全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(４): ３６３￣３６９(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０４￣０８ꎻ 修回日期: ２０１４￣０４￣２０
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项:蔬菜黄化曲叶病毒病综合防控技术研究与示范(２０１００３０６５)
通讯作者: 曹永松ꎬ教授ꎬ主要从事植物化学保护研究ꎻ Ｔｅｌ:０１０￣６２７３４３０２ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｓｏｎｇｃａｏ＠１６３.ｃｏｍ
第一作者: 朱云聪ꎬ男ꎬ云南玉溪人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病毒病化学防治研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｊｂｓｅｑｕａｔｉｏｎ＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０４.００４
基于 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ监测番茄黄化曲叶病毒
在番茄植株中的动态变化
朱云聪ꎬ 邓宇芳ꎬ 何 顺ꎬ 罗来鑫ꎬ 曹永松∗
(中国农业大学农学与生物技术学院ꎬ 北京 １００１９３)
摘要:本研究根据番茄黄化曲叶病毒(Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓꎬ ＴＹＬＣＶ)分离物￣ＳＨ２基因组序列ꎬ设计了一对引物ꎬ以
番茄 ２５Ｓ ｒＲＮＡ基因为内参ꎬ建立了番茄黄化曲叶病毒 ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ实时荧光定量 ＰＣＲ检测方法ꎮ 该方法可检测到浓度
为 ４.６４×１０－７ ｎｇ / μＬ的植物 ＤＮＡ中含有 ＴＹＬＣＶꎬ其灵敏度是常规 ＰＣＲ的 １ ０００倍ꎮ 利用该方法ꎬ研究了温室条件下以侵
染性克隆接种 ＴＹＬＣＶ后的番茄植株中病毒 ＤＮＡ含量的变化情况ꎮ 根、茎、叶中病毒 ＤＮＡ定量检测结果表明ꎬＴＹＬＣＶ在
３种植物器官中都呈现一个上升、稳定和下降的变化规律ꎻ病毒 ＤＮＡ 在植株根部最早累积ꎬ累积的速度较慢ꎬ在叶部和茎
部累积较快ꎻ叶部和茎部接种 １８ ｄ后病毒 ＤＮＡ含量达到稳定期ꎻ在不同的器官中ꎬ病毒的含量不同ꎬ在茎部的含量最高ꎬ接
种 ３３ ｄ后茎部病毒 ＤＮＡ的含量约为根部的 １００倍ꎮ 本研究通过对 ＴＹＬＣＶ含量的动态监测ꎬ明确了病毒 ＤＮＡ 在番茄植
株中的累积和变化规律ꎬ为研究 ＴＹＬＣＶ侵染机制、病毒与寄主互作及病害防治提供了理论依据ꎮ
关键词:番茄黄花曲叶病毒ꎻ 实时荧光 ＰＣＲꎻ ＤＮＡ含量ꎻ 累积
Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｐｌａｎｔ ｂｙ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ
Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ　 ＺＨＵ Ｙｕｎ￣ｃｏｎｇꎬ ＤＥＮＧ Ｙｕ￣ｆａｎｇꎬ ＨＥ Ｓｈｕｎꎬ ＬＵＯ Ｌａｉ￣ｘｉｎꎬ ＣＡＯ Ｙｏｎｇ￣ｓｏｎｇ
(Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠＲｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ (ＴＹＬ￣
ＣＶ) ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ２５Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａ ｐａｉｒ ｏｆ
ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ＴＹＬＣＶ. Ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｄ １ ０００￣ｆｏｌｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｏｒｅ
ｔｈａｎ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ. Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＹＬＣＶ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＹＬＣＶ ＤＮＡ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄꎬ ｔｈｅｎ ｋｅｐｔ
ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ. Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｆａｓｔ ａｔ １８ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｆｉｒｓｔ ｉｎ ｒｏｏｔｓꎬ ｔｈｅｎ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ. Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｏｆ
ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｗａｓ ｉｎ ｓｔｅｍｓꎬ ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ １００ ｔｉｍｅｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ａｔ ３３ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｗｏｕｌｄ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＹＬＣＶ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏꎬ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅｏｒｙ
ｂａｓｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓꎻ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲꎻ ＤＮＡ ｑｕａｎｔｉｔｙꎻ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２.４１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０４￣０３６３￣０７
　 　 番茄黄化曲叶病毒(Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉ￣
ｒｕｓꎬＴＹＬＣＶ)是全球热带和亚热带地区危害番茄
种植最严重的病毒之一ꎬ病害严重时造成绝产ꎬ成
为许多番茄种植地区产量的限制因素[１]ꎮ ＴＹＬＣＶ
属于双生病毒科(Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ)菜豆金色花叶病
毒属(Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ)ꎬ自然条件下依靠烟粉虱(Ｂｅ￣
　
植物病理学报 ４４卷
ｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ)传播[２~３]ꎮ 其基因组为 １ 条单链环状
ＤＮＡ(ｓｓＤＮＡ)ꎬ链长大约为 ２.８ ｋｂ[４]ꎮ 病毒在寄
主体内分布不均匀ꎬ受到来自病毒自身、寄主和环
境等诸多因素的影响ꎬ有的病毒只局限在寄主特定
的组织内分布ꎬ如大麦黄矮病毒仅发现分布于植物
的韧皮部、薄壁细胞、伴胞及筛管细胞[５]ꎮ 病毒基
因在寄主体内的表达ꎬ能反映病毒侵染、增殖和移
动的过程ꎮ Ｍｏｒｉｌｌａ等[６]利用原位杂交的方法研究
了撒丁番茄黄化曲叶病毒(Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ
Ｓａｒｄｉｎｉａ ｖｉｒｕｓꎬ ＴＹＬＣＳＶ)和 ＴＹＬＣＶ 在寄主中核
酸的含量和分布ꎬ发现病毒核酸占寄主核酸的
１􀆰 ４％ꎬ无论是 ２种病毒复合侵染还是单一侵染ꎬ病
毒的 ＤＮＡ 都被限制在寄主的韧皮部ꎮ Ｃｚｏｓｎｅｋ
等[７]用同位素标记的分子探针和病毒 ＤＮＡ 分子
进行杂交ꎬ发现病毒 ＤＮＡ 在植株茎尖的浓度最
高ꎬ根部和茎部次之ꎬ在舒展的叶片中最少ꎬ在不发
生细胞分裂的组织中没有检测到病毒ꎮ Ｂｅｒ 等[８]
也利用探针杂交的方法ꎬ研究了 ＴＹＬＣＶ ＤＮＡ 在
侵染的番茄植株中的累积ꎬ发现病毒 ＤＮＡ 在生长
迅速的植物组织(茎尖ꎬ嫩叶ꎬ根)和茎秆中浓度最
高ꎬ接种 ７ ｄ后能检测到病毒 ＤＮＡꎬ１５ ｄ 番茄表现
出黄化症状ꎮ
ＴＹＬＣＶ的检测方法有血清学法、分子杂交法
和 ＰＣＲ检测法ꎬ不同的检测方法其应用范围和可
靠性存在差异[９]ꎮ 实时荧光定量 ＰＣＲ(Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ＰＣＲ)在反应体系中引入荧光分子ꎬ通过荧光信号
的增加来反映 ＤＮＡ 量的增加ꎬ实时监测 ＰＣＲ 产
物ꎬ能够准确确定初始模板拷贝数ꎬ具有动态范围
宽以及灵敏度高的优点[１０]ꎮ Ｇｈａｒｓａｌｌａｈ 等[１１]通过
ＴａｑＭａｎ􀅺法建立了 ＴＹＬＣＳＶ 的 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 检
测体系ꎬ用于番茄、辣椒和菜豆中 ＴＹＬＣＳＶ 的快速
检测ꎮ Ｇｉｏｖａｎｎａ 等[１２]利用 ＴａｑＭａｎ 探针实现了番
茄植株和烟粉虱体内 ＴＹＬＣＳＶ 的 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
检测ꎮ 对番茄植株中 ＴＹＬＣＳＶ进行绝对定量检测
发现ꎬ病毒接种 ８ 周后ꎬ番茄嫩叶中的病毒含量达
到１ ０７３ ~ ２ １３５ ＧＵ / ｔｏｍａｔｏ ＧＵ ( ＧＵꎬ ｇｅｎｏｍｉｃ
ｕｎｉｔｓ)ꎮ Ｐａｐａｙｉａｎｎｉｓ 等[１３]利用多重 ＴａｑＭａｎ 探针
开发了同时检测 ＴＹＬＣＶ 和 ＴＹＬＣＳＶ 的 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ＰＣＲ方法ꎬ灵敏度是常规 ＰＣＲ 检测的 １ ０００ 倍ꎮ
对病毒含量进行研究ꎬ能够揭示病毒的侵染过程ꎬ
病害的发生和发展趋势ꎬ寄主症状表现与病毒增殖
之间的关系等ꎮ 本研究建立了 ＴＹＬＣＶ 的 ＳＹＢＲ
ＧｒｅｅｎⅠＲｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测方法ꎬ用于监测温室条
件下番茄植株中病毒 ＤＮＡ 随时间的变化ꎬ为进一
步探索 ＴＹＬＣＶ 的侵染机制和评价植物病毒病的
防治效果提供了依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 病毒毒源及植物材料
番茄黄化曲叶病毒毒株侵染性克隆 ＳＨ２[１４]ꎬ
由中国农业科学院蔬菜花卉研究所谢丙炎研究员
提供ꎮ 供试番茄为北京樱桃番茄ꎬ购自北京中品开
元种子有限公司ꎮ
１.２　 病毒接种
将病毒侵染性克隆接种在 １００ ｍＬ 含卡那霉
素(Ｋａｎａｍｙｃｉｎꎬ ５０ μｇ / ｍＬ)和利福平(Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎꎬ
５０ μｇ / ｍＬ)的 ＹＥＢ液体培养基中ꎬ２８℃条件下 １２０
ｒｐｍ振荡培养 ４８ ｈꎬ菌浓度约为 １.８ ×１０８ ｃｆｕ / ｍＬ
时ꎬ取 １ ｍＬ 一次性无菌注射器吸取培养的菌液ꎬ
在供试番茄幼苗地上部 １ ~ ２ ｃｍ 茎杆处取 ３ 点进
行韧皮部注射接种ꎬ每点注射 １５０~２００ μＬꎬ接种番
茄置于防虫温室ꎬ自然光照条件下 ２５ ~ ３０℃下培
养[１５]ꎮ
１.３　 主要仪器设备及试剂
实验仪器:７５００ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ (美国
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)ꎬＭｙ ＣｙｃｌｅｒＴＭ 梯度 ＰＣＲ 仪
( Ｂｉｏ￣ＲＡＤ )ꎬ Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２ ０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ
(Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ꎮ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ试剂:ＳＹＢＲ􀅺
Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒＴＭ试剂盒ꎬ购自 ＴａＲａＫａ(大连)
公司ꎮ 常规 ＰＣＲ 试剂ꎬ购自北京博迈德科技有限
公司ꎮ
１.４　 引物设计
用于检测的特异性引物根据 ＴＹＬＣＶ 全序列
(ＧｅｎＢａｎｋ ＮＯ.: ＡＭ２８２８７４)ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ
５.０ 软件设计得到ꎬ扩增片段位于 ＴＹＬＣＶ 全序列
的 １ ４６２￣１ ６０１ 位ꎻ内参基因参照 Ｍａｓｏｎ 等[１２]ꎬ为
番茄的 ２５Ｓ核糖体 ＲＮＡ内源基因(ＧｅｎＢａｎｋ ＮＯ.:
Ｘ１３５５７)ꎬ引物由北京博迈德科技有限公司合成ꎬ
引物合成后进行特异性分析ꎮ 引物参数如表 １ 所
示ꎮ
４６３
　
　 ４期 　 　 朱云聪ꎬ等:基于 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ监测番茄黄化曲叶病毒在番茄植株中的动态变化
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′) Ｔｍ ｖａｌｕｅ / ℃ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ / ｂｐ
ＴＹＬＣＶ
ＹＧ￣３ ＧＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＡＡ ５９.７ １３９
ＹＧ￣５ ＣＴＧＴＴＣＧＣＡＡＧＴＡＴＣＡＡＴＣＡＡＧＧＴ ５８.５
Ｔｏｍａｔｏ ２５Ｓ ｒＲＮＡ
ＵＮＩＶ(＋) ＡＴＡＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡ ５７.８ １１３
ＵＮＩＶ( ￣) ＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴ ５５.７
１.５　 ＴＹＬＣＶ常规 ＰＣＲ检测
侵染性克隆接种 ３０ ｄ 后ꎬ取番茄叶片ꎬ２％
ＣＴＡＢ 法提取样品总 ＤＮＡ[１６]ꎬ常规 ＰＣＲ 检测
ＴＹＬＣＶꎬ取样 ３ 组ꎬ每组 １２ 个样ꎮ ＰＣＲ 引物为:
ＴＹＪＵ￣Ｆ ５′￣ＴＡＡＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＧＧＡＡ￣
ＴＡＣＡＣＧＡＣＧＴＴＣ￣３′ꎬ ＴＹＪＵ￣Ｒ ５′￣ＴＡＴＡＡＴＣＣＡＴ￣
ＧＧＡＧＡＣＣＣＡＴＡＡＧＴＡＴＴＧＴＣＡＴＴＧ ＡＧＧＧＴＧＡ￣
３′[１７]ꎮ 扩增程序:９５℃ １０ ｍｉｎꎻ９５℃ ３０ ｓꎬ６２℃ ４０
ｓꎬ７２℃ １ ｍｉｎꎬ３５个循环ꎬ７２℃ １０ ｍｉｎꎬ１０℃ 保持ꎮ
１.６　 ＴＹＬＣＶ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测
经上述 ＴＹＪＵ￣Ｆ / ＴＹＪＵ￣Ｒ 引物 ＰＣＲ 检测呈阳
性的 ＤＮＡ 样品ꎬ用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ 分光光度法测定
ＤＮＡ浓度ꎬ１０倍梯度稀释ꎬ以稀释的 ＤＮＡ 样品为
模板ꎬ以 ＹＧ￣３ꎬＹＧ￣５ 为引物ꎬ分别进行常规 ＰＣＲ
检测和 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 检测ꎬ比较 ２ 者的灵敏度ꎮ
Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 检测ꎬ每个样品设 ３ 个重复ꎬ以
ＤＮＡ浓度对数为横坐标ꎬＣｔ 值为纵坐标ꎬ作图得
到标准曲线ꎮ 扩增效率 ＝ ( Ｅ － １) × １００％ꎬ Ｅ ＝
１０－１ / ｓｌｏｐꎬ(ｓｌｏｐ为标准曲线斜率)ꎬ比较目的基因和
内参基因的扩增效率ꎮ
Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 扩增程序:５２℃ ２ ｍｉｎꎻ９５℃ １
ｍｉｎꎻ ９５℃ ５ ｓꎬ６０℃ ３０ ｓꎬ７２℃ ３４ ｓ(收集荧光信
号)ꎬ４０个循环ꎬ溶解曲线程序:９５℃ １５ ｓꎬ６０℃ １
ｍｉｎꎬ９５℃ ３０ ｓ(收集荧光信号)ꎻ６０℃ １５ ｓꎬ反应体
系组成:ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒ (２ ×) １０ μＬꎬ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅⅡ ０.４ μＬꎬ正、反向引物各 ０.６ μＬꎬ
ｄｄＨ２Ｏ ７.４ μＬꎬＤＮＡ模板 １ μＬꎬ总体积 ２０ μＬꎮ
１.７　 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 监测 ＴＹＬＣＶ 在番茄植株体
内的变化
接种病毒后每 ３ ｄ取样 １ 次ꎬ持续到第 ４２ 天ꎬ
每次随机选 ３株番茄ꎬ取叶(倒 ２ 叶ꎬ顶端往下第 ２
片叶)、茎(上中下 ３个部位)、根混合并称量 ０.１ ｇꎬ
提取总 ＤＮＡꎬ方法同 １.５ꎮ 测定 ＤＮＡ浓度ꎬ稀释至
１.０ ~ １０ ｎｇ / μＬ 之间ꎬ用本文构建的方法测定病毒
ＤＮＡ的含量ꎬ未接种病毒的番茄为空白对照ꎮ 病
毒 ＤＮＡ 相对含量用 ΔΔＣｔ 法计算ꎬ相对含量 ＝
２－ΔΔＣｔꎮ 取样检测设 ３次重复ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＴＹＬＣＶ常规 ＰＣＲ检测
病毒接种 ２５ ｄ 后ꎬ番茄植株叶片卷曲、皱缩ꎬ
生长缓慢ꎬ以 ＴＹＪＵ￣Ｆ / ＴＹＪＵ￣Ｒ为引物 ＰＣＲ检测结
果显示均为阳性ꎬ表明植株感染 ＴＹＬＣＶ 的发病率
达到 １００％ꎮ
Ｆｉｇ. １　 ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＹＬＣＶ
Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ Ⅱꎻ Ｌａｎｅ １: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ
Ｌａｎｅ ３￣１４: Ｓａｍｐｌｅｓꎻ ｔｈｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｓ ８５６ ｂｐ.
５６３
　
植物病理学报 ４４卷
２.２　 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ引物特异性分析
Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ产物溶解曲线表明ꎬ目的基因
和内参基因的溶解曲线均为单峰ꎬ无引物二聚体生
成和非特异性扩增(图 ２)ꎮ 阴性对照(水)无扩
增ꎬ说明引物特异性良好ꎮ
２.３　 灵敏度比较及扩增效率
检测阳性样品 ＤＮＡ 的 ＯＤ２６０ / ２８０值为 ２.００ꎬ１０
倍梯度稀释得 ７ 个系列浓度ꎬ分别为 ４.６４×１０２ ~
４.６４×１０－４ ｎｇ / μＬꎬ用于 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 扩增和常规
ＰＣＲ扩增ꎮ 常规 ＰＣＲ 扩增结果如图 ３ 所示ꎬ模板
浓度高于 ４.６４×１０－４ ｎｇ / μＬ时ꎬ可见扩增条带ꎬ浓度
４.６４×１０－４ ｎｇ / μＬ 以下电泳显示无扩增条带ꎬＲｅａｌ￣
ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＤＮＡ模板浓度稀释到 ４.６４×１０－７ｎｇ / μＬꎬ
Ｃｔ值为 ３６.３２１ꎬ稀释至 ４.６４×１０－８ ｎｇ / μＬꎬ检测不到
Ｃｔ值ꎬ表明 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 灵敏度为常规 ＰＣＲ 的
１ ０００倍ꎮ
内参基因和目的基因的标准曲线如图 ４所示ꎬ
由标准曲线斜率计算得到目的基因的扩增效率为
９６.３％ꎬ内参基因的扩增效率为 ９８.８％ꎬ两者相差
２.５％ꎬ且接近 １００％ꎬ可用于样品病毒 ＤＮＡ的定量
检测ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ｔｈｅ ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
Ａ: Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅꎻ Ｂ: Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ.
Ｆｉｇ. ３　 ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｓａｍｐｌｅｓ
Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ Ｉꎻ Ｌａｎｅ １￣７: Ｔｈｅ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ４.６４×１０２ꎬ ４.６４×１０１ꎬ ４.６４×１００ꎬ ４.６４×１０－１ꎬ ４.６４×１０－２ꎬ
４.６４×１０－３ꎬ ４.６４×１０－４ ｎｇ / μＬꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ Ｃｔ ｍｅａｎ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｏｆ ｌａｎｅ １￣７ ａｒｅ ９.１７５ꎬ
１２.６０５ꎬ １６.５３２ꎬ １８.７５６ꎬ ２２.５８４ꎬ ２６.５１１ꎬ ２９.７３８ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｓ １３９ ｂｐ.
６６３
　
　 ４期 　 　 朱云聪ꎬ等:基于 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ监测番茄黄化曲叶病毒在番茄植株中的动态变化
Ｆｉｇ. ４　 Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｃｔ ｖａｌｕｅｓ ｖｓ ｌｇ ｏｆ ｔｏｔａｌ
ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
Ａ: Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅꎻ Ｂ: Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ.
Ｆｉｇ. ５　 Ｔｈｅ ＴＹＬＣＶ ＤＮＡ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅｓ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ
Ａꎬ Ｂꎬ Ｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｒｏｏｔꎬ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｌｅａｆꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
２.４　 番茄植株内病毒 ＤＮＡ含量的测定
温室条件下接种病毒检测结果表明ꎬ病毒
ＤＮＡ含量随时间变化逐渐增加ꎬ３０ ｄ 开始缓慢下
降ꎬ在测定的时间内病毒 ＤＮＡ 呈现上升ꎬ稳定ꎬ回
落的趋势(图 ５)ꎮ
图 ５还表明ꎬ病毒 ＤＮＡ 在番茄 ３ 种器官中累
积的速度不同ꎮ 根部病毒最先累积ꎬ３ ｄ 根部的病
毒含量显著高于茎部和叶部ꎮ 根部病毒的累积速
７６３
　
植物病理学报 ４４卷
度比叶部和茎部都慢ꎬ２７ ｄ 根部病毒含量达到最
高值ꎮ 叶部和茎部病毒 ＤＮＡ 在 ９ ~ １８ ｄ 快速累
积ꎬ１８ ｄ进入稳定期ꎬ３３ｄ 病毒 ＤＮＡ 达到最高ꎻ１８
~３３ ｄ病毒 ＤＮＡ增长缓慢ꎬ３３ ｄ病毒 ＤＮＡ比 １８ ｄ
分别增加了 １４.１％和 ２４.１％ꎮ 病毒 ＤＮＡ在根部下
降的时间最早ꎬ２７ ｄ 开始下降ꎬ茎部和叶部下降的
时间比根部延后了 ６ ｄꎮ 同病毒含量最高时相比ꎬ
根、茎、叶部病毒 ＤＮＡ 含量最高分别下降了 ６８.
３％ꎬ８７.５％和 ６９.８％ꎮ
病毒 ＤＮＡ在植物的 ３ 种器官中分布不均匀ꎮ
当病毒 ＤＮＡ积累达到稳定时期时ꎬ茎部病毒 ＤＮＡ
的含量最高ꎬ叶部次之ꎬ根部最低ꎻ３３ ｄ 茎部病毒
ＤＮＡ约是根部的 １００ 倍ꎮ 叶部和根部病毒 ＤＮＡ
含量在同一个数量水平ꎮ
３　 讨论
植物病毒从病毒粒体侵入寄主细胞、病毒核酸
复制及表达ꎬ最后装配成病毒粒体ꎬ这一过程包括
侵入、脱壳、复制、翻译、装配与成熟等[５]ꎮ 病毒完
成系统侵染需要离开初侵染细胞进入邻近细胞ꎬ从
薄壁细胞进入维管束系统以及从维管束系统进行
长距离运输到达植物的其它组织ꎮ ＴＹＬＣＶ 自然
条件下依靠烟粉虱传播ꎬ烟粉虱传毒后 ５ ｍｉｎ 就可
以在传毒位点检测到病毒 ＤＮＡ[１８]ꎮ 烟粉虱取食
嫩叶后ꎬ病毒在接种点复制ꎬ病毒首先被运输到根
部ꎬ然后运输到植株的新芽ꎬ最后运输到与接种叶
片位置相邻的叶片和花[６]ꎮ 本研究中病毒通过接
种进入韧皮部ꎬ移动速度较快ꎬ先在植株的根部累
积ꎬ然后分布在茎部和叶部ꎮ 病毒 ＤＮＡ 在茎部的
相对含量最高ꎬ３３ ｄ茎部病毒含量达到根部的 １００
倍ꎬ这可能和 ＴＹＬＣＶ依靠韧皮部传输完成系统侵
染有关[８]ꎮ 病毒的累积具有时间效应ꎬＰéｒéｆａｒｒｅｓ
等[１９]发现菜豆金色花叶病毒属的单组分和双组分
病毒具有不同的累积模式ꎬＴＹＬＣＶ在 ２０ ｄ 后其累
积量达到最大ꎮ 本研究中植株接种病毒后ꎬ在发病
的初期ꎬ病毒快速累积到一定水平ꎬ此后累积的速
度变慢ꎻ侵染后期ꎬ病毒有不同程度下降ꎬ也表现出
了时间效应ꎮ 在 ２１ ~ ３３ ｄꎬ病毒含量有降有升ꎬ表
明病毒在不同的植株之间累积速度也存在差异ꎮ
病毒含量下降ꎬ可能与寄主对病毒的免疫抗性有
关ꎮ 病毒在完成系统侵染的过程中ꎬ和寄主相互对
抗ꎬ有些病毒侵染的植物在系统症状出现后又减弱
或消失(恢复现象)ꎬ如烟草脆裂病毒属病毒(Ｔｏ￣
ｂｒａｖｉｒｕｓｅｓ)ꎬ花椰菜花叶病毒属病毒(Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ￣
ｅｓ) [２０]等ꎮ 苜蓿花叶病毒(ＡＭＶ)侵染烟草后能够
恢复ꎬ病毒在烟草植株内的含量变化呈现出一定的
规律[２１]ꎮ 这是植物积累起来的针对“外源”核酸的
抗性ꎬ它通常是借助于转录后基因沉默(ｐｏｓｔ￣ｔｒａｎ￣
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ꎬ ＰＴＧＳ)发挥作用ꎮ
本研究建立了 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
方法ꎬ并用于定量与监测被侵染的番茄植株根、茎、
叶部 ＴＹＬＣＶ ＤＮＡ随时间的累积变化ꎮ 该方法检
测 ＴＹＬＣＶꎬ灵敏度是常规 ＰＣＲ的 １ ０００倍ꎬ能检测
到 ４.６４×１０－７ ｎｇ / μＬ 的植物 ＤＮＡ 中含有的 ＴＹＬ￣
ＣＶꎬ适用于对病毒侵染和增殖的监测ꎬ用于病毒
ＤＮＡ的定量ꎬ为番茄黄花曲叶病毒病的防治和抗
病番茄品种的筛选提供量化依据ꎮ 与 ＴａｑＭａｎ 探
针法比较ꎬＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 法省去了昂贵的探针合
成ꎬ能到到与之相当灵敏度[１３]ꎬ节省了实验成本ꎻ
但 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ是非特异性结合双链 ＤＮＡꎬ因此
对引物设计要求更高ꎮ 本实验的不足之处在于没
有对所设计的引物进行更深入的特异性分析ꎬ用于
区别其它的病原物或 ＴＹＬＣＶ的其它株系ꎬ这方面
的研究将在后续的实验中继续展开ꎮ
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责任编辑:张宗英
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