2D8)38J2QDf ! 1E8Z8JB2 ! C833^ B)381G8JZ2JJ1 ! &/(,+8A> U ;F/F)-/W=@FW-/@VF:.F-/ Y ;=A:9-/F. U /A>FA:.F:@A-[-A U :/W 93J2;F[F;.-/!&&(")(*+,+&-*+*;:AFS@F;. + O , +9,(-/95 = *+3,3 @= ! #00* ! ?GD " # #$
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蛋白编码基因
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的克隆与表达分析