全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(６): ６０３￣６０８(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０６￣０３ꎻ 修回日期: ２０１４￣０８￣２３
基金项目: 国家科技支撑计划“粮食丰产科技工程”项目(２０１１ＢＡＤ１６Ｂ１２ꎻ２０１２ＢＡＤ０４Ｂ０３ꎻ２０１３ＢＡＤ０７Ｂ０３)ꎻ辽宁省玉米育种及配套技术
研究创新团队项目(２０１４２０１００３)
通讯作者: 高增贵ꎬ研究员ꎬ主要从事玉米及蔬菜病害研究ꎻ１３０６６６７４６４０ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｇａｏｚｅｎｇｇｕｉ＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ
第一作者: 孔婷婷ꎬ女ꎬ新疆石河子人ꎬ在读硕士ꎬ主要从事玉米病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｋｏｎｇｔｉｎｇｔｉｎｇ８５＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０６.００６
玉米纹枯病菌全长 ｃＤＮＡ文库的构建与鉴定
孔婷婷ꎬ 高增贵∗ꎬ 张 硕ꎬ 王 敏ꎬ 周艳波ꎬ 王小皙
(沈阳农业大学 植物免疫研究所ꎬ 沈阳 １１０８６６)
摘要:以玉米纹枯病菌菌丝为材料ꎬ利用 Ｉｎ￣Ｆｕｓｉｏｎ ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ｃＤＮＡ Ｌｉｂ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ构建玉米纹枯病菌全长 ｃＤＮＡ文
库ꎮ 文库质量鉴定结果表明ꎬ文库滴度为 １.２×１０６ｐｆｕｍＬ－１ꎬ重组率为 ９９.２％ꎬ插入片段平均长度大于 １.０ ｋｂꎮ 随机挑取
４００个白色克隆进行测序ꎬ共获得 ３２９个高质量 ＥＳＴ序列ꎬ经聚类拼接后得到 ２５０条 ｕｎｉｑｕｅ ＥＳＴꎬ包括 ３６ 条 ｃｏｎｔｉｇｓ 和 ２１４
条ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓꎮ 在 ＧｅｎＢａｎｋ 进行 Ｂｌａｓｔｎ 与 Ｂｌａｓｔｘ 同源比对ꎬ有 ２２７条 ＥＳＴ 与已知核酸或蛋白有不同程度的同源性ꎬ占全部
ＥＳＴ 的 ９０.８％ꎬ其余 ２３条无任何同源性ꎬ占 ９.２％ꎮ
关键词:玉米纹枯病菌ꎻ ｃＤＮＡ文库ꎻ 表达序列标签(ＥＳＴ)
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ
ＫＯＮＧ Ｔｉｎｇ￣ｔｉｎｇꎬ ＧＡＯ Ｚｅｎｇ￣ｇｕｉꎬ ＺＨＡＮＧ Ｓｈｕｏꎬ ＷＡＮＧ Ｍｉｎꎬ ＺＨＯＵ Ｙａｎ￣ｂｏꎬ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ￣ｘｉ ( Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｙｐｈａ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｉｎ￣Ｆｕｓｉｏｎ
ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ. Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ ｈａｄ ａ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｏｆ １.２×１０６ｐｆｕｍＬ－１
ａｎｄ ａ ９９.２％ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅꎬ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｃＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ａｂｏｖｅ １.０
ｋｂ. Ｔｈｅ ３２９ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ＥＳＴｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ４００ ｗｈｉｔｅ ｃｌｏｎｅｓ ｐｉｃｋｅｄ ｒａｎｄｏｍｌｙ. Ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｆ
ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇꎬ ２５０ ｕｎｉｑｕｅ ＥＳＴｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ３６ ｃｏｎｔｉｎｇｓ ａｎｄ ２１４ ｓｉｎｇｌｅｔｓ. Ｔｈｅｓｅ ｕｎｉｑｕｅ
ＥＳＴｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ Ｂｌａｓｔｘ ａｎｄ Ｂｌａｓｔｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｇａｉｎｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ.
Ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ２５０ ｕｎｉｑｕｅ ＥＳＴｓ ꎬ ２２７ ＥＳＴｓ ｔｈａｔ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ９０.８％ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ｕｎｉｇｅｎｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｋｎｏｗｎ ｇｅｎｅｓ ｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｒｅｓｔ ｔｈａｔ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ９.２％ ｈａｓ ｎｏ ｈｏｍｏｌｏｇｙ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉꎻ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙꎻ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ( ＥＳＴ)
中图分类号: Ｓ４３２.４４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０６￣０６０３￣０６
玉米纹枯病是我国玉米产区普遍发生的一种
玉米病害ꎬ其主要病原是茄丝核菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏ￣
ｌａｎｉ Ｋüｈｎ) [１]ꎮ 该病从玉米苗期至穗期均可发生ꎬ
危害高峰期在籽粒形成至灌浆充实期ꎻ生长后期植
株老健ꎬ病情趋于稳定[２]ꎮ 玉米纹枯病主要危害
叶鞘ꎬ其次是叶片、果穗及苞叶ꎬ发生严重时也能侵
入茎秆[３]ꎮ 近年来ꎬ随着辽宁省玉米种植面积的
扩大和氮肥的大量施用ꎬ以及玉米产区的大面积连
作ꎬ使玉米纹枯病的蔓延加快ꎬ危害逐年加重[４]ꎮ
国际上通常采用 Ｐａｒｍｅｔｅｒ[５]提出的丝核菌种内的
菌丝融合分类法ꎬＡＧ１￣ＩＡ 群为多核丝核菌ꎬ是辽
宁省玉米纹枯病菌的优势融合群[６]ꎮ 细胞壁降解
酶和毒素是玉米纹枯病的主要致病因子[７]ꎬ因此
研究这类物质合成和调控的相关基因在致病性研
究中显得格外重要ꎮ ｃＤＮＡ 文库是一种生物体所
有基因编码的 ｃＤＮＡ 分子的克隆群ꎬ是在基因组
水平上研究某一生物特定器官ꎬ特定组织ꎬ特定发
育时期基因表达的基础和前提ꎮ 全长 ｃＤＮＡ 文库
植物病理学报 ４４卷
是寻找、筛选分析基因和获得全长基因的重要手段
之一[ ８~１０]ꎮ 所以建立玉米纹枯病菌的 ｃＤＮＡ 文库
是提高基因鉴定效率的重要途径ꎮ 本文以辽宁省
玉米纹枯病菌的优势融合群 ＡＧ１￣ＩＡ 的强致病性
菌株ＷＦ￣９ 为材料ꎬ构建了玉米纹枯病菌的全长
ｃＤＮＡ文库ꎬ为致病相关基因的筛选、致病机理的
研究以及 ＥＳＴ测序和后续的基因组研究奠定了基
础ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
供试菌株 ＷＦ￣９ 由沈阳农业大学植物免疫室
保存ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 总 ＲＮＡ 的提取 从菌株保存管中挑取适
量菌丝接种到 ＰＤＡ平板上ꎬ２８℃恒温培养 ３ ｄꎮ 用
打孔器从菌落边缘切取直径为 ０.５ ｍｍ 的菌饼ꎬ取
５ 块放入 １００ ｍＬ ＰＤ培养基中ꎬ置于 ２８℃ꎬ １２０ ｒ
ｍｉｎ－１ꎬ摇菌 ７２ ｈꎮ 用镊子将菌饼取出ꎬ菌丝用灭菌
的滤纸吸干水分ꎬ然后用锡箔纸包裹后放入液氮中
冷冻ꎬ称取 １００ ｍｇ 菌丝体ꎬ立即置于预冷的研钵
中ꎬ加入液氮将样品研磨成粉末ꎬ立即转移到预冷
的 １.５ ｍＬ 离心管中ꎮ 按照试剂盒 (ＡｘｙＰｒｅｐ 总
ＲＮＡ小量制备试剂盒) 说明书提取样品的总
ＲＮＡꎮ 琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 的完整性ꎬ紫
外分光光度法检测总 ＲＮＡ 的浓度ꎮ
１.２.２ ｃＤＮＡ的合成 参照 Ｉｎ￣Ｆｕｓｉｏｎ ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ
ｃＤＮＡ Ｌｉｂ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ用户手册合成 ｃＤＮＡ第
一链ꎮ 在 ０. ２ ｍＬ 离心管中依次加入 ２ μＬ 总
ＲＮＡ、１ μＬ ３′Ｉｎ￣Ｆｕｓｉｏｎ ＳＭＡＲＴｅｒ ＣＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ (１２
μｍｏｔＬ－１)和 １.５ μＬ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ Ｈ２Ｏꎬ混匀后轻微
离心使混合液集中于管底ꎬ置于 ＰＣＲ 仪中 ７２℃温
育 ３ ｍｉｎꎬ然后 ４２℃温育 ２ ｍｉｎꎬ将配置好的缓冲液
加入到反应管中ꎬ混匀后轻微离心ꎬ置于 ４２℃温育
９０ ｍｉｎꎬ然后加热到 ６８ ℃ꎬ１０ ｍｉｎ 使酶失活ꎬ终止
反应ꎮ
利用 ＬＤ￣ＰＣＲ(Ｌｏｎｇ￣ｄｉｓｔａｎｃｅ ＰＣＲ)法扩增得
到双链 ｃＤＮＡꎮ ＰＣＲ引物为 ５′ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ ＩＩ Ａ(１２
μＭ) 和 ３′ Ｉｎ￣Ｆｕｓｉｏｎ ＳＭＡＲＴｅｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ ( １２
μＭ)ꎬ由试剂盒提供ꎮ 将 ＰＣＲ 仪预热到 ９５℃ꎬ建
立 ２个 １００ μＬ的 ＰＣＲ反应体系ꎬ按以下程序进行
扩增反应:９５℃ １ ｍｉｎꎻ９５℃ １５ ｓｅｃꎬ６５℃ ３０ ｓｅｃꎬ
６８℃ ６ ｍｉｎꎬ１５个循环后ꎬ从 １００ μＬ中取 ３０ μＬ到
新的 ＰＣＲ管中ꎬ剩余的先 ４℃保存ꎮ 取出的 ３０ μＬ
产物平均分到 ３ 个新 ＰＣＲ 管中ꎬ分别进行 ３ꎬ６ꎬ９
个循环ꎮ 然后从 ４管中分别取出 ５ μＬ ＰＣＲ 产物ꎬ
于１.２％琼脂糖凝胶上电泳ꎬ确定最佳循环数ꎬ再将
放在 ４℃的产物继续扩增至最佳循环数ꎮ
１.２.３ ｃＤＮＡ 文库的构建 使用 ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ对双链 ｃＤＮＡ进行纯化ꎬ用 ＣＨＲＯ￣
ＭＡ ＳＰＩＮ＋ＴＥ￣１０００ ｃｏｌｕｍｎｓ 将 ｃＤＮＡ 分级ꎬ回收
５００~ ３ ０００ ｂｐ 的片段ꎮ 使用随试剂盒提供的
ｐＳＭＡＲＴ２ＩＦＤ 线性载体与 ｃＤＮＡ 进行连接ꎬ在
ＰＣＲ仪上 ５０℃温育 １５ ｍｉｎꎬ然后转移到冰上ꎬ取 ２
μＬ 连接产物电击转化电激感受态细胞 ＤＨ ５α中ꎬ
加入 ３７℃预温好的 ＬＢ 培养基ꎬ使终体积为１ ｍＬꎮ
１８０ ｒｍｉｎ－１ꎬ３７℃振荡培养 １ ｈꎬ使菌体复苏ꎮ 取
５ μＬ转化产物加入 ９５ μＬ ＬＢ液体培养基ꎬ在准备
好的 ＬＢ 琼脂培养板 (含 Ａｍｐ １００ μｇｍＬ－１)上
均匀涂布 ４０ μＬ １００ ｍｍｏｌＬ－１的 ＩＰＴＧ 和 ４０ μＬ
２０ ｍｇｍＬ－１的 Ｘ￣Ｇａｌꎬ菌液混合后均匀涂布于培
养板上ꎬ然后倒置于 ３７℃培养箱中过夜培养ꎬ次日
查看菌落生长情况ꎬ计算重组率(白斑所占比例)ꎮ
１.２.４ 文库滴度检测与保存 将复苏后的菌体取
出 １ μＬꎬ稀释 １００倍ꎬ均匀涂布于一直径为 １５ ｃｍ
的 ＬＢ(Ａ＋Ｉ＋Ｘ)培养板上ꎬ做 ３ 个重复ꎬ其余菌液
加入等体积的 ５０％甘油(已灭菌)后保存于￣７０℃
冰箱ꎮ ３７℃倒置过夜培养ꎬ之后根据涂板结果计算
文库滴度:
文库滴度(ｃｆｕｍＬ－１)＝ 平板上的克隆数稀释倍数
涂布量(ｍＬ)
在每个平板中均加入 １ ｍＬ 含 １００ μｇｍＬ－１
Ａｍｐ的 ＬＢ 培养基ꎬ充分洗脱菌落ꎬ将所有洗脱液
混合ꎬ３７ ℃下振荡培养 １ ｈꎬ加入等体积的 ５０％甘
油(已灭菌)ꎬ分装后保存于￣７０℃冰箱ꎮ
１.２.５ 插入片段长度检测 用无菌牙签从文库菌
板上随机挑取 ３０ 个单菌落ꎬ接种到 ＬＢ 液体培养
基(含 ５０ μｇｍｌ－１的 Ａｍｐ)中ꎬ３７℃培养约 １ ｈ 至
对数生长后期ꎮ 提取质粒ꎬ在 ９４℃ ５ ｍｉｎꎻ ９４℃
３０ ｓꎬ６８℃ ３０ ｓꎬ７２℃ １ ｍｉｎꎬ３０个循环ꎻ７２℃ １０ ｍｉｎ
条件下 ＰＣＲ扩增ꎬ电泳检测插入片段大小ꎮ
１.２.６ ＥＳＴ 测序及分析 在 ｃＤＮＡ 文库菌板上随
机挑取 ４００个克隆ꎬ送往北京华大基因有限公司进
４０６
６期 孔婷婷ꎬ等:玉米纹枯病菌全长 ｃＤＮＡ文库的构建与鉴定
行 ５′端测序ꎬ用 Ｐｈｒｅｄ 程序包将测序峰图文件转化
为序列和质量文件ꎬ去除空载序列、低质量序列、载
体序列和长度小于 １００ ｂｐ 的序列ꎬ用 ＣＡＰ３ 软件对
所获得的 ＥＳＴ序列进行拼接ꎬ生成 ｃｏｎｔｉｇｓ和 ｓｉｎｇｌｅ￣
ｔｏｎｓꎬ并对数据进行统计ꎮ 将聚类拼接后得到的 ｕｎｉ￣
ｇｅｎｅ在 ＮＣＢＩ上分别与 ｎｔ 库和 ｎｒ 库进行相似性比
对分析ꎬ在 ＣＯＧ数据库进行基因功能分析和分类ꎮ
使用 ＤＮＡｍａｎ 软件对得到的 ｕｎｉｇｅｎｅ 进行 ＯＲＦ 预
测ꎬ结合 Ｂｌａｓｔ比对结果判断基因是否为全长ꎮ 能和
ｎｒ中的蛋白序列的“头部”(ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ)比对上的序
列定义为 Ｆ１ꎻ其 ＯＲＦ 能和 ｎｒ 比对上ꎬ但没有和 ｎｒ
里蛋白头部比对上的序列ꎬ若能在其比对部分的上
游找到 ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ 的序列ꎬ定义的 Ｆ２ꎻＯＲＦ 没有和
ｎｒ比对上ꎬ但在其序列上能找到 ＯＲＦ 的序列ꎬ定义
为 Ｆ３ꎻ全长 ｃＤＮＡ数目＝Ｆ１＋Ｆ２＋Ｆ３ꎮ
２ 结果
２.１ 总 ＲＮＡ质量检测
电泳检测(图 １)显示ꎬ总 ＲＮＡ 在 ２８Ｓ 和 １８Ｓ
区域有明显的条带ꎬ条带带型整齐而锋利ꎬ２８Ｓ 的
亮度大于 １８Ｓꎬ其条带亮度比接近 ２ ∶ １ꎬ说明样品
的完整性良好ꎮ 经紫外分光光度计检测ꎬ 样品的
ＯＤ２６０ / ＯＤ２８０为 ２.０４、ＯＤ２６０ / ＯＤ２３０ 为 １.９８ꎬ浓
度为 ５６８.７ ｎｇμＬ－１ꎬ说明样品几乎没有受到蛋白
质和多糖等有机物的污染ꎮ 综合以上结果ꎬ表明此
样品满足建库的要求ꎬ可以进行下一步实验ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｇｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ
２.２ 双链 ｃＤＮＡ的合成
从电泳结果 (图 ２)可以看出ꎬ各循环数的
ｃＤＮＡ样品的条带均呈弥散状分布ꎬ但是分布范围
不同ꎮ 进行 １５ 个循环的 ｃＤＮＡ 分布于 ２００ ~
２ ０００ ｂｐꎬ而且弥散带颜色较浅ꎬ表明此循环数下
合成的 ｃＤＮＡ量不能满足实验要求ꎻ２１ 和 ２４ 个循
环的 ｃＤＮＡ分布过广ꎬ出现了明显的过循环反应ꎬ
造成了 ｓｓＤＮＡ 的积累ꎮ 所以ꎬ综合判断扩增ｃＤＮＡ
的最佳循环数为 １８ꎬｃＤＮＡ分布介于 ３００~４ ０００ ｂｐ
之间ꎬ符合实验要求ꎮ 将其余的 １５ 个循环的样品
再进行 ３个循环的扩增以达到最佳循环数ꎬ进行后
续试验ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃＤＮＡ
Ｍ:１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ１:１５ ｃｙｃｌｅｓꎻ ２:１８ ｃｙｃｌｅｓꎻ ３:２１ ｃｙｃｌｅｓꎻ
４:２４ ｃｙｃｌｅｓ.
２.３ 文库滴度与重组率
通过蓝白斑筛选重组克隆ꎬ大部分菌落均为白
色ꎬ极少数为蓝色ꎬ重组率约为 ９９.２％ꎮ 经计算原始文
库的滴度为 １.２×１０６ ｃｆｕｍＬ－１ꎬ从文库中可以筛选出
所需的低拷贝基因ꎬ此文库为合格的 ｃＤＮＡ文库ꎮ
２.４ 插入片段大小检测
ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ３０条插
入片段的大小结果见图 ３ꎮ 插入片段大小分布在
３００~ ３ ０００ ｂｐ 之间ꎬ ２４ 条片段集中在 １ ０００ ~
２ ０００ ｂｐꎬ占总数的 ８０％ꎬ２ ０００ ~ ３ ０００ ｂｐ 的片段
２条ꎬ３００ ~ １ ０００ ｂｐ的片段 ４ 条ꎬ分别占 ６. ７％和
１３.３％ꎬ平均插入片段长度大于 １.０ ｋｂꎬ表明此文库
的插入片段能够代表重组子的生物信息ꎬ并且符合
ＥＳＴ序列测定要求ꎮ
２.５ ＥＳＴ测序及分析
从构建好的玉米纹枯病菌 ｃＤＮＡ 文库中随机
５０６
植物病理学报 ４４卷
挑取 ４００个克隆进行测序ꎬ共获得 ３２９ 条高质量
ＥＳＴｓ序列ꎬ有效序列长度分布在 １０６ ~ ８７０ ｂｐ 之
间ꎬ平均有效长度为 ５２４.５ ｂｐꎮ 聚类拼接后得到
２５０个非重复序列(ｕｎｉｇｅｎｅ)ꎬ包括 ３６ 个 ｃｏｎｔｉｇ 和
２１４个 ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓꎬ平均长度为 ６８７.６ ｂｐꎬ表明所测得
的 ＥＳＴ具有较高质量ꎮ 将所得序列在 ＮＣＢＩ上进行
Ｂｌａｓｔｎ和 Ｂｌａｓｔｘ比对ꎬ结果显示有 ２２７ 条 ＥＳＴ 序列
与已知基因或蛋白有不同程度的同源性ꎬ占全部
ｕｎｉｇｅｎｅ的 ９０.８％ꎬ其余比对没有注释的序列可能代
表了新的未知基因ꎮ 按照全长率统计方法ꎬ有 １３７
个 ＥＳＴ序列符合全长 ｃＤＮＡ 克隆要求ꎬ文库的全
长率为５４ .８％ ꎮＣＯＧ分析结果(图４)表明ꎬ这些
Ｆｉｇ. ３ Ｌｅｎｇｔｈ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ
Ｆｉｇ. ４ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ＣＯＧ ｄａｔａｂａｓｅ
６０６
６期 孔婷婷ꎬ等:玉米纹枯病菌全长 ｃＤＮＡ文库的构建与鉴定
ＥＳＴ片段参与了多种细胞过程ꎬ在已知功能的基因
中参与碳水化合物运输与代谢的 ＥＳＴ 最多ꎬ约占
总数的 １７.２７％ꎻ其次是翻译ꎬ核糖结构与发生的序
列约占 １６.３６％ꎻ之后是能量产生与转化以及蛋白
质翻译后修饰与转换ꎬ分子伴侣的序列ꎬ分别占
１０％和 ９.０９％ꎮ 由此可见ꎬ参与细胞正常生长发育
过程的基因占大多数ꎬ只有极少量的基因参与防
御、细胞运动性和信号转导等过程ꎬ这与生物体内
基因表达的一般规律是一致的ꎮ 表明玉米纹枯病
菌处于生长活跃期ꎬ细胞内各种代谢和蛋白质合成
非常活跃ꎬ此文库可以用来分析玉米纹枯病菌的基
因表达情况ꎮ
３ 讨论
高质量的总 ＲＮＡ 是构建 ｃＤＮＡ 文库的前提ꎬ
真菌菌丝富含 ＲＮａｓｅ、多糖以及糖蛋白等物质ꎬ这
些物质的许多理化性质与 ＲＮＡ 相似ꎬ而且含多糖
和 ＲＮＡ 的水相一经醇沉淀ꎬ多糖易与 ＲＮＡ 共沉
淀ꎬ此时 ＲＮＡ 便不能再溶解ꎬ提取时应选择合适
的方法ꎮ 本研究以立枯丝核菌菌丝为材料ꎬ使用
Ａｘｙｇｅｎ的 ＲＮＡ提取试剂盒ꎬ提取的 ＲＮＡ在 ２８Ｓ和
１８Ｓ区域有明显条带ꎬ并且条带带型整齐而锋利ꎬ
２８Ｓ和 １８Ｓ的条带亮度比接近 ２ ∶ １ꎬＯＤ２６０ / ＯＤ２８０
为 ２.０４、ＯＤ２６０ / ＯＤ２３０ 为 １.９８ꎬ浓度为 ５６８.７ ｎｇ
μＬ－１ꎬ说明提取的 ＲＮＡ完整性较好ꎬ基本没有核酸
和蛋白质的污染ꎬ符合构建文库的要求ꎮ
构建 ｃＤＮＡ 文库的方法较多ꎬ本研究利用
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 公司的 Ｉｎ￣Ｆｕｓｉｏｎ ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ｃＤＮＡ Ｌｉｂ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ构建玉米纹枯病菌的 ｃＤＮＡ文库ꎬ
此试剂盒结合了 ＳＭＡＲＴｅｒ ｃＤＮＡ 合成技术和
Ｉｎ￣Ｆｕｓｉｏｎ克隆技术ꎬ只需纳克级总 ＲＮＡ 就可以合
成高质量 ｃＤＮＡꎬ省去了 ｍＲＮＡ 的分离过程ꎬ
ＳＭＡＲＴＴＭ 技术利用升级版的 Ｏｌｉｇｏ(ｄＴ)引物来合
成第一链 ｃＤＮＡꎬ可以提高 ＰＣＲ 产物的产量ꎮ Ｉｎ￣
Ｆｕｓｉｏｎ 克隆技术没有位置和空间的限制ꎬ只需
５０℃ １５ ｍｉｎ便可完成与载体的连接ꎬ大大缩短了
反应时间ꎬ使目的基因的定向克隆快速而便捷ꎬ并
且试剂盒提供的是酶切后的线性载体ꎬ所以 ｃＤＮＡ
文库的构建过程省去了酶切这一步骤ꎮ
一个全长 ｃＤＮＡ文库的质量主要从以下 ３ 方
面评价:(１)文库容量ꎮ 所建文库滴度为 １.２×１０６
ｐｆｕｍＬ－１ꎬ保证了文库的完整性与覆盖度ꎻ(２)插
入片断的大小ꎮ 该文库插入片段的平均长度超过
１.０ ｋｂꎬ表明序列的完整性教高ꎻ(３)重组率大于
８０％的 ｃＤＮＡ文库即为合格的文库ꎬ所建文库重组
率达到 ９９.２％ꎮ 从以上几个方面可以看出ꎬ本研究
成功构建了一个高质量的玉米纹枯病菌全长 ｃＤ￣
ＮＡ文库ꎬ为大规模的 ＥＳＴ 测序、筛选致病相关基
因、发掘新基因以及基因功能研究提供了良好的技
术平台ꎮ
Ｚｈｅｎｇ 等[１１]对水稻纹枯病 ＡＧ１￣ＩＡ 融合群病
菌进行全基因组测序ꎬ并证明该基因组序列编码大
量的各种分泌蛋白、代谢酶、糖类激活酶、转运蛋白
等ꎮ Ｗｉｂｂｅｒｇ等[１２]分离出莴苣叶腐病病菌(Ｒｈｉ￣
ｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｋüｈｎ)ꎬ该病菌属于 ＡＧ１￣ＩＢ 融合
群ꎬ并对该病菌进行了全基因组测序ꎮ 与构建的玉
米纹枯病菌 ｃＤＮＡ 文库中的 ＥＳＴ 序列进行比对ꎬ
有 １６４条序列与 Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ＡＧ１￣ＩＡ和 Ｒｈｉ￣
ｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ＡＧ１￣ＩＢ有不同程度的同源性ꎬ并且
相似度最高可达 １００％ꎬ这为玉米纹枯病菌基因功
能的筛选和研究提供了良好的基础条件ꎮ 在文库
中筛选得到 Ｇ蛋白 α亚基、Ｇ蛋白 β亚基、丝裂原
活化蛋白激酶(ＭＡＰＫ)、丝裂原活化蛋白激酶激酶
(ＭＡＰＫＫ)、几丁质合酶、纤维素酶、磷酸酶蛋白、
细胞壁相关水解酶等致病相关基因ꎬ期望通过进一
步的研究ꎬ明确基因功能ꎬ探索致病机理ꎬ为玉米纹
枯病的有效管理和预防策略提供依据ꎮ
参考文献
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ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ＡＧ１￣ＩＢ ｉｓｏｌａｔｅ
７ / ３ / １４. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ２０１３ꎬ ｏｎｌｉｎｅ.
责任编辑:杨爱东
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