全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(3): 278鄄284(2011)
收稿日期: 2010鄄01鄄18; 修回日期: 2011鄄01鄄21
基金项目: 国家“973冶项目 (2006CB101900);国家 /江苏省自然科学基金项目(30671048,30671348) / BK2008337;国家博士点基金项目
(20050307034)
通讯作者: 周明国,教授,主要从事杀菌剂毒理和抗药性治理等研究; Tel / Fax: 025鄄84395641, E鄄mail: mgzhou@njau. edu. cn
作者简介: 陈长军(1967 - ),男, 江苏盐城人,副教授,博士,硕导,主要从事农药学及其抗药性分子机制等方面的研究; E鄄mail:
ccj100cn@yahoo. com. cn。
利用错配碱基引物的 ASO鄄PCR检测小麦赤霉病菌对
多菌灵中抗菌株 Codon200 TTC寅TAC基因型
陈长军, 蔡 倩, 王建新, 周明国*
(南京农业大学植物病理学系, 南京 210095)
摘要: 采用在引物 3忆端引入错配碱基,建立了特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株(Codon200 TTC寅TAC)基因型的
ASO鄄PCR分子检测技术。 结果表明含有错配碱基的引物对 NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err5 F能够特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵
的中抗菌株(Codon200 TTC寅TAC),扩增条件为 94益预热 5 min;94益变性 60 S,56益退火 60 S,72益延伸 60 S, 35 个循环;
最后 72益延伸 15 min。 并利用 26 种常见植物病原真菌验证了所设计引物的 PCR 扩增特异性。 整个检测过程快速,操作
简单,结果准确,在 6 小时内完成。
关键词: 小麦赤霉病菌; 多菌灵抗药性; ASO鄄PCR检测; Codon200 TTC寅TAC基因型; 错配碱基引物
ASO鄄PCR amplified by the primers with mismatches to detect moderately carbenda鄄
zim鄄resistant genotype (codon200TTC寅TAC) of Fusarium asiaticum摇 CHEN Chang鄄jun,
CAI Qian, WANG Jian鄄xin, ZHOU Ming鄄guo摇 (Department of Plant Pathology, Nanjing Agricultural University, Nan鄄
jing 210095, China)
Abstract: An allele specific oligonucleotide鄄PCR (ASO鄄PCR) with mismatches at the 3忆 terminal of the
primer was set up to detect moderately carbendazim (MBC) 鄄resistant genotype (Codon200 TTC寅TAC) of Fu鄄
sarium asiaticum. The results showed that a pair of probe, NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err5 F with mismatches was deve鄄
loped to successfully detect moderately MBC鄄resistant isolates (Codon200 TTC寅TAC) . The ASO鄄PCR ampli鄄
fication by MBCRF / MBCRR3 was conducted with the following parameters: an initial pre鄄heat at 94益 for 5
min, following by 35 cycles of denaturation at 94益 for 60 s, annealing at 56益 for 60 s, extension at 72益 for
60 s and terminated with a final extension at 72益 for 15 min. 26 important plant fungi were used to test the
amplification specificity of the primer pair. This method is simple,accurate and time鄄saving. The result was ob鄄
tained within 6 h.
Key words: Fusarium asiaticum; resistance of MBC; allele specific oligonucleotides鄄PCR with mismatches;
genotype of Codon200 TTC寅TAC; mismatch primers
中图分类号: S435. 72摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)03鄄0278鄄07
摇 摇 禾谷镰孢菌复合种群(Fusarium graminearum
complex)中的 F. asiaticum是我国小麦赤霉病优势
致病真菌。 在该病的防治上,我国长期以来主要采
用多菌灵( carbendazim, MBC)进行扬花期喷雾,
取得了较好的效果。 多菌灵属于苯并咪唑杀菌剂,
该类杀菌剂具有高效、广谱和内吸的特点。 一般使
摇
摇 3 期摇 陈长军,等:利用错配碱基引物的 ASO鄄PCR检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株 Codon200 TTC寅TAC基因型
用 2 ~ 3 年后,大多数病原菌都会对它产生抗药性。
但我国连续使用多菌灵防治小麦赤霉病 20 多年,
一直未能检测到该病原菌的抗性菌株[1,2]。 1991
年 Zhou 等[1]首先获得了紫外诱变的抗性菌株,并
于 1992 年在浙江海宁首次检测到对多菌灵具有抗
性的小麦赤霉病菌田间抗药菌株,随后进行连续十
多年的系统检测,结果表明抗性菌株在群体的比例
呈上升趋势[3 ~ 5]。
对苯并咪唑类药剂的杀菌机制和抗药性机制
研究表明,药剂主要是结合在病菌的 茁鄄微管蛋白
上而阻止细胞的有丝分裂,达到抑制病菌生长的目
的[6]。 已有的对几种植物病原菌的分子生物学研
究表明,病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性自然突
变体主要是其 茁鄄微管蛋白 196 ~ 202 位氨基酸的
改变,这些改变使该蛋白质的三维构象发生改变,
从而阻止了药剂与靶标结合,使病菌表现抗药
性[7,8]。 在人工诱变突变体中除上述位点外还涉
及其它一些位点,如 165、257 位等的氨基酸变
异[9]。 通过定点突变也确认了 198 和 200 位氨基
酸类型与抗感性密切相关。
已有研究表明,亚洲镰孢菌对多菌灵的抗药性
机制并非像其他丝状真菌一样由 茁鄄微管蛋白 198
位氨基酸突变所致,而是由于该病原菌菌体内的一
种新微管蛋白基因(茁2 鄄tub)发生了突变[10,11]。 通
过构建 茁2 鄄tub 的敲除突变体、原位回复突变体、用
多菌灵抗药性菌株的 茁2 鄄tub 置换野生敏感性菌株
中的 茁2 鄄tub、用野生敏感性菌株 茁2 鄄tub 分别置换中
抗和高抗菌株中的 茁2 鄄tub,所获得的突变体均具有
期望的抗药性表型,揭示了 茁2 鄄tub突变导致亚洲镰
孢菌对多菌灵产生抗药性[12]。 目前所获得的亚洲
镰孢菌对多菌灵抗药性表型共四种:(1) 野生敏感
菌株,编码新微管蛋白的基因型为 Codon73(CAG)
Codon167(TTT) Codon198(GAG) Codon200(TTC);
田间中抗菌株存在两种基因型,即 (2) Codon73
(CAG) Codon167(TAT) Codon198(GAG) Codon200
(TTC)和(3)Codon73 (CAG) Codon167 (TTT) Co鄄
don198(GAG) Codon200(TAC),后者简称 Codon200
TTC寅TAC;(4)田间高抗菌株,基因型为 Codon73
(CGG) Codon167(TTT) Codon198(CTG) Codon200
(TTC) [12]。
亚洲镰孢菌对多菌灵抗药性基因及基因型的
研究为该病害的抗药性分子检测和治理等奠定了
理论基础。 研究还表明,田间中抗菌株 Codon200
TTC(Phe)寅TAC(Tyr)基因型由于编码新微管蛋
白基因第 200 位氨基酸密码子中胸腺嘧啶(T)突
变成腺嘌呤(A),采用常规设计的等位基因特异性
寡核苷酸(ASO)引物不能将该基因型从其他的多
菌灵抗药性表型中区分开来。 为此,本文针对常规
ASO引物特异性差的特点,研发引入错配碱基的
ASO鄄PCR引物,特异性检测亚洲镰孢菌对多菌灵
中抗菌株 Codon200 TTC寅TAC 基因型的分子检测
技术,为抗药性小麦赤霉病菌的监测和快速分子检
测奠定了理论基础。
1摇 材料与方法
1. 1摇 供试菌株
供试小麦赤霉病菌菌株包括小麦赤霉病菌对
多菌灵的抗药性中抗菌株 NT鄄7(Codon200 TTC寅
TAC)和 ZF鄄52 (Codon167 TTT寅TAT),高抗菌株
JT04 ( Codon198 TTT 寅 CTG + Codon73 CAG 寅
CGG)及野生敏感菌株 ZF2021 和 ZF2043。
供测试探针特异性的 26 个植物病原真菌包括
水稻恶苗病菌(Gibberella fujikuroi)、小麦全蚀病
菌(Gaeumannomyces graminis var. tritici)、番茄早
疫病菌 (Alternaria solani)、青菜黑斑病菌 ( A.
brassicae)、油菜菌核病菌 ( Sclerotinia sclerotio鄄
rum)、番茄灰霉病菌 (Botrytis cinerea Pers. )、葡萄
灰霉病菌 (B. cinerea)、梨腐烂病菌 (Cytospora
carphosperma)、苹果斑点落叶病菌 ( Phyllosticta
mali)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)、辣椒
黑点病菌 (C. capsici)、稻瘟病菌 ( Pycicularia
grisea)、黄瓜立枯病菌 (Rhizoctonia solani)、大蒜
叶枯病菌 ( Stemphylium vesicarium)、西瓜枯萎病
菌 (F. oxysporum f. sp. niveum)、棉花枯萎病菌
(F. oxysporum f. sp. vasinfectum)、柑桔干腐病菌
(F. moniliforme)、辣椒根腐病菌 (F. solani)、茄
子褐纹病菌 ( Phomopsis vexans)、梨轮纹病菌
(Macrophoma kawatsukai)、水稻黑霉病菌(Nigros鄄
pora oryzae)、西瓜蔓枯病菌 (Mycosphaerella mel鄄
onis)、芦笋茎枯病菌(Phomopsis asparagi)、黄瓜黑
星病菌(Cladosporium cucumerinum)、 柑桔青霉病
菌(Penicillium italicum)和甜菜褐斑病菌(Cercos鄄
pora beticola)。
972
摇
植物病理学报 41 卷
1. 2摇 基因组 DNA提取
分别将 5 个小麦赤霉病菌菌株和 26 个引物特
异性测试菌株的预培养菌碟转入 PS(马铃薯 200
g,蔗糖 20 g,去离子水 1 000 mL ),25益摇床培养
4 d,收集菌丝,冻干。 取 0. 2 g 菌丝,液氮研磨,加
800 滋L DNA 提取缓冲液(100 mmol / L LiCl;10
mmol / L Tris鄄HCL, pH8. 0;10 g / L SDS,高压灭
菌),充分震荡,60益孵育 60 min,10 000 rpm 离心
4 min后,用苯酚:氯仿:异戊醇(25颐 24 颐 1)抽提 2
次至无中间层,上清液加 1 倍体积异丙醇沉淀,离
心,干燥后溶于 50 滋L TE(含 20 滋g / mL RNase)。
37益水浴 20 min,取 5 滋L DNA提取液用于 0. 9%
琼脂糖电泳检测。
1. 3摇 采用 ASO鄄PCR 方法设计、筛选小麦赤霉病
菌对多菌灵抗药性中抗菌株 Codon200 TTC
寅TAC基因型引物及其检测
针对 Codon200 TTC寅TAC 基因型,在上游扩
增引物的 3忆端 2 ~ 5 碱基处人为引入错配碱基,共
设计了 16 条上游扩增引物(表 1)。
ASO鄄PCR反应 50 滋L 体系中含有 dNTP 0. 2
滋M,上游引物和下游引物均为 1 滋M,Taq DNA 聚
合酶(申能博彩生物技术有限公司)2. 5 U,模板
DNA 100 ng,10 伊 buffer(10 滋M Tris鄄HCl,50 mM
KCl)5 滋L,用 ddH2O补足至 50 滋L。
探针筛选:引物对 NT鄄7 R1 / NT鄄7 F、NT鄄7
R1 / NT鄄7 Err1 F、NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err2 F、NT鄄7 R1 /
NT鄄7 Err3 F、NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err4 F、NT鄄7 R1 / NT鄄7
Err5 F、NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err6 F、NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err7
F,引物对 NT鄄7 R2 / NT鄄7 F、NT鄄7 R2 / NT鄄7 Err1
F、NT鄄7 R2 / NT鄄7 Err2 F、NT鄄7 R2 / NT鄄7 Err3 F、
NT鄄7 R2 / NT鄄7 Err4 F、NT鄄7 R2 / NT鄄7 Err5 F、NT鄄7
R2 / NT鄄7 Err6 F、NT鄄7 R2 / NT鄄7 Err7 F,引物对
NT鄄7 R1 / S F、NT鄄7 R1 / S鄄Err1 F、NT鄄7 R1 / S鄄Err2
F、NT鄄7 R1 / S鄄Err3 F、NT鄄7 R1 / S鄄Err4 F、NT鄄7 R1 /
S鄄Err5 F、NT鄄7 R1 / S鄄Err6 F、NT鄄7 R1 / S鄄Err7 F,引
物对 NT鄄7 R2 / S F、NT鄄7 R2 / S鄄Err1 F、NT鄄7 R2 / S鄄
Err2 F、NT鄄7 R2 / S鄄Err3 F、NT鄄7 R2 / S鄄Err4 F、NT鄄7
R2 / S鄄Err5 F、NT鄄7 R2 / S鄄Err6 F、NT鄄7 R2 / S鄄Err7 F。
扩增条件均为 94益 5 min;94益 45 s,56益 45 s,
72益 45 s,35 次循环;72益 15 min。
Table 1摇 PCR primers applied to detect the moderately MBC鄄resistant isolates of Fusarium asiaticum
Primer Primer length(bp) Sequences (5忆寅 3忆)
NT鄄7 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGACCTA
NT鄄7 Err1 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGACC C A
NT鄄7 Err2 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGACC A A
NT鄄7 Err3 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGAC GTA
NT鄄7 Err4 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGAC ATA
NT鄄7 Err5 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGA GCTA
NT鄄7 Err6 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGA ACTA
NT鄄7 Err7 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAG T C G TA
S F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGACCTT
S鄄Err1 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGACC C T
S鄄Err2 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGACC A T
S鄄Err3 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGAC G TT
S鄄Err4 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGAC A TT
S鄄Err5 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGA GCTT
S鄄Err6 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAGA ACTT
S鄄Err7 F 25 TCGTCGAGAACTCTGACGAG T C G TT
NT鄄7 R1( in intron) 25 TAAGGCAAGGGGGCTGAAGTGAAGA
NT鄄7 R2( in extron) 25 AACAAGGCGGTAGAACATTCAAAAC
Underlined letters represent the mutation at codon200 in the 茁2 鄄tubulin of F. asiaticum conferred the moderate resistance a鄄
gainst carbendazim. The framed letters represent the mismatch at the 3忆 terminal of the primer.
082
摇
摇 3 期摇 陈长军,等:利用错配碱基引物的 ASO鄄PCR检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株 Codon200 TTC寅TAC基因型
1. 4摇 引入错配碱基探针的特异性评价
1. 4. 1摇 利用 26 种常见病原真菌评价引物特异性
利用 26 种常见的植物病原真菌对所获筛选引物的
特异性进行评价。 首先将它们分别培养,获得冻干
的菌丝体,液氮研磨,提取 DNA 的方法同 1. 2。
PCR扩增体系均为 50 滋L,除模板差异外,体系组
分、扩增条件和检测方法同 1. 3。 PCR 产物采用
2郾 0% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 4. 2摇 利用不同敏感性水平小麦赤霉病菌菌株评
价引物特异性 摇 选取对多菌灵敏感菌株 ZF2043
和 ZF2021、中抗菌株 ZF52、 NT鄄7 和高抗菌株
JT04。 菌株培养、菌丝收集、DNA 提取、PCR 反应
的扩增体系(仅模板不同)和温度参数同方法 1. 2
和 1. 3。
2摇 结果与分析
2. 1摇 小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株 Codon200
TTC寅TAC基因型探针的设计、筛选
2. 1. 1摇 ASO鄄PCR 上游引物 3忆端引入错配碱基的
设计摇 由于采用常规的 ASO鄄PCR不能检测到 Co鄄
don200 TTC寅TAC基因型,因此在上游引物 3忆端的
倒数第 2 ~ 5 的位置引入错配碱基(表 1),利用错
配碱基增加引物对中抗菌株突变位点的选择和敏
感位点的识别。 分别设计了 8 条针对中抗菌株
Codon200 TTC寅TAC基因型检测、8 条针对敏感菌
株中 Codon200 TTC检测的上游引物。
2. 1. 2摇 小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株 Codon200
TTC寅TAC基因型探针的筛选摇 小麦赤霉病菌对
多菌灵中抗菌株 Codon200 TTC寅TAC 及其野生敏
感菌株的上游探针共 16 条,采用 ASO鄄PCR 方法
分别对 32 个探针组合进行了筛选。 结果表明,引
物对 NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err4 F、NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err5 F
扩增后,NT鄄7 有清晰条带(222 bp),而 ZF2021 无
条带,能够很好地区分特定基因型;经引物对 NT鄄7
R1 / S鄄Err6 F、NT鄄7 R2 / S鄄Err4 F、NT鄄7 R2 / S鄄Err6 F
扩增后,ZF2021 有清晰条带(335 bp),而 NT鄄7 无
条带, NT鄄7 R2 / S鄄Err4 F、 NT鄄7 R2 / S鄄Err6 F 对
ZF2021 微弱的拖尾。
通过筛选,获得 2 对能够有效检测小麦赤霉病
菌中抗菌株基因型 Codon200 (TTC寅 TAC)的探
针,即:NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err4 F 和 NT鄄7 R1 / NT鄄7
Err5 F,1 对用于筛选小麦赤霉病菌对多菌灵敏感
菌株 Codon200 TTC的引物 NT鄄7 R2 / S鄄Err6 F(图 1)。
2. 2摇 探针的特异性评价
将所筛选的 3 对探针(用于检测 Codon200 TTC
寅TAC)对水稻恶苗病菌(G. fujikuroi)等其他 26
种植物病原真菌进行特异性验证。 结果表明,引物
对 R1 / NT鄄7 Err5 F 显示了高度的特异性,26 种供
试真菌均无特征条带 (图 2鄄A);引物对 NT鄄7 R1 /
NT鄄7 Err4 F特异性次之 (图 2鄄B),26 种植物病原
真菌中,仅对柑桔干腐病菌(F. moniliforme)、棉花
Fig. 1摇 Electrophoresis analysis of the probes to detect moderately carbendazim鄄resistant
genotype (Codon200 TTC寅TAC) of Fusarium asiaticum
Lanes 1, 3, 5, 7, 9 and 2, 4, 6, 8, 10 are the amplificons of moderately carbendazim鄄resistant isolate NT鄄7 and
carbendazim鄄sensitive isolate ZF2021, respectively. Lanes 1 and 2, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8, 9 and 10 were analyzed
by the primer pairs NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err4 F, NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err5 F, NT鄄7 R1 / S鄄Err6 F, NT鄄7 R2 / S鄄Err4 F
and NT鄄7 R2 / S鄄Err6 F, respectively; M: DNA ladder DL2000 (TaKaRa) .
182
摇
植物病理学报 41 卷
枯萎病菌(F. oxysporum)、黄瓜立枯病菌(R. sola鄄
ni)扩增出特征条带;引物对 NT鄄7 R1 / S鄄Err6 F 最
差(图 2鄄C),8 种植物病原真菌即水稻恶苗病菌
(G. fujikuroi)、小麦全蚀病菌(G. graminis var.
tritici)、西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. nive鄄
um)、柑桔干腐病菌(F. moniliforme)、油菜菌核病
菌( S. sclerotiorum)、番茄灰霉病菌 ( B. cinerea
Pers)、苹果斑点落叶病菌(P. mali)、辣椒根腐病
菌(F. solani))扩增出特征条带。
2. 3摇 引物探针 NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err5 F 对亚洲镰
孢菌不同敏感性水平菌株特异性评价
亚洲镰孢菌的 2 个野生敏感菌株、1 个对多菌
灵的高抗菌株和 2 个中抗菌株用于测定引物探针
NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err5 F 的特异性。 结果表明,引物
探针 NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err5 F 能够从 4 种对多菌灵
不同敏感性水平的供试菌株中特异性地区分出中
抗菌株基因型(Codon200 TTC寅 TAC)(图 3)。
Fig. 2摇 Specificity of the three primer pairs tested with other 26 plant pathogenetic fungi
Plates A, B and C show the PCR products of the genomic DNA of the 26 plant pathogens amplified with primer
pairs NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err5 F, NT鄄7 R1 / NT鄄7 Err4 F and NT鄄7 R1 / S鄄Err6 F, respectively. Lanes 1 to 27 were Gibberella
fujikuroi, Colletotrichum capsici, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Fusarium oxysporum f. sp. niveum,
F. moniliforme, F. oxysporum f. sp. vasinfectum, Alternaria solani, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea Pers. ,
Cytospora carphosperma, Phyllosticta mali, Alternaria brassicae, Colletotrichum musae, Macrophoma kawatsukai,
Botrytis cinerea, Nigrospora oryzae, Mycosphaerella melonis, Phomopsis asparagi, Cladosporium cucumerinum,
Penicillum italicum, F. solani, Rhizoctonia solani, Stemphylium vesicarium, Phomopsis vexans, Colletotrichum musae,
Cercospora beticola and Pycicularia grisea; M: DNA ladder DL2000 (TaKaRa) .
282
摇
摇 3 期摇 陈长军,等:利用错配碱基引物的 ASO鄄PCR检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株 Codon200 TTC寅TAC基因型
Fig. 3摇 Specificity of primer probes, NT鄄7 R1 /
NT鄄7 Err5 F to differentiate the mode鄄
rately carbendazim鄄resistant isolate
(Codon200 TTC寅 TAC) from four Fu鄄
sarium graminearum isolates with dif鄄
ferent carbendazim鄄resistant sensitivity
Lane 1 to 5: Amplificons of moderately carbendazim鄄resistant
isolates NT鄄7(Codon200 TTC寅TAC), ZF鄄52(Codon167 TTT
寅TAT), highly carbendazim鄄resistant isolate JT04 (Codon73
CAG寅CGG + Codon198 TTC寅CTG), carbendazim鄄sensitive
isolates ZF2021 and ZF2043; M:DNA ladder 2000 (TaKa鄄
Ra) .
3摇 讨论
本文采用在引物 3忆端引入错配碱基,建立了
小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株 Codon200 TTC寅
TAC 基因型的快速分子检测技术,克服了常规
ASO鄄PCR特异性差的特点,避免了常规含药平板
抗药性检测方法的繁琐。 采用常规方法鉴定抗药
性菌株通常需要分离、纯化和培养,对杀菌剂的敏
感性测定一般耗时两周,步骤繁琐,检测周期长。
而采用该技术,可以直接提取待测病菌 DNA,进行
PCR扩增,6 小时内即可获得所测菌株对多菌灵特
定的基因型。
近年来,ASO鄄PCR技术以其操作简单、成本低
廉、快速等特点,在医学[13,14]、农业领域得到广泛
的运用,如 Li 等[15]用 ASO鄄PCR 技术快速检测抗
多菌灵的油菜菌核病菌。 在 ASO 引物探针设计
时,通常将抗药性突变位点放在探针的 3忆端,但是
这种设计往往会出现设计探针的特异性较差,特别
是遇到碱基 A突变成 T,或者 T突变成 A时,很难
设计出高灵敏度的探针。 在所设计的探针 3忆端倒
数第 3 ~ 5 碱基引入错配,进行筛选探针,即可获得
高灵敏度的探针。 研究结果也表明,所研发的引物
探针具有较好的特异性,可以将小麦赤霉病菌的多
菌灵中抗菌株 Codon200 TTC寅 TAC基因型从其他
抗药性表型中检测出来,并对常规的植物病原真菌
具有较高的特异性。
在小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性菌株中,中抗
菌株占绝大多数( > 99% ),而在中抗菌株中,又以
Codon73(CAG) Codon167 (TAT) Codon198 (GAG)
Codon200(TTC)基因型为主流,约占 95% ;Codon200
TTC寅 TAC 基因型约占 5% ,但是对后者的研究,
弥补了针对前者基因型设计 ASO 引物探针的
不足。
关于病原菌种名:在上世纪 70 年代,根据生物
特征的不同,将 F. graminearum complex 分为两
组[16,17]。 第 1 组在培养条件下不形成子囊壳,有
性生殖属于异宗配合,主要通过土壤传播,分布在
澳大利亚、南非和北美等的干旱地区,称之为 F.
pseudograminearum[18];第二组有性生殖属于同宗
配合,在田间和实验室条件下能够形成大量的子囊
壳[19,20],根据 6 个结构基因的 DNA序列特征形成
7 个系统发生宗谱(phylogenetic lineages)。 最近,
又根据宗谱和谐系统发生种识别 ( genealogical
concordance phylogenetic species recognition,
GCPSR)的概念将它们分成 9 个系统发生种(phy鄄
logenetic species) [21],包含 F. asiaticum。
作者所在的实验室研究表明:在中国,尽管这
两种病原菌(F. graminearum 和 F. asiaticum)均
能够使小麦致病,但是它们对多菌灵的敏感性存在
差异。 从长江中下游共采集、分离了 5000 多个单
孢菌株,F. graminearum 占总分离菌株的 5% 左
右,仅约 5%的 F. graminearum菌株对多菌灵产生
低抗(EC50是野生敏感菌株的 3 ~ 5 倍);F. asiatic鄄
um占总分离菌株的 95% ,对多菌灵形成不同水平
的敏感性,包括中抗和高抗[12]。
参考文献
[1] 摇 Zhou M G, Ye Z Y. Resistance of plant pathogens a鄄
gainst benzimidazoles and other relative fungicides( in
Chinese) [J] . Crop Protection(植物保护), 1987, 13
(2): 31 -33.
[2] 摇 Zhou M G, Ye Z Y, Liu J F. Progress in fungicidal
resistance ( in Chinese) [J] . Journal of Nanjing Agri鄄
cultural Uniniversity (南京农业大学学报), 1994, 17
(3): 33 -41.
[3] 摇 Wang J X, Zhou M G, Lu Y J, et al. Dynamics of
382
摇
植物病理学报 41 卷
resistant population of Fusarium graminearum to car鄄
bendazim and substitutable fungicide screening ( in
Chinese) [J] . Journal of Nanjing Agricultural Unini鄄
versity (南京农业大学学报), 2002, 25(1): 43 -
47.
[4] 摇 Zhou M G, Wang J X. Study on sensitivity base鄄line
of Fusarium graminearum to carbendazim and biologi鄄
cal characters of MBC鄄resistant strains ( in Chinese)
[J] . Acta Phytopathologica Sinica(植物病理学报),
2001, 31(4): 365 -370
[5] 摇 Zhou M G. Resistance detection of several plant patho鄄
gens from China to fungicides ( in Chinese) [J] . Pes鄄
ticide Science and Administration(农药科学与管理),
1999, 20(3): 39 -40
[6] 摇 Fujimura M, Kanakura T, Yamaguchi, I. Action
mechanism of diethofencarb to a benzimidazole鄄resis鄄
tant mutant in Neurospora crassa[ J] . J. Pesti. Sci. ,
1992, 17, 237.
[7] 摇 Koeneaade H, Jones A L. Resistance to benomyl con鄄
ferred by mutations in codon 198 or 200 in the beta鄄tu鄄
bulin gene of mutations Neurospora crassa and sensi鄄
tivity to diethofencarb conferred by codon 198 [ J] .
Photopathology, 1993, 83: 850 -854.
[8] 摇 Yarden O,Katan T. Mutations leading to substitutions
at amino acids 198 and 200 on beta鄄tubulin that corre鄄
lates with benomyl resistance genotypes of field strains
of Botrytis cinerea [ J] . Phtopathology, 1993, 83:
1478 -1483.
[9] 摇 Yan K, Dickman M B. Isolation of a 茁鄄tubulin gene
from Fusarium moniliforme that confers cold鄄sensitive
benomyl resistance[J] . Applied and Enviromental Mi鄄
crobilogy, 1996, 62(8): 3053 -3056.
[10] Li H X, Lu Y J, Wang J X, et al. Cloning of 茁鄄tubu鄄
lin gene from Gibberella zeae and analysis its relation鄄
ship with carbendazim鄄resistance ( in Chinese) [ J] .
Acta Microbiologica Sinica(微生物学报), 2003, 43
(4): 424 -429.
[11] Lu Y J, Zhou M G, Ye Z Y, et al. Closing and cha鄄
racterization of 茁鄄tubulin gene fragment from carbenda鄄
zim resistance strain of Fusarium graminearum( in Chi鄄
nese) [J] . Acta Phytopathologica Sinica(植物病理学
报), 2002, 30(1): 30 -34.
[12] Chen C J, Yu J J, Bi C W, et al. Mutations in a
茁鄄tubulin confer resistance of Gibberella zeae to benz鄄
imidazole fungicides [J] . Phytopathology, 2009, 99:
1403 -1411.
[13] Kang HY, Hwang JY, Kim SH, et al. Comparison of
allele specific oligonucleotide鄄polymerase chain reac鄄
tion and direct sequencing for high throughput screen鄄
ing of ABL kinase domain mutations in chronic mye鄄
loid leukemia resistant to imatinib[J] . Haematologica.
2006, 91(5): 659 -62.
[14] Cooke F, Bakkus M, Thielemans K, et al. Use of
quantitative ASO鄄PCR to predict relapse in multiple
myeloma[J] . Br J Haematol. 1999, 105(1): 317 -
319.
[15] Li H X, Zhou M G. Rapid identification of carbenda鄄
zim resistant strains of Sclerotinia sclerotiorum using
allele鄄specific oligonucleotide (ASO) 鄄PCR ( in Chi鄄
nese) [ J] . Scientia Agricultura Sinica (中国农业科
学), 2004, 37(9): 1396 -1399.
[16] Burgess L W, Wearing A H, Toussoun T A. Surveys
of Fusaria associated with crown rot of wheat in eastern
Australia [J] . Aust. J. Agric. Res. 1975, 26: 791 -
799.
[17] Francis, R G and Burgess L W. Characteristics of two
populations of Fusarium roseum “Graminearum冶 in
eastern Australia[J] . Trans. Br. Mycol. Soc. 1977,
68: 421 -427.
[18] Aoki T, O忆Donnell K. Morphological and molecular
characterization of Fusarium pseudograminearum sp.
nov. , formerly recognized as the Group 1 population
of F. graminearum [J] . Mycologia,1999, 91: 597 -
609.
[19] Bowden R L, and Leslie J F. Nitrate鄄nonutilizing mu鄄
tants of Gibberella zeae (Fusarium graminearum) and
their use in determining vegetative compatibility [ J] .
Exp. Mycol. 1992, 16: 308 -315.
[20] Bowden, R. L. , and Leslie, J. F. 1999. Sexual re鄄
combination in Gibberella zeae [ J] . Phytopathology
89: 182 -188.
[21] O忆Donnell K, Kistler H C, Tacke B K, et al. Gene
genealogies reveal global phylogeographic structure and
reproductive isolation among lineages of Fusarium gra鄄
minearum, the fungus causing wheat scab[ J] . Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 7905 -7910.
责任编辑:李晖
482