全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$#"""$"!(
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收稿日期$!"#%#!"$
&修改稿收到日期$!"#%#!!+ 基金项目$长江学者和创新团队发展计划"
012")$3 # 作者简介$韩锋溪"
#43)&
#!女!硕士研究生!主要从事植物逆境分子生物学研究
567-8
$97/:;/ < =-# ! #!+*>?6 " 通信作者$胡景江!教授!主要从事植物逆境生理与分子生物学研究
567-8
$9@ ,! /A.@7:*;B@*>/ 低聚壳聚糖诱导的毛白杨抗病反应 与$%$信号通路的关系 韩锋溪!胡景江" "西北农林科技大学 生命科学学院!陕西杨陵 )#!#"" # 摘 ! 要$脱落酸"
CDC
#信号通路核心组分有
CDC
受体"
2E1
%
2EF
%
1GC1.
#(
!G
型蛋白磷酸酶家族中的
C
亚族成
员"
22!G.
#以及蔗糖非酵解型蛋白激酶
!
家族成员"
H/1I!.
#运用
DFCHJ2
序列比对方法!在毛果杨中获得
#$条 !"!#$
(
)
条
!"!!!%
和
$条 !"&$(!
基因!它们分别与拟南芥
)"!#$( )"!!!% 和 )"&$(!
基因同源根据
系统进化树分析结果!选取基因
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(
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(
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(
!"&$(!-% 和 !"&$(!*+
!设计合适
的引物以
3(
号无性系毛白杨组培苗为材料!分别对其根部进行外源
CDC
和低聚壳聚糖处理!于处理
%9
(
+9
(
#!
9
和
!$9$
个时间点取样!提取样本叶片总
1KC
!反转录成
>LKC
!进行实时荧光定量
2G1
分析结果显示$CDC 处理和低聚壳聚糖处理均能使 !"!#$*)
和
!"!#$*4 基因表达下调!使 !"+),! 和 !"!!!%) 基因表达上调!使 !"&$(!-%
和
!"&$(!*+ 基因表达先上调后下调研究表明! CDC 处理和低聚壳聚糖处理诱导毛白杨叶片中与 CDC 信号通路相关的基因的表达变化趋势几乎一致!说明 CDC 信号通路是低聚壳聚糖诱导毛白杨抗病的信号传 递途径之一 关键词$低聚壳聚糖&毛白杨&诱导抗病&
CDC
信号通路
中图分类号$M)34 文献标志码$
C
&()*#"+,-#
.
/*0+1-#*"2"(#
3
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CDC.-
<
/78-/
7S9A7
V
!!
杨树是重要的造林绿化(农田防护和用材树种!
但杨树病害种类很多!其叶部(枝干和根部均能遭受
不同程度病害)#!*利用化学农药防治病害是一种
有效方法!但也带来一系列环境污染问题)%*!因此!
寻求高效(安全(无污染的绿色生物农药显得尤为重
要)$(*近年来!植物诱导抗病性的研究为植物病害 的防治开辟了一条新途径!并发现低聚糖是诱导植 物抗病性的有效诱导物)+* 已有的研究表明!壳聚糖和其降解产物低聚壳 聚糖具有多种生物活性)*!能调节植物生长发育(增 强植物的抗逆性低聚壳聚糖能增强多种植物的抗 寒(抗病(抗旱和抗盐能力!使防御酶和病程相关蛋 白如几丁质酶( " # ! % 葡聚糖酶和 2CF 活性升 高)+!3*但目前研究多局限在与植物抗病相关的生 理指标上!对于低聚壳聚糖诱导抗病性的分子机制! 相关报道并不多 CDC 调控着与种子萌发(植物发育以及生物和 非生物胁迫应答相关的关键过程!而且! CDC 能够 与植物防御机制相关的其他激素互作)4#(* CDC 信号通路核心组分有 2E1 % 2EF % 1GC1. ( 22!G. 和 H/1I!. 默认情况下! 22!G. 通过物理相互作 用使 H/1I! 激酶去磷酸化处于失活状态但是有 外界刺激或发育信号时! 2E1 % 2EF % 1GC1. 与 CDC 结合!形成的复合物可以与 22!G. 互作而抑 制 22!G. 的活性! H/1I!. 从而可以摆脱 22!G. 的 束缚!磷酸化而激活许多 CDC 诱导的基因在它 们的启动子区域包含一个保守的 CDC 应答元件 " CDCR;. W ?/.-U;;8;6;/S. ! CD15 #!那些有能力结 合 CD15. 的转录因子被命名为 CDO. % C15D. "碱 性亮氨酸拉链类转录因子#!磷酸化 H/1I!. 的积累 可以引起 CDO. % C15D. 的磷酸化!然后磷酸化的 CDO. % C15D. 与 CDC 应答启动子元件结合!起始 CDC 应答基因的表达)4!#+#)* 模式植物拟南芥基因组编码 #$
种
2E1
%
1GC1
蛋白!被 命 名 为
2E1#
和
2EF##%
或
1GC1#
1GC1#$!这些蛋白在氨基酸序列水平 高 度 保 守)#3!"*拟南芥 22!GC 亚族蛋白有 4 个成员!被表 明参与 CDC 信号通路!分别是 CD0# ( CD0! ( NCD# ( NCD! ( 22!GC ( CN[# ( NC0# ( NC0! 和 NC0% ) #3 * !最 近!其 22!GD 亚族蛋白中的 22!G( 和 C2!G# 也被 报道参与 CDC 信号通路)!#*拟南芥 H/1I! 蛋白家 族有 #" 名成员!被分为 % 组!其中 H/1I!0 亚组激 酶不被 CDC 激活! # 亚组和$
亚组激酶能被
CDC
激活&
$亚组包括 H/1I!*! ( H/1I!*% 和 H/1I !*+ % \HJ# !它们被认为参与植物 CDC 应答)#3!!* 本研究运用生物信息学手段和实时荧光定量 2G1 方法!以 3( 号毛白杨无性系组培苗为材料!研 究了低聚壳聚糖诱导植物抗病性与内源信号分子 CDC 信号通路的关系!为进一步揭示低聚壳聚糖诱 导植物抗病的分子机制和研究植物抗病性提供了新 的思路 # ! 材料和方法 =*= ! 试验材料与处理方法 试验所用材料为 3( 号毛白杨无性系组培苗!由 西北农林科技大学林业科学研究院提供 !(] 下 #+9 光照( 39 黑暗交替培养!培养基为 # % ! H^_ "*"#6 < % FKCC 当组培苗长至接近组培瓶瓶口 且根已很健壮时!即可进行外源 CDC 和低聚壳聚 糖处理处理方法为$在超净工作台上!将整株组培
苗转移至含有
(6
<
%
F
低聚壳聚糖或者
!"
%
6?8
%
F
CDC
的
#
%
!^ H
培养基上每种处理分别在
%
(
+
(
#!
和
!$9$
个时间点剪取植物全部叶片!取样后液
氮速冻!于
&3"]
保存备用实验重复
%
次!结果
取平均值
=*>
!
低聚壳聚糖的获得
参照张锦)3*的方法!称取
!"
<
壳聚糖"脱乙酰
度
#
4"*"`
!粘度
("*"
&
3""*"627
+
.
&国药集团!
上海!中国#!向其中加入
$""6F!` 的醋酸溶液! 磁力搅拌器上 +"] 搅拌至分散均匀!然后再逐滴加 入 #"6F 的 %"` N ! ! !反应 +9 左右降解液用 #"` K7\N 溶液调节 W N 至 3*( 左右!抽滤去残 渣向滤液中加入 % 倍体积预冷的无水乙醇!沉淀 #!9 !抽滤!所得沉淀用 )(` 乙醇洗 # 遍! %("" R % 6-/ 离心 #(6-/ !无水乙醇洗沉淀后$"""R
%
6-/
离心
#(6-/
"重复此过程
%
遍以脱去产物中的水#!
弃上清后沉淀冷冻干燥得低聚糖样品
=*?
!
序列比对(系统进化树的建立和引物设计
从
KGD0
"
S9;K7S-?/78G;/SR;:?RD-?S;>9/?8?
0/:?R67S-?/
#或
29
V
S?a?6;U4*#
"
9SS
W
$%% AAA* ("% ! 期 !!!!!!!!!! 韩锋溪!等$低聚壳聚糖诱导的毛白杨抗病反应与
CDC
信号通路的关系
W9
V
S?a?6;*/;S
#数据库下载拟南芥中的
#$条 CDC 受体" 2E1 % 2EF % 1GC1. #蛋白( 4 条 22!GC 亚族 蛋白( 22!G( 蛋白( C2!G# 蛋白以及 H/1I! 蛋白激 酶的氨基酸序列在 29 V S?a?6;U4*# 数据库中通 过 DFCHJ2 进行拟南芥与毛果杨之间的同源序列 比对毛果杨中 CDC 受体同源基因的选取标准和 命名参照 N7@.;R 等)#3*的方法根据 1?6;R? 等)!%* 的方法!将同源 22!G 编码基因和 H/1I! 编码基因 的获得标准定为$选取分值最大的!当同时有几条氨
基酸序列拥有相同的最大分值时!选取里面一致性
最大的&一致性较大的毛果杨基因与其同源的拟南
芥基因同名
利用
5^[C(*#
软件!通过矩阵法"
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<
9X?R
,
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<
!
KQ
#构建系统进化树!
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W
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W
8-/
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值是
#"""
引物由
J7Y7R7
公司设计
=@A
!
总
&B$的提取和 48B$
的制备
取毛白杨叶片!于研钵中加液氮研磨成干粉!迅
速转入离心管中用
1KC
W
R;
WW
@R;
多糖多酚植物
总
1KC
提取试剂盒"离心柱型&目录号$L2$$# &天 根生化科技有限公司!北京!中国#提取总 1KC 具 体操作步骤按试剂盒说明书进行琼脂糖凝胶电泳 "电泳条件$胶浓度
#*!`
&
"*(bJD5
电泳缓冲液&
#("c
!
#(6-/
#检测
1KC
完整性!当植物
1KC
样
品中最大
R1KC
亮度为次大
R1KC
亮度的
#*(
&
!*"
倍时!表明
1KC
较完整
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!+"
%
\L
!3"
读数在
#*3
&
!*#
之间(
\L
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%
\L
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读数接近
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时!表明
1KC
质量较好
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用
2R-6;H>R-
W
S1JR;7
<
;/SY-S
"
2;R:;>S1;78
J-6;
#"编号$L11"%)H &宝生物工程有限公司!大 连!北京#将提取的完整性及质量较好的总 1KC 反 转成 >LKC ! &!"] 保存备用具体操作步骤按试 剂盒说明书进行 =@C ! 实时荧光定量 :1& 参照 H;>>9- 等)!$*的方法!将内参基因定为
=95
>
15"5
用
HED12R;6-=5=?8
>
J^
#
"
2;R:;>S
1;78J-6;
#"编号$L11"3#C &宝生物工程有限公 司!大连!北京#荧光染料进行实时荧光定量 2G1 HED12R;6-=5=?8 > J^ # " !b # " % F !正向和反向 引物各 "*3 % F ! >LKC"*( % F ! BN ! \)*4 % F !总反 应体系 !" % F 反应程序为$
4(]%".#
次!然后
4(](.
(
+"]%".
循环
$" 次溶解曲线由 +(] 开始!每次增加 "*(] !直至 4(] ! ! 结果与分析 >*= ! 序列比对(系统进化树建立和引物设计 在毛果杨中!共找到 #$
种与拟南芥
CDC
受体
蛋白氨基酸序列同源的蛋白质"表
#
#!分别命名为
2S2E1F#2S2E1F#$这些蛋白作为毛果杨中的 CDC 受体!当有外界刺激或发育信号时!可与 CDC 结合以接受 CDC 信号!起始 CDC 信号通路在这 些蛋白质中! 2S2E1F# 和 2S2E1F4 均与拟南芥 CS2EF4 同源! 2S2E1F! 和 2S2E1F#$
均与
CS
2EF#!
同 源!
2S2E1F(
和
2S2E1F)
均 与
CS
2EF#%
同源!
2S2E1F+
和
2S2E1F#%
均与
CS2EF!
表
=
!
$%$
受体
:D&
!
:DE
!
&1$&, 氨基酸序列比对结果 J7X8;# ! J9;DFCHJ2R;.@8S?:CDCR;>; W S?R2E1 % 2EF % 1GC1. 毛果杨基因 !. / 1213"4567.684 / 8 < ;/; 61KC 的 KGD0 参考序列 KGD0R;:;R;/>;.; Z @;/>; 氨基酸序列标识符 "源数据库$
29
V
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$29 V S?a?6; # 拟南芥同源基因 )4895:. / 353"782588 9?6?8? << ;/; !"!#$*# d^
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卷
同源!
2S2E1F3
和
2S2E1F#"
均与
CS2EF$同源 进化树分析结果显示 "图 # ! 7 #! 2S2E1F4 ( 2S 2E1F#" ( 2S2E1F## ( 2S2E1F#! ( 2S2E1F#% 和 2S2E1F#$
属于
CDC
受体

亚家族!
2S2E1F(
(
2S2E1F+
(
2S2E1F)
和
2S2E1F3
属于
CDC
受体
#
亚家族!
2S2E1F#
(
2S2E1F!
(
2S2E1F%
和
2S
2E1F$属于 CDC 受体$
亚家族
根据较大一致性!将获得的毛果杨
22!G
编码基
因分别命名为
!"),@#
(
!")+A#
(
!"+),!
(
!"+)@%
(
!"!!!%)
(
!")!!%#
(
!"!!!%(
!将获得的毛果杨
H/1I!
编码基因分别命名为
!"&$(!-% ( !"&$(!-
+
(
!"&$(!-) 和 !"&$(!*3
"表
!
#其中!蛋白
2S
CD0#
(
2SCN[#
(
2SNCD!
(
2SNC0%
和
2S22!GC
属于
22!GC
亚族蛋白!
2SC2!G#
和
2S22!G(
属于
22!GD
图
#
!
无根系统进化树
7*
毛果杨和拟南芥
CDC
受体
2E1
%
2EF
%
1GC1.
&
X*
毛果杨和拟南芥
22!G.
&
>*
毛果杨和拟南芥
H/1I!.
&进化树利用
5^[C(*#
软件(基于氨基酸序列比对并通过矩阵法建立!每个蛋白的基因信息详见表
#
和表
!
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S?R2E1
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W
R?S;-/-.B;S7-8;B-/J7X8;#7/BJ7X8;!
表
>
!
::>1,
和
9+&<>,
氨基酸序列比对结果
J7X8;!
!
J9;DFCHJ2R;.@8S?:22!G.7/BH/1I!.
拟南芥中的同源基因
N?6?8?
<
?@.
<
;/;-/
)4895:.
/
353"782588
毛果杨基因名称
!.
/
1213"4567.684
/
8
<
;/;/76;
毛果杨基因位点名称
"源数据库$29 V S?a?6; # !. / 1213"4567.684 / 8 < ;/;8?>@./76; " .?@R>; B7S7X7.;$
29
V
S?a?6;
#
分值
H>?R;
5
值
5U78@;
一致性
0B;/S-S
V
氨基酸序列
比对覆盖率
M@;R
V
>?U;R
转录本名称
JR7/.>R-
W
S/76;
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同源!
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和
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和
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均与毛果杨
基因位点
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同源!
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和
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!从
CDC
受体
#
亚族中选取基因
!"0
!#$*) !从与 CDC 信号通路最相关的 22!GC 亚 族中选取基因 !"+),! 和 !"!!!%) !从与 CDC 信号通路最相关的 H/1I!$
亚组中选取基因
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%
#!
进行基因表达分析
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!
实时荧光定量
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结果及分析
选取毛果杨
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>
15"5
为内参基因!进行实时
荧光定量
2G1
从图
!
可以看出!
CDC
处理和低
聚壳聚糖处理均能使毛白杨叶片中
!"!#$*) 基因 和 !"!#$*4
基因的表达水平下调
CDC
处理下!
!"!#$*) 基因在 % & #!9 时间段内表达量变化不 大!$9
时表达量进一步下调!而低聚壳聚糖处理
下
!"!#$*) 基因在 % & !$9
时间段内表达量处于
波动变化状态&
CDC
处理和低聚壳聚糖处理均能使
!"!#$*4 基因在 % & !$9
时间段内表达量先下降
后上升
CDC
处理和低聚壳聚糖处理均能使毛白杨叶
片中
!"+),!
基因和
!"!!!%)
基因表达水平上
调 "图
%
#其中!
CDC
处理下!基因
!"+),!
在
%
&
!$9 时间段内表达量变化不大!而低聚壳聚糖处 理下基因 !"+),! 在 % & !$9
时间段内表达量先
下降后上升&
CDC
处理下!基因
!"!!!%)
在
%
&
!$9 时间段内表达量先上升后下降!而低聚壳聚糖处 理下基因 !"!!!%) 在 % & !$9
时间段内表达量处
于波动变化状态
表
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!
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引物序列
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!
2G1
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Z
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基因名称
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正向引物
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W
R-6;R
反向引物
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W
R-6;R
产物大小
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%
X
W
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基因和
!"&$(!*+ 基因表达水 平先上调后下调"图$
#低聚壳聚糖处理下!
!$9 后 !"&$(!-%
和
!"&$(!-+ 的表达水平基本恢 复正常 CDC 处理和低聚壳聚糖处理诱导毛白杨叶片 中与 CDC 信号通路相关的基因的表达水平变化是 一致的!由此可得出结论! CDC 信号通路是低聚壳 聚糖诱导毛白杨抗病的信号传递途径之一 % ! 讨 ! 论 G97/ ) 4 *对拟南芥进行外源 CDC 处理或非生物 逆境处理后!提取植物 1KC 并做实时定量 2G1 !发 现选定的 2E1 % 2EF. 的基因表达水平均下调! 22!G. 和 CDO. 的基因表达水平均上调!由此表明! 22!G.$
2E1
%
2EF.
比例的增加可能是生物和非生
物逆境下下游
CDC
信号通路激活所必需的
H7/
S-7
<
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等)!(*和
Ha?.SY-;A->a
等)!+*两个研究团队也发
现了
CDC
处理和非生物胁迫条件能够改变
2E1
%
2EF
%
1GC1
和
22!G
家族成员的相对表达水平并
使
22!G.
$2EF % 2E1. 的比值升高本试验中! CDC 处理和低聚壳聚糖处理均能使毛白杨叶片中 2E1 编码基因表达下调( 22!G 编码基因表达上调! 与对照组有显著差异!这一实验结果与 G97/ ( H7/ S-7 < ? 等和 Ha?.SY-;A->a 等的实验结果一致!说明 22!G.$
2E1
%
2EF.
比例的增加可能是低聚壳聚糖
诱导毛白杨抗病过程中激活下游
CDC
信号通路所
必需的
H/1I!
编码基因表达先上调!
H/1I!
激
酶蛋白积累且活性增加!使其下游的
CDO.
%
C15D.
磷酸化!然后磷酸化的
CDO.
结合
CDC
应答启动子
元件!诱导
CDC
应答基因的表达)4!#+#)*&一段时间
后!
H/1I!
编码基因表达下调!使
CDC
应答基因的
表达得到控制!恢复到静息水平
CDC
是一类重要的内源信号分子!本试验通过
4"%
!
期
!!!!!!!!!!
韩锋溪!等$低聚壳聚糖诱导的毛白杨抗病反应与 CDC 信号通路的关系 序列比对(进化树建立和实时荧光定量 2G1 !初步 确定了 CDC 信号通路与低聚壳聚糖诱导毛白杨抗 病的关系分析 CDC 处理和低聚壳聚糖处理对其 余基因表达的影响!可以进一步确定两者的关系 参考文献" ) # * ! f5K[L2 "曾大鹏# *1;U-;A?:>@RR;/S.-S@7S-?/?:R;.;7R>97/B>?/SR?8?/ W ? W 87RB-.;7.;.-/G9-/7 ) Q * -B.4<3"!<3"8:C53<83< "中国森林 病虫#! ""! ! >= " # #$
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