全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)"$)!0
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基金项目$国家科技支撑计划项目"
!"#!123"!1"$
#&内蒙古自然科学基金重大项目"
!"##43"%
#
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作者简介$王
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丹"
#500(
#!女!在读博士研究生!主要从事马铃薯遗传育种研究
6)78-9
$
#$0*5%!#"
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#%+:;7
!!"
通信作者$于
!
卓!教授!博士生导师!主要从事马铃薯及饲用作物遗传育种研究
6)78-9
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马铃薯杂种无性株系的
$$%
鉴定及花粉育性和
染色体构型分析
王
!
丹#!于肖夏#!鞠天华!!于
!
卓#"!郝治满#!姜
!
超#
"
#
内蒙古农业大学 农学院!呼和浩特
"#""#5
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!
赤峰天泽生物科技有限公司!内蒙古赤峰
"!$*$&
#
摘
!
要$为明确马铃薯(
@1"5
)
A
(陇薯
&
号)杂种
B
#
无性株系在
3C2
和细胞遗传学水平上的差异!该试验以亲本
材料为对照!利用
DDE
分子标记技术对其
!"
个优良无性株系"
B
#
无性系一代#的
3C2
指纹特征进行分析!并采用
常规制片镜检方法对已选出的
0
个杂种优良株系"
B
#
无性系二代#的花粉育性及花粉母细胞减数分裂中期
"
"
F@)
G@
"
#的染色体配对构型进行了研究!为马铃薯杂交新品系选育提供分子细胞遗传学依据结果显示$"
#
#试验共
筛选出
!
对
DDE
特异引物
G$&
和
D!$
!通过
FGE
扩增建立了能识别出这
!"
个杂种株系及其双亲的
DDE
指纹图
"
!
#杂种优异株系
B
#
)#
*
B
#
)!
*
B
#
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*
B
#
)##
*
B
#
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*
B
#
)#*
*
B
#
)#$
和
B
#
)!"
的花粉可育率变幅为
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#
0&+"0H
!并
以株系
B
#
)&
最高"
0&+"0H
#!而且显著超过高亲"
0%+%%H
#!说明各优良株系花粉育性有一定差异"
%
#对
0
个优异
株系花粉母细胞的
F@G@
"
观察发现!各优良株系的染色体配对构型明显不同!均包括单价体*二价体*三价体和
四价体
*
类!其中二价体构型的比例最高!其介于
*5+#%H
#
0!+5#H
之间!其中以株系
B
#
)&
的二价体比例最高
"
0!+5#H
#该研究明确了
!"
个马铃薯杂种优良株系的
DDE
指纹特征和
0
个优异株系的花粉育性及染色体配对
构型差异
关键词$马铃薯&杂种株系&
DDE
指纹&花粉育性&染色体配对构型
中图分类号$
I&05
&
I%*%+!
!!!
文献标志码$
2
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3#3
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#
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B
#
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#
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U
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#
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!
XV-Y89W/X8/Z
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8/\X?W -^Y89W/XV8XW;]0?
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V^-\WO:W9W/X9-/W.V8/
U
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#
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U
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`
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<
&
:?V;7;.;7W:;/]-
U
=V8X-;/
!!
马铃薯是重要粮*菜*饲兼用作物!也是重要工
业和能源原料其营养价值高!富含淀粉*蛋白质*
膳食纤维*维生素*酚类物质及钾*锌*硒*硫等营养
元素+#)%,随着中国马铃薯产业的迅速发展!专用型
和深加工型马铃薯品种的选育工作倍受重
视+*),内蒙古是中国重要的马铃薯种薯和商品薯
生产基地目前生产上运用的马铃薯品种对水肥条
件要求较高!但其田间抗病能力弱!种薯退化周期
短!特别是黑痣病*粉痂病*晚疫病等病害危害严重!
马铃薯产量损失逐年增大+&)#",因此!选育抗病性
和适应性强*优质高产马铃薯品种非常必要
通过分析比对子代与亲本在
3C2
水平上的差
异!可为马铃薯优良株系"或品系#选育和鉴定提供
分子依据如李长青等+##,利用
%
对
DDE
适宜引物
建立了
%
个马铃薯杂交组合共
$5
个杂种株系的指
纹图&甘霖等+#!,利用
TDDE
标记技术成功的鉴定了
*
个马铃薯杂交组合选出的
!%
个优良杂种株系
段艳凤等+#%,利用

对
DDE
引物将
00
份彩色马铃薯
材料一一区分开来马铃薯杂种株系花粉育性是判
断其是否可作为杂交中间材料而进一步利用的重要
细胞学依据!一般花粉可育率高于
$"H
的杂种材料
可作为父本利用!而低于
$"H
适于作母本利用+#*,
马铃薯杂种染色体配对行为与花粉育性的高低密切
相关!通常二价体频率越高!表明染色体遗传相对稳
定!相应的花粉育性亦越高+#$,
本课题组从美国引进了马铃薯材料(
@1"5
)
"四倍体!
!/b*Ob*0
#!并在内蒙古呼和浩特和赤
峰地区种植观察发现!其产量高!品质好!生育期较
短!薯形好!但其抗病性差国内育成品种(陇薯
&
号)"四倍体!
/b*Ob*0
#具有抗病性和适应强*淀
粉含量高*芽眼浅等优良特性!但生育期较长为培
育出抗病性和抗逆性强*优质高产的马铃薯新品种!
我们按照遗传差异较大和优缺点互补的亲本组配原
则!用(
@1"5
)材料作母本!(陇薯
&
号)作父本!人工
去雄授粉杂交!成功获得(
@1"5
)
A
(陇薯
&
号)杂种
B
#
代共
#"%$
个单株材料&通过田间试验观测!从中
选出生长健壮*田间抗病性和适应性强的优良株系
!"
个"无性系一代#!进而对这
!"
个杂种株系进行
产量和品质等农艺性状测定分析!选出优异株系
0
个"无性系二代#本试验采用
DDE
分子标记技术
对(
@1"5
)
A
(陇薯
&
号)的
!"
个杂种株系进行
3C2
指纹分析!并利用花粉染色镜检及卡宝品红染
色体制片方法对其选出的
0
个优异株系的花粉育性
及花粉母细胞染色体配对构型进行观察!为进一步
马铃薯杂交新品系选育提供分子细胞遗传学依据
#
!
材料和方法
>+>
!
供试材料
材料为马铃薯(
@1"5
)
A
(陇薯
&
号)杂种
B
#
中
选出的优良株系
B
#
)#
#
B
#
)!"
"无性系一代#及从这
!"
个株系中选出的株系
B
#
)#
*
B
#
)!
*
B
#
)&
*
B
#
)##
*
B
#
)
#%
*
B
#
)#*
*
B
#
)#$
和
B
#
)!"
共
0
个优异株系"无性系
二代#和其亲本
0
个杂种株系的田间抗病性均较
强!株型*薯型和生长势好!芽眼浅!还原糖含量均很
低"鲜薯含量小于
"+#H
#其中株系
B
#
)&
为高淀粉
株系"
!!+!#H
#!株系
B
#
)!
和
B
#
)!"
为高蛋白株系
"
!+&%H
和
!+5H
#!株系
B
#
)##
和
B
#
)#%
均为高产
株系"单株平均产量
#+**a
U
和
#+$$a
U
#各材料
均由内蒙古农业大学马铃薯育种研究中心提供
>?@
!
$$%
指纹图建立
>?@?>
!
AB;
提取与纯度检测
!
在苗期!选取
!!
份
马铃薯材料的幼嫩叶片!用天根生化科技有限公司
生产的植物基因组试剂盒提取
3C2
!
#+H
的琼脂
糖凝胶电泳检测
3C2
纯度后!将各材料的
3C2
浓
度稀释到
$"/
U
%
$
[
左右!置冰箱中保存备用
!!
个马铃薯材料的基因组
3C2
电泳条带清晰均匀!
表
>
!
$$%C-6%
反应体系
Q8^9W#
!
DDE)FGEVW8:X-;/.
<
.XW7
体系组分
D
<
.XW7:;7
`
;/W/X
浓度
G;/:W/XV8X-;/
用量
3;.8
U
W
%
$
[
超纯水
\\R
!
S ( #*+##
缓冲液
#"A1=]]WV
"
@
U
!c
#
$"
$
7;9
%
[ !+"
脱氧核苷酸
\CQF. !+$77;9
%
[ #+*
3C2
聚合酶
Q8
Z
3C2
`
;9
<
7WV8.W $M
%
$
[ "+"5
上游引物
B;V_;V`
V-7WV $"
$
7;9
%
[ "+&
下游引物
EWYWV.W
`
V-7WV $"
$
7;9
%
[ "+&
3C2
模板
3C2XW7
`
98XW $"/
U
%
$
[ #+"
总体积
Q?WX;X89Y;9=7W ( !"
&!%#
&
期 王
!
丹!等$马铃薯杂种无性株系的
DDE
鉴定及花粉育性和染色体构型分析
表
@
!
$$%
适宜引物及其碱基序列
Q8^9W!
!
DDE.=-X8^9W
`
V-7WV.8/\X?W-V/=:9W;X-\W.W
Z
=W/:W.
引物名称
FV-7WV/87W
正向引物
B;V_8V`
V-7WV
反向引物
EWYWV.W`
V-7WV
G$& $d)K2GQKKGQK2GGGQK22GQG)%d $d)K2G2222QQ2G2KK22GQKG222)%d
D!$ $d)KGK22QK2G2KK2G22K2KK)%d $d)QKGG2GQKGQ2GG2Q22GG2)%d
无拖尾现象!
3C2
纯度高!符合
DDE
分析的要求
>?@?@
!
$$%C-6%
扩增反应体系及程序
!
DDE
扩增
反应体系详见表
#
反应程序为
5$e
预变性
#
个
循环!时间为
*7-/
&
5*e
变性
%".
!
$e
退火
*$.
!
&!e
延伸
5".
!
%*
个循环&
!e
延伸
#"7-/
!
#
个
循环后终止反应+#!,试验所用
FGE
仪为
1-;)V8Q""Q?WV789G
<
:9WV

>?@?D
!
电泳及银染
!
对
FGE
扩增产物进行电泳!
F2K6
凝胶浓度为
H
!样孔加样量

$
[
!
@8VaWV
为
3[#""
!功率
&"J
!电泳时间
#?
电泳完毕后将
胶板放入固定液"蒸馏水
![
*酒精
!""7[
*冰乙酸
!"7[
#中固定
#$7-/
!蒸馏水漂洗
%7-/
!用
#+$H
2
U
CS
%
溶液染色
#$7-/
后放入蒸馏水中速漂
$.
!
置显影液"蒸馏水
![
*
C8SR"
U
*甲醛
#"7[
#中
显色
#"7-/
!蒸馏水漂洗!自然晾干后扫描胶板+#*,
>?@?E
!
$$%
适宜引物筛选
!
用亲本及其
!"
个杂种
B
#
无性株系的基因组
3C2
为模板筛选
DDE
适宜
引物!试验所用的
*"
对
DDE
引物碱基序列来源于
CG1T
网站公布的马铃薯特异性引物!委托上海生
工有限公司合成通过
FGE
扩增从中选出多态性
丰富*条带清晰稳定的
!
对
DDE
适宜引物"表
!
#
>+D
!
花粉育性鉴定
在马铃薯开花盛期!田间随机取亲本及其
0
个
优异杂种株系的花药带回室内镜检在载玻片上用
镊子挤压花药!使花粉散出!滴加
#+"H
的醋酸洋
红!在
S9
<
7
`
=.1N$#
的
#"A#"
倍显微镜下观察并
统计可育花粉和不可育花粉数!每份材料观察
$"
个
视野左右观察标准$可育花粉染色深*花粉粒较
大*饱满*形状有规则&不育花粉染色浅或者是没有
染上色*花粉空瘪*形状无规则花粉可育率"
H
#
b
"可育花粉粒总数%观察的花粉粒总数#
A#""H
+
#$
,

>?E
!
花粉母细胞减数分裂中期
!
"
-F6F
!
#染色
体观察
!!
在马铃薯现蕾初期!取
0
个优异杂种株系及其
双亲的幼小花蕾若干!置于装有卡诺液"无水乙醇
f
冰醋酸
b%f#
#的广口瓶中!
*e
冰箱中固定
!!
#
!*
?
后!用清水洗净放入
&"H
酒精中保存备用制片
时!在载玻片上用解剖针将花蕾挑开挤出花药!去除
杂质!滴加卡宝品红染色!放盖玻片用镊子轻敲!使
细胞分散均匀后压片!
S9
<
7
`
=.1N$#
显微镜下观
察统计
F@G@
"
染色体数并照相+#,
!
!
结果与分析
@?>
!
杂种
5
>
无性株系的
$$%
指纹分析
利用筛选出的
DDE
引物
G$&
和
D!$
对
!"
个杂
种株系及其亲本
FGE
扩增结果如图
#
所示
!"
个
株系的
DDE
指纹图与双亲间均产生互补型条带及
新的特征带或缺失型条带!其中引物
G$&
扩增出互
补型条带及新的特征带的株系为
B
#
)#
#
B
#
)%
*
B
#
)$
*
B
#
)&
#
B
#
)!"
!扩增出缺失型条带的为
B
#
)*
和
B
#
)
&
引物
D!$
扩增出互补型条带及新的特征带的株系为
B
#
)#
*
B
#
)!
*
B
#
)*
#
B
#
)
*
B
#
)5
#
B
#
)!"
!扩增出缺失型
条带的为
B
#
)%
*
B
#
)&
和
B
#
)0
这从
3C2
水平证明
它们均为真实的杂种株系另外!株系
B
#
)#!
和
B
#
)
图
#
!
引物
G$&
"
2
#和
D!$
"
1
#对(
@1"5
)
A
(陇薯
&
号)
杂种
B
#
无性株系扩增的
DDE
指纹图
@+3[#""3C2
&
F
#
+
(
@1"5
)&
F
!
+
(陇薯
&
号)&
#
#
!"+
(
@1"5
)
A
(陇薯
&
号)杂种
B
#
B-
U
+#
!
DDE]-/
U
WV
`
V-/X;]B
#
?
<
V^-\9-/W.]V;7
(
@1"5
)
A
(
[;/
U
.?=&
)
87
`
9-]-W\^
<`
V-7WVG$&
"
2
#
8/\D!$
"
1
#
@+3[#""3C2
&
F
#
+
(
@1"5
)&
F
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+
(
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U
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#
?
<
V^-\9-/W.;]
(
@1"5
)
A
(
[;/
U
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)
0!%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
#&
的
DDE
指纹一致!说明引物
G$&
能把
5"H
的杂
种株系识别出来!而引物
D!$
扩增的
DDE
指纹图可
将这
!"
个株系完全区别开来由于不同引物在杂
种株系间扩增出的
DDE
指纹图不完全相同!因此在
马铃薯杂种株系鉴定及
3C2
指纹图建立时最好选
用
!
对以上引物
@?@
!
杂种
5
>
优异株系花粉育性差异分析
0
个杂交株系间的花粉可育率不同!株系
B
#
)#
*
B
#
)#%
*
B
#
)#*
间差异不显著!但它们与株系
B
#
)!
*
B
#
)
&
*
B
#
)#$
*
B
#
)!"
间均达到极显著差异"图
!
和表
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#
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&
号)花粉育性为
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)
为
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B
#
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!且与其母本差异极显著&其余优异株系的
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#
&&+&0H
!介于双亲之
间根据
0
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表
D
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个杂种株系及其亲本花粉育性
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期 王
!
丹!等$马铃薯杂种无性株系的
DDE
鉴定及花粉育性和染色体构型分析
表
E
!
G
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!
"
-F6F
!
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B
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*
B
#
)#%
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B
#
)#*
和
B
#
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B
#
)!
*
B
#
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*
B
#
)##
和
B
#
)!"
适宜作父本利用
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!
杂种
5
>
优异株系
-F6F
!
染色体构型分析
亲本间的
F@G@
"
染色体配对构型差异明显
"图
%
和表
*
#其中母本
@1"5
的二价体频率较
低!且棒状二价体较多!染色体配对构型为
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"
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%
c%+&*
&
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&父本陇薯
&
号的二价
体频率较高!且以环状二价体为主!染色体配对构型
为
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"
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%
c"+5*
&
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与双亲相比!
0
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型明显不同株系
B
#
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*
B
#
)&
*
B
#
)##
和
B
#
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的二价
体频率为
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#
0!+5#H
!与父本"
0"+%H
#接近!
并以株系
B
#
)&
"
0!+5#H
#最高!且以环状二价体为主!
其染色体配对构型分别为
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&
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*
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&
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B
#
)#
*
B
#
)#%
*
B
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和
B
#
)#$
的
二价体频率为
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#
!+#0H
!介于双亲之间!并
均以棒状二价体为主!其染色体配对构型分别为
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"
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&
c!+#0

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"
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&
c!+"0

和
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"
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%
c+%#
&
c#+0#

将该结果进一
步与上述花粉育性情况比较表明!二价体频率高的杂
种株系!其花粉育性也高!反之则花粉育性低!这为优
异杂种株系育性评价利用提供了细胞遗传学依据
%
!
讨
!
论
杂种无性株系真实性鉴定是马铃薯新品种选育
的重要环节!有研究表明不同的
DDE
引物在马铃薯
杂种株系间扩增出的指纹特征不同!可分为(偏母
型)*(偏父型)*(杂种型)和(双亲互补型)
*
种类型!
其中(双亲互补型)是鉴定杂种株系与亲本的最佳类
型+#&,&李长青等的研究认为!在马铃薯杂种株系
DDE
标记双亲互补的基础上常产生一些缺失或非
双亲的新特征带!可看作是双亲互补型的新类型!这
可能是在减数分裂过程中同源染色体复制时部分碱
基发生基因突变或发生染色体交换和配对引起
的+##!#0,本试验利用筛选出的
!
对
DDE
特异引物
G$&
和
D!$
对(
@1"5
)
A
(陇薯
&
号)杂种
B
#
中选出
的
!"
个优良株系基因组
3C2
扩增的
DDE
指纹图
显示!同一杂种株系用不同
DDE
引物扩增出的指纹
特征不同!不同杂种株系用同一
DDE
引物扩增出的
指纹亦不同!据此认为在马铃薯杂种株系鉴定时!除
考虑以上双亲互补型*缺失型和新类型外!还可以结
合亲本及其杂种株系的
DDE
指纹差异进行判定!若
杂种株系与双亲的
3C2
指纹明显不同!即可将其
认定为真实的杂种株系!而引起不同杂种株系间的
3C2
指纹差异的原因还有待深入研究另外!本试
验中用引物
D!$
可将
!"
个杂种株系及其与亲本完
全区别开来!而用引物
G$&
只能区分
5"H
的杂种株
系!因此在建立马铃薯杂种株系
3C2
指纹图时应
选用
!
对以上
DDE
特异引物
花粉母细胞的减数分裂过程较为复杂!受到一
系列基因的精准控制!不论这些基因中的哪一个发
生倒位*断裂等变异!均会导致减数分裂发生异常!
细胞内的遗传物质发生变化!最终导致花粉败
育+#5,不少学者在水稻+!"!#,*玉米+!!,*大豆+!%,等作
物上的研究表明!花粉败育的主要原因是杂种
B#
花粉母细胞减数分裂时!因染色体组来自不同亲本!
在染色体组之间出现不平衡现象!如单价体*落后染
色体和微核等导致杂种不育!因此在减数分裂时二
"%%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
价体出现频率越高!其花粉育性越高本试验对
(
@1"5
)
A
(陇薯
&
号)的
0
个优异杂种株系花粉母
细胞
F@G@
"
染色体构型及其花粉育性观测亦表
明!二价体频率高的株系其花粉育性亦高!这与前人
研究结果一致!为马铃薯杂种株系进一步作为杂交
中间材料利用提供细胞遗传学依据
参考文献!
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