全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 252-259(2012)
收稿日期: 2011-12-15; 修回日期: 2012-03-05
基金项目: 国家自然科学基金(30971891); 国家 863 计划项目(2008AA10Z414)
通讯作者: 周明国,教授,主要从事植物病害化学防治研究; Tel: 025-84395249, E-mail: mgzhou@njau. edu. cn
第一作者: 徐建强(1979-),男,河南商丘人,讲师,在读博士,主要从事杀菌剂毒理及抗药性研究; E-mail: xujqhust@126. com。
小麦赤霉病菌 α-微管蛋白原核表达及纯化研究
徐建强1,2, 张 聪1, 于金凤1, 彭 迪1, 周明国1*
( 1南京农业大学植物保护学院 /农业部作物病虫害监测及防控重点开放实验室, 南京 210095;
2河南科技大学林学院, 洛阳 471003)
摘要:为了制备小麦赤霉病菌的 α-微管蛋白,以小麦赤霉病菌 cDNA为模板,PCR扩增出 α1 -、α2 -微管蛋白基因,将其克隆
到 pET30a +表达载体上,转化到表达宿主菌 Rossatta(DE3)pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达。 SDS-PAGE 及 Wes-
tern-b1ot结果表明:融合蛋白主要以包涵体形式存在;融合蛋白分子量约为 52. 1 和 55. 9 kD;融合蛋白能与抗 6 × His的单
抗发生特异性反应。 通过对包涵体洗涤及透析复性后采用 HisTrapTM HP Columns 对融合蛋白进行纯化,可以得到纯度较
高的融合蛋白。 该研究为体外筛选以微管蛋白为靶标的杀菌剂提供了物质基础。
关键词:小麦赤霉病菌; α-微管蛋白; 包涵体; 融合蛋白纯化
Expression and purification of Fusarium graminearum α-tubulin in Escherichia coli
XU Jian-qiang1,2, ZHANG Cong1, YU Jin-feng1, PENG Di1, ZHOU Ming-guo1 　 ( 1Department of Plant Patho-
logy, College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2College of Forestry, Henan Uni-
versity of Science and Technology, Luoyang 471003, China)
Abstract: The paper aimed to express the α-tubulins of Fusarium graminearum in Escherichia coli and purify
them. The α-tubulin genes were amplified from F. graminearum cDNA and cloned to the vector pET30a + ,
then transformed into the host Rossatta(DE3) pLysS. After the positive clones were screened by the colony
PCR and double digestion, the induced fusion proteins were obtained and verified by SDS-PAGE and Western
blot. The positive clones which could express more fusion protein were screened, however, the fusion proteins
formed were mainly inclusion bodies. The molecular weight of fusion proteins were confirmed to be 52. 1 and
55. 9 kD by SDS-PAGE, which also showed specific activity to anti-6 × His monoclonal antibody. After
washing inclusion bodies with the buffer containing 2 and 3 mol / L urea, the purity of fusion protein would
increase. The soluble fusion protein was obtained by dialysis to binding buffer and then α-tubulins were
purified by HisTrapTM HP Columns. The purified tubulins can be used in the studies of new fungicide screening
that target tubulin in vitro.
Key words: Fusarium graminearum; α-tubulin; inclusion body; fusion protein purification
中图分类号: S432　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)03-0252-08
　 　 小麦赤霉病是小麦生产中的一种毁灭性病害,
它不仅造成小麦产量损失,而且病菌产生的毒素对
小麦品质也造成了严重的污染[1]。 小麦赤霉病主
要由禾谷镰孢菌 (Fusarium graminearum)引起。
长期以来,国内对小麦赤霉病的防治主要是在小麦
扬花期喷施多菌灵和硫菌灵等苯并咪唑类杀菌剂
来进行。 但自上世纪九十年代初期,Zhou 等[2]首
次监测到对多菌灵产生抗药性的菌株以来,生产中
　
　 3 期 　 　 徐建强,等:小麦赤霉病菌 α-微管蛋白原核表达及纯化研究
抗药性菌株日益增多,多菌灵抗性问题愈发严重,
生产中急需防治小麦赤霉病的多菌灵替换药
剂[3]。
微管由微管蛋白( tubulin) 和微管辅助蛋白
(Microtubule associated proteins,MAPs)组成,其中
微管蛋白在真核生物中有多种类型,而 α-、β-微管
蛋白形成的异源二聚体,是微管的基本单位[4]。
α-、β-微管蛋白处于一个聚合 /解聚的动态过程,多
种以微管蛋白为靶标的药物都是同微管蛋白结合
后抑制了微管的动态过程而发挥药理作用[5]。 目
前已开发出以微管蛋白为靶的抗肿瘤药物筛选模
型[6],但丝状真菌的微管蛋白还没有在离体条件
下用作杀菌剂创制及筛选的靶标。 这是因为微管
蛋白在丝状真菌细胞中的含量很低,直接制备有很
大困难[7]。 过表达的方法尽管可以制备到毫克级
的微管蛋白[8],但因其步骤繁琐以及易受微管辅
助蛋白的污染等原因不宜于微管蛋白的大量制
备[7, 9],而且从生物组织中直接提取的微管蛋白是
α / β-微管蛋白的二聚体或多聚体,无法对 α-、β-微
管蛋白的单一亚型进行分析。 采用原核表达的方
法制备微管蛋白,不仅“污染源”少,而且省时、省
力,可在短时间内得到大量的微管蛋白,故原核表
达是制备丝状真菌微管蛋白常用的方法[7, 9, 10]。
小麦赤霉病菌 β-微管蛋白已在大肠杆菌中得到表
达及纯化[11],本文研究了小麦赤霉病菌 α-微管蛋
白的原核表达,对包涵体透析后进行了融合蛋白的
纯化,制备了纯度较高、浓度较大的 α-微管蛋白。
本文的工作为离体条件下根据 α-、β-微管蛋白的
聚合反应筛选新型杀菌剂提供基础。
1　 材料与方法
1. 1　 试验材料
本研究所用菌株为禾谷镰孢菌野生菌株
2021,对多菌灵敏感;克隆菌株 Escherichia coli
DH5α、表达菌株 E. coli Rossatta(DE3) pLysS,质
粒 pET30a +均为本实验室保存。
1. 2　 引物设计与合成
依据哈佛-麻省理工 Broad 研究所 ( http: / /
www. broadinstitute. org / )公布的禾谷镰孢菌 α1 -、
α2 -微管蛋白基因序列(分别为 FGSG_00639. 3 和
FGSG_00397. 3)以及 pET30a +上的酶切位点设计
引物。 以下 2 对引物分别扩增禾谷镰孢菌 α1 -、α2 -
微管蛋白基因。
α1 -30F: 5′-GCACATATGCGTGAGGTCATT-
AG-3′(下划线为 NdeⅠ酶切位点,包括 CAT和 α1 -
微管蛋白基因的起始密码子 ATG);
α1-30R: 5′-GTAGAATTCCCGTACTCAGCCT-
CCAA-3′(下划线为 EcoRⅠ酶切位点,其中甘氨酸
反密码子 CCC在 PCR 扩增时将终止密码子 TAA
替换掉);
α2 -30F: 5′-CGCGGATCCATGAAGGGCGAG-
ATTC-3′(下划线为 BamHⅠ酶切位点);
α2 -30R: 5′-CATGCGGCCGCCTAGTACTCG-
AGTTCCT-3′(下划线为 NotⅠ酶切位点,前端为终
止密码子)。
引物由上海生工合成,采用 PAGE 方法进行
纯化。
1. 3　 表达前的分析
根据 pET30a +上的碱基序列及酶切位点,结
合 α1 -、α2 -微管蛋白基因序列,分析表达后的融合
蛋白碱基及氨基酸组成。 分别在网站上提交 α1-、
α2-微管蛋白及各自融合蛋白的氨基酸序列组成
后,在 http: / / cn. expasy. org / tools / pi_tool. html 根
据各种氨基酸的分子量及比例预测 α-微管蛋白及
融合蛋白的分子量[12]。 在 http: / / www. doe-mbi.
ucla. edu / ~ sumchan / caltor. html和 http: / / nihserv-
er. mbi. ucla. edu / RACC /对 α-微管蛋白基因在大
肠杆菌表达时的稀有密码子进行预测,根据稀有密
码子的多寡、连续性及距离 mRNA 5′的位置来判
断 α-微管蛋白基因在大肠杆菌中能否成功表达及
表达效率的高低:稀有密码子过多或有 3 个以上的
稀有密码子串联或稀有密码子在 mRNA 5′端附
近,说明融合蛋白在大肠杆菌里翻译可能会提前中
断,不能成功表达,即使表达了,效率也可能较低;
稀有密码子越少或分散在整个基因序列中,距离
mRNA 5′端较远,则融合蛋白完整表达的可能性就
增大,表达效率可能会很高;其中以精氨酸密码子
(CGA、CGG、AGG、AGA)、亮氨酸密码子(CUA)、
异亮氨酸密码子(AUA)、缬氨酸密码子(ACG)、
脯氨酸密码子(ACG)对翻译的影响最大,若精氨
酸密码子有 2 个或 3 个以上的重复,就会大大增加
翻译提前中止发生的机率[13]。 在 http: / / www.
352
　
植物病理学报 42 卷
biotech. ou. edu /预测 α-微管蛋白及融合蛋白在大
肠杆菌表达时的可溶性机率,根据机率值的大小判
断融合蛋白可溶性表达的概率:机率值大,则融合
蛋白可溶性表达的概率高;反之,形成包涵体的可
能性增大。
1. 4 　 RNA 的提取、RT-PCR 及 α-微管蛋白基因
扩增
Trizol法从新鲜赤霉菌菌丝中提取总 RNA,按
Invitrogen公司 M-MLV Reverse Transcriptase 逆转
录酶使用说明书逆转录合成单链 cDNA,并以 cD-
NA为模板扩增 α1 -、α2 -微管蛋白基因。
1. 5　 原核表达载体构建
将克隆的 α1 -和 α2 -微管蛋白基因经切胶纯化
后,克隆至 pMD 19-T Vector,并转化大肠杆菌
DH5α感受态细胞,经菌落 PCR 及双酶切鉴定后,
将筛选到的阳性克隆菌株送至上海生工测序。
对测序正确的 α1 -重组质粒和 pET30a +分别
进行 Nde Ⅰ、 EcoR Ⅰ 单酶切; α2 -重组质粒和
pET30a +分别进行 BamHⅠ、NotⅠ单酶切,胶回收
纯化后在 T4 DNA连接酶作用下 16℃进行过夜连
接,并转化至 DH5α感受态细胞,经菌落 PCR及双
酶切验证后筛选阳性克隆,构建重组质粒 pET30a-
(α1 -tubulin)、pET30a-(α2 -tubulin)。
1. 6　 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
将重组质粒转化至 E. coli Rossatta (DE3)
pLysS,筛选含重组质粒的转化子,进行 α-微管蛋
白的诱导表达。
挑取阳性克隆,接种于 5 mL含 50 μg / mL卡那
霉素的 LB 培养液里进行过夜摇床培养,次日按
1∶ 20 转接至 100 mL LB 培养液中,37℃摇床培养
至 OD600达到 0. 6 ~ 0. 8 时,加入异丙基-β-D-硫代
半乳糖苷( Isopropyl 1-Thio-β-D-galactopyranoside,
IPTG)至终浓度 1 mmol / L,继续摇培 4 ~ 6 h。 以
转入空载体的宿主菌及不加入诱导物的阳性克隆
菌株作为对照。
摇培结束后,分别从对照及处理中取出 2 mL,
12 000 r / min离心 5 min后收集菌体沉淀,加入1 ×
上样缓冲液,煮沸后留作电泳用。 余下部分以
8 000 r / min离心 10 min,收集菌体沉淀。 将菌体
沉淀重悬于裂解缓冲液(50 mmol / L Tris-HCl,5
mmol / L EDTA,100 mmol / L NaCl,1 mg / mL 溶菌
酶,5%甘油,1%Triton X-100)中,在冰浴下进行超
声破碎,结束后 12 000 r / min 离心 20 min,收集上
清,沉淀部分溶解在含 8 mol / L 尿素的 Binding
buffer 中(500 mmol / L NaCl, 20 mmol / L Na3PO4
·12H2O,20 mmol / L 咪唑,pH 8. 0)。 分别从上清
和溶解的沉淀中取 80 μL,加入 5 ×的上样缓冲液
后进行 SDS-PAGE,分析融合蛋白的表达形式。
1. 7　 融合蛋白的Western blot鉴定
SDS-PAGE电泳后,用湿转法将胶上的蛋白转
印至 PVDF 膜上,在含 5% 脱脂奶粉的 PBST 中
4℃封闭过夜,以鼠抗 His标签单抗为第一抗体,室
温结合 1 h,TBST 洗 3 次,每次 10 min,再加入碱
性磷酸酶标记的羊抗鼠 IgG,室温结合 1 h,TBST
洗 3 次,每次 10 min,用 NBT 和 BCIP 对表达产物
进行显色鉴定。
1. 8　 融合蛋白的透析复性及亲和纯化
参考 Chow等的方法[14]对融合蛋白包涵体复
性,过程如下:诱导 1 L阳性表达菌液,制备菌体沉
淀;超声波破碎后离心收集沉淀,依次用含有 2、3
mol / L尿素的包涵体洗涤缓冲液(50 mmol / L Tris-
HCl, 5 mmol / L EDTA, 100 mmol / L NaCl, 1%
Triton X-100)对沉淀进行洗涤,最终用含 8 mol / L
尿素的 Binding buffer ( 20 mmol / L Na3PO4 ·
12H2O, 0. 5 mol / L NaCl, 20 mmol / L 咪唑, pH
7． 4)充分溶解,离心后取上清,并进行蛋白浓度确
定,使蛋白浓度在 1 mg / mL左右;用含梯度浓度尿
素(6、5、4、3、2、1、0. 5 及 0 mol / L)的 Binding buff-
er(pH8. 0)对上清液进行透析,最终透析至无尿素
的 Binding buffer中。
采用 HisTrapTM HP Columns(GE Healthcare公
司)纯化,具体步骤参照 GE 公司 HisTrap HP 1 mL
使用说明书。 对菌体破碎后、包涵体溶解后、透析
后以及纯化后的蛋白液各自取样进行 SDS-PAGE
分析,并在 BIO-RAD 凝胶成像分析仪上拍照,根
据凝胶分析软件 Quantity One 4. 4. 1 的灰度分析
功能,以牛血清白蛋白 BSA 1. 0 mg / mL 作为标准
品,对蛋白浓度及纯度进行测定。
452
　
　 3 期 　 　 徐建强,等:小麦赤霉病菌 α-微管蛋白原核表达及纯化研究
2　 结果与分析
2. 1　 α-微管蛋白原核表达前的分析
表达出的 α-微管蛋白融合蛋白结构如图 1 所
示。 α1 -微管蛋白仅在 C端有少量多余的氨基酸残
基(共 20 个氨基酸),其中含有 6 个组氨酸(His-
tag);尽管 α2 -微管蛋白 N 端有较多的多余氨基酸
残基,但可以通过 α2 -微管蛋白 N端前的肠激酶识
别位点(Enterokinase RS),利用肠激酶将 N端的多
余氨基酸去除。
Fig. 1 　 α-tubulin fusion protein composition
diagram
Thrombin RS: Thrombin target site; Enterokinase RS: Enter-
okinase target site.
　 　 由表 1 可以看出,尽管稀有密码子数量在 α1 -、
α2 -微管蛋白中都较多,但精氨酸的稀有密码子
(CGA)数目较少,没有发生 2 个或 3 个的串联,而
是分散在整个基因序列中,精氨酸第一个稀有密码
子 CGA的位置离 mRNA 5′端较远,这些都表明了
α1 -、α2 -微管蛋白在大肠杆菌里表达时翻译出完整
融合蛋白的可能性大,不会发生翻译提前中止的现
象,且表达效率也可能很高。
由表 2 可以看出,融合蛋白较 α1 -微管蛋白分
子量仅增加了约 2 kD,较 α2 -微管蛋白增加了约
5． 4 kD;α1 -微管蛋白在大肠杆菌表达时的可溶性
几率较 α2 -微管蛋白大,表达出的融合蛋白可能存
在于上清液中,可以直接进行纯化,而 α2 -微管蛋
白融合蛋白的存在状态(包涵体或上清中)不能
确定。
2. 2　 融合蛋白表达效率及存在形式
如图 2 所示,在诱导后的沉淀中均有大量的融
合蛋白出现,分子量在 45. 0 ~ 66. 2 kD 之间(图
2),均为预期的融合蛋白,说明 α1 -、α2 -微管蛋白在
大肠杆菌里表达时没有发生翻译提前中止的现象,
稀有密码子对翻译的影响有限,这些结果同原核表
达前的分析一致。融合蛋白都是以包涵体形式存
Table 1　 Analysis of rare codons of specific amino acids on α-tubulin
fusion protein when expressed in Escherichia coli
Amino acid Rare codon α1 -tubulin fusion protein α2 -tubulin fusion protein
Arg
CGA 6 11
CGG 0 0
AGG 0 0
AGA 0 0
Occurring
at codons
64, 215, 221,
243, 264, 339
86, 115, 130, 172, 227, 272,
294, 315, 359, 428, 477
Leu CUA 1 1
Ile AUA 0 0
Thr ACG 0 0
Pro CCC 12 16
Total number 19 28
552
　
植物病理学报 42 卷
Table 2　 Molecular weight and soluble probability of α-tubulin and their
fusion protein predicted when expressed in Escherichia coli
α-tubulin and their fusion protein Molecular weight / kD Soluble probability / %
α1 -tubulin 49. 97 -
α1 -tubulin fusion protein 52. 1 62. 7
α2 -tubulin 50. 48 -
α2 -tubulin fusion protein 55. 9 57. 0
在于沉淀中(图 2),而上清中融合蛋白的量都很少
(图 2),不足以达到进行纯化的要求,故两种融合
蛋白都只能从包涵体中进行纯化。
Fig. 2 　 Expression efficiency of α-tubulin
fusion protein
M: Unstained protein molecular weight marker; Line 1 and
lane 2: The samples of supernatant and precipitation respec-
tively of α1 -tubulin; Line 3 and lane 4: α2 -tubulin.
2. 3　 融合蛋白的Western blot验证
由图 3 可以看出,融合蛋白均具有 6 × His 的
抗原特性,进一步证实了 α-微管蛋白成功的得到
表达。 融合蛋白大部分都以包涵体形式存在于沉
淀中,但 α1 -微管蛋白融合蛋白在上清中仍占有一
定比例(图 3),而 α2 -微管蛋白融合蛋白上清中量
很少(图 3),说明 α1 -微管蛋白融合蛋白在大肠杆
菌里表达时有部分蛋白以可溶性形式出现,这同表
达前的分析一致。 对于 α1 -微管蛋白融合蛋白,可
以通过优化诱导表达条件增加上清中的蛋白即可
溶性蛋白的量,直接从上清中进行蛋白纯化;而对
于 α2 -微管蛋白融合蛋白,只能通过包涵体透析复
性的方法来进行纯化。
2. 4　 融合蛋白包涵体的尿素洗涤
用低浓度的尿素对包涵体进行洗涤,在去除杂
蛋白的同时尽管可以去除一些目的蛋白(图 4),但
对于提高包涵体中目的蛋白的纯度有很大的促进
作用:洗涤后的包涵体中杂蛋白已经很少(图 4),
便于后续的透析复性及蛋白纯化,说明包涵体洗涤
有利于提高融合蛋白的纯度。
2. 5　 融合蛋白的透析复性及纯化
经过尿素梯度浓度透析后,变性的 α-微管蛋
白溶解在不含尿素的缓冲液中(图 5),说明 α1 -、
α2 -微管蛋白均已成功复性,但 α2 -微管蛋白的复性
效果比 α1 -微管蛋白复性效果好,α1 -微管蛋白在透
析过程中析出了少量沉淀,导致复性率降低。 灰度
分析表明:纯化后 α1 -和 α2 -微管蛋白融合蛋白浓
度均达到了 2 mg / mL以上,其纯度达到 90%左右
(图 5),可用于后续的研究工作。
3　 结论与讨论
本文首次在大肠杆菌中表达了小麦赤霉病菌
的 α-微管蛋白,包涵体透析复性后采用亲和层析
的方法对融合蛋白进行了纯化,从而制备了毫克
级、纯度较高的 α-微管蛋白。
真核生物基因在大肠杆菌里表达时,表达前的
分析非常重要。 分析内容主要包括真核基因的密
码子偏好、GC含量、重复序列、mRNA 二级结构及
稳定性、可变剪接点、Poly(A) sites、有无信号肽以
及可溶性机率等[15] ,这些因素决定了基因在原核
652
　
　 3 期 　 　 徐建强,等:小麦赤霉病菌 α-微管蛋白原核表达及纯化研究
Fig. 3　 Western blot detection of α-tubulin fusion protein
M: Prestained protein molecular weight marker; Line 1: the sample of total protein of Rossatta (DE3) pLysS (pET30a + )
after induced; Line 2 to lane 5: α1 -tubulin fusion protein samples, line 2 and lane 3 were the samples of total protein
without and with IPTG induction, Line 4 and lane 5 were the samples of supernatant and precipitation respectively;
Line 6 to lane 9: α2 -tubulin fusion protein.
Fig. 4　 Inclusion bodies washing of α-tubulin fusion protein
M: Unstained protein molecular weight marker. Lines from 1 to 4: α1 -tubulin fusion protein; Line 1 was the sample of
α1 -tubulin supernatant; Line 2 to 3 were the samples of α1 -tubulin inclusion bodies washing fluids after dissolving
with buffer containing 2 and 3 mol / L urea respectively; Line 4 was the sample of α1 -tubulin inclusion bodies
dissolving fluids with buffer containing 8 mol / L urea. Line 5 to lane 8: α2 -tubulin inclusion bodies.
Fig. 5　 Dialysis and purification of α-tubulin fusion protein
M: Unstained protein molecular weight marker; Lines from 1 to 4: the samples of α1 -tubulin fusion protein, line 1 and lane 2
were the samples of supernatant and precipitation respectively; Line 3 and lane 4 were the samples after dialysis and purification
respectively; Line 5 to lane 8: α2 -tubulin fusion protein; Line 9: 1. 0 mg / mL bovine serum albumin (BSA) .
752
　
植物病理学报 42 卷
表达时的效率及存在状态,其中以稀有密码子的分
析及可溶性机率的预测最为重要。 这是由于真核
细胞偏爱的密码子和原核细胞有所不同,在用原核
系统表达真核基因的时候,真核基因中的一些密码
子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致
不能成功表达或表达效率很低。 原核表达前对真
核基因进行稀有密码子分析,可以为以后宿主菌的
选择上提供参考。 例如为避免稀有密码子对真核
基因在大肠杆菌里表达时产生影响,可以选择能提
供稀有密码子 tRNAs 的宿主菌,如 Merck 公司的
Rossetta(DE3)pLysS,本文利用此菌株成功地对 α-
微管蛋白进行了原核表达。 尽管对可溶性机率的
预测还存在一定的误差,如本文中对 α1 -微管蛋白
的预测,SDS-PAGE 和 Western Blot 分析结果不一
致,但对以后融合蛋白纯化方法提供了必要的参
考。
外源基因在大肠杆菌里表达时,在表达载体强
启动子作用下,表达量一般都很大,往往以包涵体
形式出现。 包涵体的形成是外源基因在大肠杆菌
中表达成功的一个重要标志,但也同时意味着融合
蛋白没有正确折叠,生物学活性丧失,必须通过对
包涵体里的变性蛋白复性至可溶性状态才可以使
融合蛋白恢复到正确的三维空间结构。 本文采用
透析复性的方法使表达出的 α-微管蛋白成功复
性,且复性率较高。 除透析复性外,还可以采用柱
复性或稀释复性等[10, 16, 17],但无论采用哪种方法,
复性率是必须考虑的一个指标:如果复性过程中出
现大量的絮状沉淀,则说明复性失败。
通过融合分子量大、亲水性强的标签蛋白(如
麦 芽 糖 结 合 蛋 白, Maltose Binding Protein,
MBP) [7],或在低温条件下进行诱导[9],微管蛋白
在大肠杆菌中也可以以可溶性形式得到表达,但可
溶性蛋白的量较低,给后续的纯化步骤带来很多困
难,不适宜微管蛋白的大量制备。 本研究中,α1 -微
管蛋白尽管有一定量可溶性蛋白的出现,但量较
少,从上清中纯化 α1 -微管蛋白得到的可溶性蛋白
量很少,杂蛋白条带很多;扩大诱导体积、增加上清
液过柱量仍未能制备到纯度较高、量较大的 α1 -微
管蛋白,且对纯化柱的损伤严重。 总之,从上清中
纯化可溶性的 α1 -微管蛋白不够经济。 相比之下,
采用包涵体洗涤及透析复性等方法,可以从较少的
诱导体积中纯化到较大量的 α1 -微管蛋白。 故本
文对 α1 -、α2 -微管蛋白,均采用包涵体透析复性的
方法进行制备。
禾谷镰孢菌 β-微管蛋白在大肠杆菌中表达出
的融合蛋白,N 端增加的氨基酸残基较多,分子量
增加了约 17. 3 kD,包括硫氧还蛋白、肠激酶和凝
血酶识别位点、His-tag 及 S-tag 序列等[11]。 利用
肠激酶对融合蛋白 N端多余氨基酸残基进行切割
并未取得成功(未发表资料),这种情况在粗糙脉
孢菌 β-微管蛋白的标签蛋白切割中也曾出现,有
可能是由于肠激酶的识别位点位于融合蛋白内部
所致[9]。 为了避免融合蛋白上过多的氨基酸残基
对 α / β-微管蛋白体外聚合的影响,β-微管蛋白基
因已被克隆到 pET30a +载体上,构建出仅 C 端含
有 His-tag的 β-微管蛋白融合蛋白(未发表资料)。
本研究获得的 α1 -、α2 -微管蛋白融合蛋白,其 C 端
或 N 端的多余氨基酸残基较少,不会影响到
α / β-微管蛋白的聚合[10, 18],可直接用于体外聚合
试验。
微管蛋白不像酶可通过活性测定来监测试验
操作过程对蛋白活性的影响。 透析复性可使 α-微
管蛋白以可溶性形式溶解于缓冲液中,但对其活性
仍无法检测,透析后的融合蛋白可溶并不能断定蛋
白活性高。 采用抗 His 标签的单克隆抗体进行
Western Blot也无法全面评估融合蛋白的空间结
构及生物活性,需要进一步通过微管蛋白聚合试验
来判断纯化的 α-微管蛋白的活性,为进行药剂筛
选做准备。
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责任编辑:曾晓葳
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