全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(６): ５８６￣５９４(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０９￣０９ꎻ 修回日期: ２０１４￣０８￣０２
基金项目: 国家自然科学基金项目(３１２７２００３)ꎻ公益性行业(农业)科研专项(２００９０３０４９－０４)ꎻ国家科技支撑计划项目(２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０６)ꎻ
国家大宗蔬菜产业技术体系建设项目(ＣＡＲＳ￣５￣Ｂ￣０１)ꎻ农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室ꎻ中国农业科学院科技创
新工程
通讯作者: 杨宇红ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻＴｅｌ:０１０￣８２１０９５４５ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｙａｎｇｙｕｈｏｎｇ＠ｃａａｓ.ｃｎ
第一作者: 张吉祥ꎬ男ꎬ河北邯郸人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为分子植物病理学ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈｏｒｕｓ＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０６.００４
甘蓝枯萎病菌 １号和 ２号生理小种的快速检测与鉴定
张吉祥ꎬ 凌 键ꎬ 谢丙炎ꎬ 杨宇红∗
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所ꎬ北京 １０００８１)
摘要:甘蓝枯萎病菌生理小种传统鉴定方法费时费力ꎬ不能满足生产的要求ꎬ因此需要建立一种快速、可靠的分子检测技
术ꎮ 本研究在甘蓝枯萎病菌 １号和 ２号生理小种基因组测序的基础上ꎬ通过比较基因组学方法筛选 １、２号生理小种各自的
特异基因片段并设计引物ꎬ并分别以 １０个甘蓝枯萎病菌 １号生理小种菌株、２个 ２号生理小种菌株、７个尖孢镰刀菌其他专
化型菌株及 ４个外围菌株 ＤＮＡ为模板进行常规 ＰＣＲ扩增ꎬ筛选出甘蓝枯萎病菌 １号和 ２号生理小种特异性引物ꎬ同时引
入尖孢镰刀菌通用引物Ｗ１０６Ｒ / Ｗ１０６Ｓꎬ建立起一步三重 ＰＣＲ检测甘蓝枯萎病菌 １、２ 号生理小种的分子检测技术ꎮ 结果
表明ꎬ该分子检测技术实现了在一次 ＰＣＲ反应中快速、准确地同步检测出甘蓝枯萎病菌 ＤＮＡ、罹病甘蓝组织和土壤中的甘
蓝枯萎病菌 １号和 ２号生理小种ꎬ对检测甘蓝植株是否感染枯萎菌及甘蓝种植区土壤是否受到枯萎菌的污染有实用价值ꎮ
关键词:分子检测ꎻ 甘蓝枯萎病菌ꎻ １号和 ２号生理小种ꎻ 三重 ＰＣＲ
Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ ｒａｃｅ １
ａｎｄ ｒａｃｅ ２ 　 ＺＨＡＮＧ Ｊｉ￣ｘｉａｎｇꎬ ＬＩＮＧ Ｊｉａｎꎬ ＸＩＥ Ｂｉｎｇ￣ｙａｎꎬ ＹＡＮＧ Ｙｕ￣ｈｏｎｇ 　 ( Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ａｎｄ
Ｆｌｏｗｅｒｓꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｒａｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ (ＦＯＣ) ｉｓ ｌａｂｏｒｉｏｕｓ ａｎｄ
ｔｉｍｅ￣ｃｏｎｓｕｍｉｎｇꎬ ａｎｄ ｃａｎ′ｔ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｃｅ １ ａｎｄ ｒａｃｅ ２ ｉｓ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｅａｇｅｒｌｙ ｎｅｅｄｅｄ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｒａｃｅ １ ａｎｄ ｒａｃｅ ２ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｒａｃｅｓ ａｎｄ
ｏｔｈｅｒ ｆｏｒｍａｅ ｓｐｅｃｉａｌｓ ｏｆ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ＤＮＡｓ ｏｆ ｔｅｎ ＦＯＣ ｒａｃｅ １ ｉｓｏｌａｔｅｓꎬ ｔｗｏ ＦＯＣ ｒａｃｅ ２ ｉｓｏｌａｔｅｓꎬ
ｓｅｖｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｒａｃｅｓ ｏｆ ＦＯＣ ａｎｄ ｆｏｕｒ ｎｏｎ￣ＦＯＣ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ＦＯＣ ｒａｃｅ １ ａｎｄ ｒａｃｅ ２ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬａｎｏｔｈｅｒ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ
(Ｗ１０６Ｒ / Ｆ１０６Ｓ) ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｔｒｉｐｌｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＯＣ ｒａｃｅ １
ａｎｄ ｒａｃｅ ２ ｉｎ ｏｎｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ. Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒｉｐｌｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ
ＦＯＣ ｒａｃｅ １ ａｎｄ ｒａｃｅ ２ ｆｒｏｍ ｐｕｒｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓꎬａｎｄ
ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｈａｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＦＯＣ ｒａｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｓｏｉｌｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓꎻ ｒａｃｅ １ ａｎｄ ｒａｃｅ ２ꎻ ｔｒｉｐｌｅ ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３２. ４１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０６￣０５８６￣０９
　 　 尖孢镰刀菌是一种世界范围内存在的土传真
菌ꎬ可引起甘蓝、香蕉、番茄、黄瓜等近 １５０ 多种作
物的枯萎[１~３]ꎮ 该菌具有高度的种内寄主特异性ꎬ
根据其对不同寄主植物的致病性ꎬ可划分为不同的
专化型ꎬ同一专化型又可根据其对不同品种的致病
性进一步划分为不同生理小种[４]ꎮ
　
　 ６期 张吉祥ꎬ等:甘蓝枯萎病菌 １号和 ２号生理小种的快速检测与鉴定
　 　 甘蓝枯萎病菌隶属于尖孢镰刀菌粘团专化型
(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ) [２]ꎬ该专
化型又可划分为 １ 号和 ２ 号两个生理小种[５ꎬ ６]ꎮ
该病自 ２００１年在我国延庆地区发现以来ꎬ发病面
积逐年增加ꎬ已成为威胁我国甘蓝生产的重要因
素[７]ꎮ 目前生产上缺少有效防控甘蓝枯萎病的方
法ꎬ因此ꎬ快速稳定的病原菌鉴定与检测技术是对
该病害进行综合防控的基础[８]ꎮ 现有的甘蓝枯萎
病菌生理小种的鉴定与检测技术仍然以传统鉴别
寄主鉴定为主ꎬ利用鉴别寄主鉴定生理小种耗时费
力ꎬ已不能满足生产的要求ꎮ 随着生命科学的高速
发展ꎬ包括 ＡＦＬＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ以及 ＳＣＡＲ在内的
分子检测技术在病原菌检测方面的应用得到植物
病理学家的重视ꎬ基于各生理小种特异基因而设计
的特异性引物已经广泛应用于枯萎病菌生理小种
的分子检测[４]ꎮ
　 　 前人已基于特异性引物成功建立了快速检测
番茄 枯 萎 病 菌 ( Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ.
ｃｉｃｅｒｉｓ ) [９] 、香蕉枯萎病菌 ( Ｆ . ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ . ｓｐ .
ｃｕｂｅｎｓｅ) [８]、莴苣枯萎病菌 ( Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ.
ｌａｃｔｕｃａｅ) [１０]、香石竹枯萎病菌(Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ.
ｄｉａｎｔｈｉ) [１１]、豌豆枯萎病菌(Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｐｉ￣
ｓｉ) [１２] 和唐菖蒲枯萎病菌 ( Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ.
ｇｌａｄｉｏｌｉ) [１３]不同生理小种的分子鉴定体系ꎮ 三重
ＰＣＲ检测技术也在香蕉枯萎病菌 １ 号和 ４ 号生理
小种鉴定中得到应用[１４]ꎬ但甘蓝枯萎病菌生理小
种的检测、鉴定及应用技术至今尚未见报道ꎮ 本研
究在甘蓝枯萎病菌 １、２ 号生理小种全基因组测序
数据基础上ꎬ筛选出其各自的特异引物并以尖孢镰
刀菌通用引物 Ｗ１０６Ｒ / Ｗ１０６Ｓ[１４]为内标ꎬ建立起
一步三重 ＰＣＲ快速检测甘蓝枯萎病菌 １、２ 号生理
小种的技术ꎬ并应用于发病植株和土壤中甘蓝枯萎
病菌 １、２号生理小种的检测与鉴定ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 供试菌株见表 １ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｎｏ. Ｉｓｏｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｎａｍｅ Ｒａｃｅ Ｈｏｓｔ Ｏｒｉｇｉｎ
１ ＡＴＴＣ５２５５７ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ ＡＴＴＣ
２ Ａ８ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ Ｉｔａｌｙ
３ ＦＧＬ￣０３￣６ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ Ｉｔａｌｙ
４ ＦＧＬ￣０１ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ Ｂｅｉｊｉｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ
５ ＦＧＬ￣０２ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ Ｂｅｉｊｉｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ
６ ＦｏＴＹ￣４ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ Ｓｈａｎｘｉꎬ Ｃｈｉｎａ
７ ＦｏＴＹ￣２ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ Ｓｈａｎｘｉꎬ Ｃｈｉｎａ
８ ＦｏＳＹ￣１１ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ Ｓｈａｎｘｉꎬ Ｃｈｉｎａ
９ ＦｏＳＹ￣１０ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ Ｓｈａｎｘｉꎬ Ｃｈｉｎａ
１０ ＦｏＨＢ￣２ Ｆ.ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ １ Ｃａｂｂａｇｅ Ｈｅｂｅｉꎬ Ｃｈｉｎａ
１１ ＡＴＴＣ５８３８５ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ ２ Ｃａｂｂａｇｅ ＡＴＴＣ
１２ Ｆｏｃ￣２ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ ２ Ｃａｂｂａｇｅ Ｉｔａｌｙ
１３ ３０４０ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｌａｃｔｕｃａｅ － Ｌｅｔｔｕｃｅ ＡＴＴＣ
１４ １６６０８ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌｕｍ － Ｂｅａｎｓ ＡＴＴＣ
１５ Ｆｕｃ￣ＢＮ￣８ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ － Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ａｍｅｒｉｃａ
１６ Ｆ￣ｅｇｇ ｐｌａｎｔ￣２ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｍｅｌｏｎｇｅｎａｅ － Ｅｇｇ ｐｌａｎｔ Ｆｕｊｉａｎꎬ Ｃｈｉｎａ
１７ Ｆ￣ｂａｎａｎａ￣１ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｕｂｅｎｓｅ １ Ｂａｎａｎａ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ
１８ Ｆ￣ｔｏｍａｔｏ￣ＺＪ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ － Ｔｏｍａｔｏ Ｚｈｅｊｉａｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ
１９ Ｆ￣ｐｅｐｐｅｒ￣ＩＪ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃａｐｓｉｃｕｍ － Ｐｅｐｐｅｒ Ｆｕｊｉａｎꎬ Ｃｈｉｎａ
２０ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ － － Ｂｅｉｊｉｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ
２１ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ － － Ｂｅｉｊｉｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ
２２ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ － － Ｂｅｉｊｉｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ
２３ Ｊｏ￣ＴＳ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ － Ｐｅｐｐｅｒ Ｆｕｊｉａｎꎬ Ｃｈｉｎａ
“－”: Ｕｎｋｎｏｗｎ
７８５
　
植物病理学报 ４４卷
　 　 主要试剂:Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ、植物
基因组提取试剂盒购自北京全式金生物技术公司ꎻ
土壤 ＤＮＡ提取试剂盒购自北京基普生物技术有限
公司ꎻ引物由上海生工生物技术有限公司合成ꎮ
１.２　 特异性引物的设计与筛选
　 　 在甘蓝枯萎病菌 １、２号生理小种全基因组测序
数据的基础上ꎬ通过基因组 ＢＬＡＳＴ的方法找出两小
种的特异片段ꎮ 具体方法如下:利用甘蓝枯萎病菌
１号和 ２号生理小种全基因组数据分别 ＢＬＡＳＴ 尖
孢镰刀菌其他专化型(未发表)的基因组序列ꎬ每次
基因组的 ＢＬＡＳＴ的 ｅ值取 １０－５ꎬ没有同源序列的基
因组序列保留下来ꎬ进行下一次的基因组 ＢＬＡＳＴꎬ
如此循环ꎬ直到不能再找到同源序列为止ꎬ即可得到
甘蓝枯萎病菌 １号和 ２号生理小种特有的片段ꎮ 利
用Ｍｅｇａ软件根据筛选出的 １号和 ２号生理小种特
异片段分别设计引物ꎮ 并分别以 １０ 个甘蓝枯萎病
菌 １号生理小种菌株、２ 个 ２ 号生理小种菌株、７ 个
尖孢镰刀菌其他专化型菌株及 ４个外围菌株 ＤＮＡ
为模板进行常规 ＰＣＲ扩增ꎬ筛选出甘蓝枯萎病菌 １
号和 ２号生理小种特异性引物ꎮ
１.３　 土壤样品准备
　 　 首先配制不同浓度(１×１０５、１×１０４、１×１０３和 １×
１０２个􀅰ｍＬ－１ )的甘蓝枯萎病菌 １ 号生理小种
ＡＴＣＣ ５２５５７ 的孢子悬浮液ꎬ然后每 １ ｇ 灭菌土中
加入 １ ｍＬ所配浓度的孢子悬浮液ꎬ混合均匀制成
不同浓度的阳性对照土[１５]ꎮ
１.４　 从土壤中分离镰孢菌
　 　 发病甘蓝植株根际土壤中镰孢菌的分离参照
Ｌｉ等[１４]描述的方法并做适当改进ꎮ 取 １ ｇ 田间采
集的发病甘蓝根际土壤至 １０ ｍＬ 灭菌生理盐水中
１６０ ｒ􀅰ｍｉｎ－１震荡 ３０ ｍｉｎꎬ然后分别稀释 １０、１０２、
１０３、１０４倍制成不同浓度的土壤溶液ꎬ各取 １００ μＬ
均匀涂布于 Ｋｏｍａｄａ[１６]选择性培养基平板上ꎬ于
２５℃培养 ３~５ ｄꎬ将疑似镰孢菌单一菌落纯化后于
新的 ＰＤＡ培养基平板上 ２５℃培养ꎬ一周后在显微
镜下复检菌的孢子形态ꎬ挑选具有典型镰孢菌大、
小孢子的菌株备用ꎮ
１.５　 从发病植株中分离病原菌
　 　 采用传统的病原菌分离方法分离发病甘蓝植
株上的病原菌ꎬ从发病甘蓝植株病健交界处切取 ５
ｍｍ×３ ｍｍ的组织块ꎬ在 ７０％乙醇中消毒 ２ ｍｉｎꎬ在
无菌水中漂洗 ３次后晾干ꎬ接于 ＰＤＡ平板上ꎬ２５℃
条件下黑暗 /光照交替 １２ ｈ 培养ꎬ２ ｄ 后挑取病块
组织周围的菌落转皿纯化ꎬ继续培养一周左右后保
存备用[１７]ꎮ
１.６　 ＤＮＡ抽提
　 　 供试菌株基因组 ＤＮＡ 参照 Ｌｉｎ 等[１８]描述的
方法提取ꎬ发病植株总 ＤＮＡ 用 ＮｕＣｌｅａｎ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎ
ＤＮＡ Ｋｉｔ 试剂盒提取ꎬ土壤总 ＤＮＡ 用经改进的
ＦａｓｔＤＮＡ® Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ 试剂盒提取ꎮ 用紫外
分光光度计检测 ＤＮＡ 纯度及浓度ꎬ ＯＤ２６０ /
ＯＤ２８０ 的比值为 １. ８ ~ ２. ０ 时最佳ꎬ浓度调整为
１０~５０ ｎｇ􀅰μＬ－１ꎻ置于－２０℃冰箱中保存备用ꎮ
１.７　 ＰＣＲ反应体系及产物检测
　 　 用于特异性检测的 ＰＣＲ 反应体系:模板 ＤＮＡ
１ μＬꎬ１０×ＰＣＲ 缓冲液(含 Ｍｇ２＋) ２.５ μＬꎬ ｄＮＴＰｓ
０.５ μＬꎬ特异性上、下游引物(浓度为 １０ μｍｏｌ􀅰
Ｌ－１)各 ０. ８μＬꎬＴａｑ 酶 (５ Ｕ􀅰μＬ －１) ０. ４ μＬꎬ加
ｄｄＨ２Ｏ至 ２０ μＬ总体积ꎮ
　 　 三重 ＰＣＲ 反应体系中ꎬ除引物为甘蓝枯萎病
菌 １号、２号生理小种特异性引物(浓度为 １０ μｍｏｌ
􀅰Ｌ－１)和尖镰孢通用引物(浓度为 １ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１)
各 ０.８ μＬ外ꎬ其余同上ꎮ
　 　 扩增程序:９５℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４℃变性 ４０ ｓꎬ
６０℃退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 ９０ ｓꎬ共 ３５ 个循环ꎻ７２℃
延伸 １０ ｍｉｎꎬ４℃保存ꎮ 将扩增产物用 １.５％的琼脂
糖凝胶电泳检测ꎬ凝胶成像仪成像后分析结果ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 引物序列
　 　 对设计的疑似特异引物进行常规 ＰＣＲ筛选ꎬ获
得一对甘蓝枯萎病菌 １号生理小种特异引物 １＃７７Ｒ
(５′￣ＡＡＡＴＣＣＡＡＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡ￣３′)和 １ ＃７７Ｓ (５′￣
ＣＣＡＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＡＧ￣３′)ꎬ同时获得一
对甘蓝枯萎病菌 ２号生理小种特异引物 ２＃４０Ｒ(５′￣
ＣＴＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＡ￣３′)和 ２＃４０Ｓ(５′￣ＡＡＣＧ￣
ＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＴＡＴＴ￣３′)ꎮ 另外ꎬ为防止假阴性结果
的出现ꎬ还引入了一对尖孢镰刀菌通用引物Ｗ１０６Ｒ
( ５′￣ＧＣＡＧＴＣＧＴＡＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＣ￣３′) 和 Ｗ１０６Ｓ
８８５
　
　 ６期 张吉祥ꎬ等:甘蓝枯萎病菌 １号和 ２号生理小种的快速检测与鉴定
(５′￣ＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＧＡＧＴＣＡ￣３′)为内标ꎮ
２.２　 引物特异性检测
　 　 以经过致病力测定的甘蓝枯萎病菌 １号和 ２号
生理小种以及对照共 ２３ 个菌株基因组 ＤＮＡ 为模
板ꎬ以清水为对照ꎬ分别用 １ 号、２ 号生理小种特异
引物和尖孢镰刀菌通用引物进行 ＰＣＲ扩增ꎬＰＣＲ产
物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 １ 所示ꎬ１ 号生理
小种特异性引物、２ 号生理小种特异性引物以及尖
孢镰刀菌通用引物均能分别扩增出相应的条带ꎬ大
小分别为 １ ９２７、３０９和 ７２９ ｂｐꎬ而外围菌株均没有扩
增产物ꎬ表明上述 ３对引物均具有特异性ꎮ
２.３　 三重 ＰＣＲ检测结果
　 　 以 １号生理小种特异性引物 １＃７７Ｒ和 １＃７７Ｓ、
２号生理小种特异性引物 ２＃４４Ｒ 和 ２＃４４Ｓ 及通用
引物Ｗ１０６Ｒ和Ｗ１０６Ｓ对甘蓝枯萎病菌 １ 号、２ 号
生理小种及对照菌株共 ２３ 个菌株的基因组 ＤＮＡ
进行三重 ＰＣＲ扩增ꎬＰＣＲ 产物琼脂糖凝胶电泳检
测结果如图 ２所示ꎬ１号生理小种菌株可得到大小
分别为 １ ９２７和 ７２９ ｂｐ的 ２条带ꎬ２ 号生理小种菌
株可得到大小分别为 ３０９ 和 ７２９ ｂｐ 的 ２ 条带ꎬ其
它尖镰孢的菌株只有 １ 条带ꎬ大小为 ７２９ ｂｐꎬ而清
水及外围菌株(灰霉菌、立枯丝核菌、炭疽菌和疫
霉菌)则没有扩增出产物ꎻ应用三重 ＰＣＲ检测引物
及体系可在同一个反应中检测出甘蓝枯萎病菌 １
号和 ２号生理小种ꎬ此外ꎬ其作为内参照的尖镰孢
通用引物ꎬ还可检查所提 ＤＮＡ 的质量ꎬ从而避免
了假阴性结果的出现ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｔｈｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ＦＯＣ ｒａｃｅ １ ａｎｄ
ｒａｃｅ ２ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ａ: ＦＯＣ ｒａｃｅ １ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓꎻ Ｂ: ＦＯＣ ｒａｃｅ ２ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓꎻ Ｃ: Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ. Ｍ:ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ
１－２３: Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ Ｔａｂｌｅ １ꎻ ２４: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ｄｄＨ２Ｏ) .
９８５
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ２　 Ｔｈｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＦＯＣ ｉｓｏｌａｔｅｓ
ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ １￣２３: Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ Ｔａｂｌｅ １ꎻ ２４: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ｄｄＨ２Ｏ) .
２.４　 三重 ＰＣＲ体系灵敏度检测
　 　 取 １号生理小种 ＡＴＣＣ５２５５７菌株的新鲜菌丝
抽提 ＤＮＡ 后溶于 ２０ μＬ 的水中ꎬ抽提所得 ＤＮＡ
用紫外分光光度计检测其纯度及浓度ꎬ以 ＯＤ２６０ /
ＯＤ２８０ 的比值为 １.８ ~ ２.０ 时最佳ꎮ 将 ＤＮＡ 浓度
分别调整至 １０ꎬ１ꎬ０.１ꎬ０.０１和 ０.００１ ｎｇ􀅰μＬ－１后作
为模板进行三重 ＰＣＲ 检测ꎬ并设清水对照ꎮ 扩增
产物用 ２.０％的琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ 三重 ＰＣＲ
检测体系灵敏度检测结果如图 ３所示ꎬ该体系能够
检测出 ０.０１ ｎｇ基因组 ＤＮＡ的存在ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ ＰＣＲ ａｍ￣
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ５２５５７
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ １￣５: Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ＡＴＣＣ５２５５７ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ (１０ꎬ １ꎬ ０. １ꎬ ０. ０１ ａｎｄ ０. ００１
ｎｇ􀅰μＬ－１)ꎻ６: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ｄｄＨ２Ｏ) .
２.５　 发病组织中病原菌检测
　 　 从北京市延庆地区以及甘肃省榆中地区甘蓝
枯萎病发病区采集甘蓝发病叶片及根系标本ꎬ抽提
标本组织总 ＤＮＡꎬ并以之为模板ꎬ以甘蓝枯萎病菌
１、２ 号生理小种基因组 ＤＮＡ、清水及健康甘蓝叶
片总 ＤＮＡ做对照进行三重 ＰＣＲ 检测ꎮ 结果如图
４所示ꎬ甘蓝罹病组织及 １ 号生理小种阳性对照扩
增出两条大小分别为 １ ９２７和 ７２９ ｂｐ的特异片段ꎬ
２号生理小种阳性对照扩增出两条大小分别为 ３０９
和 ７２９ ｂｐ 的特异片段ꎬ而健康甘蓝叶片和清水对
照均未有条带ꎮ 从发病组织中分离得到的病原菌
检测结果也验证了病组织上的检测结果ꎮ 由此可
以判断ꎬ导致我国北京延庆和甘肃省榆中地区甘蓝
枯萎病的为甘蓝枯萎病菌 １ 号生理小种ꎮ 同时也
说明该三重 ＰＣＲ检测体系可以用于甘蓝枯萎病罹
病组织中带菌情况的检测ꎮ
２.６　 土壤中病原菌检测
　 　 为探究上述三重 ＰＣＲ分子检测技术可检测到的
土壤中甘蓝枯萎病菌的最低含菌量ꎬ取 １ ｇ 不同孢
子浓度的拌菌土壤按照 ＦａｓｔＤＮＡ® Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ
试剂盒的方法抽提土壤总 ＤＮＡ 并进行三重 ＰＣＲ
检测ꎮ 结果显示除 １×１０２孢子􀅰ｍＬ－１浓度的拌菌
土壤没有 ＰＣＲ 产物外ꎬ其它孢子浓度拌菌土壤均
能检测到特异性的 ＰＣＲ 产物(图 ５)ꎬ表明检测最
低含菌量为每克土壤拌 １ ０００ 个甘蓝枯萎病菌 １
号生理小种的孢子 ꎮ结合用 １ ｇ的土壤进行土
０９５
　
　 ６期 张吉祥ꎬ等:甘蓝枯萎病菌 １号和 ２号生理小种的快速检测与鉴定
Ｆｉｇ. ４　 Ｔｈｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｔｉｓｓｕｅｓ
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ １: ＦＯＣ ｒａｃｅ １ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ２: ＦＯＣ ｒａｃｅ ２ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ꎻ
３: ＤＮＡ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ￣ｌｅａｆꎻ ４: ＤＮＡ ｏｆ Ｇａｎｓｕ￣ｌｅａｆ￣１ꎻ ５: ＤＮＡ ｏｆ Ｇａｎｓｕ￣ｌｅａｆ￣２ꎻ ６: ＤＮＡ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ￣ｒｏｏｔꎻ
７: ＤＮＡ ｏｆ Ｇａｎｓｕ￣ｒｏｏｔꎻ ８: ＤＮＡ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｆｒｏｍ Ｇａｎｓｕꎻ
９: ＤＮＡ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｔｉｓｓｕｅｓꎻ １０: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ｄｄＨ２Ｏ) .
Ｆｉｇ. ５ 　 Ｔｒｉｐｌｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｓｏｉｌ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｏｒｅ ｃｏｎ￣
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ￣
ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ５２５５７
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ １: ＦＯＣ ｒａｃｅ １ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ２￣５: Ｓｏｉｌ
ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｏｒｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌ ＡＴＣＣ５２５５７(１×１０５ －１×１０２ ｓｐｏｒｅｓ􀅰 ｍＬ－１)ꎻ ６: Ｎｅｇａ￣
ｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ｄｄＨ２Ｏ) .
壤总 ＤＮＡ抽提ꎬ溶解于 １００ μＬ的 ｄｄＨ２Ｏ 中ꎬ每次
检测时只用 １ μＬ模板 ＤＮＡꎬ因此从土壤中检测的
最低 ＰＣＲ模板量相当于 １０个孢子的 ＤＮＡ量ꎮ
　 　 对田间甘蓝枯萎病菌发病植株根际土壤带菌
情况三重 ＰＣＲ检测结果如图 ６所示ꎬ２号生理小种
阳性对照得到两条大小分别为 ７２９ 和 ３０９ ｂｐ 的扩
增条带ꎬ发病植株根际土壤 ＤＮＡ 及 １ 号生理小种
阳性对照得到大小分别为 ７２９ 和 １ ９２７ ｂｐ 的扩增
条带ꎬ且由发病植株根际土壤分离到的镰孢菌
ＤＮＡ样品扩增结果与土壤 ＤＮＡ扩增结果一致ꎬ表
明所建立的三重 ＰＣＲ检测体系可以对土壤中是否
含有 １号生理小种进行快速准确的检测ꎮ
３　 讨论
　 　 尖孢镰刀菌虽然具有极广的寄主范围ꎬ但具有高
度的种内寄主特异性ꎬ每个菌株个体往往只能侵染一
种或几种作物ꎬ学术界根据尖孢镰刀菌侵染物种的不
同将其划分为不同的专化型ꎬ有些专化型又可根据其
侵染品种的不同进一步划分为不同的生理小种[４]ꎮ
同一专化型不同生理小种之间不能通过形态学特征
来进行鉴定ꎬ而传统的通过鉴别寄主鉴定生理小种的
方法费时耗力[１４]ꎬ已不能满足生产上的需求ꎮ
　 　 基于 ＰＣＲ技术的分子检测方法已经成功应用
于多种镰孢菌专化型[１９~２３]的分子鉴定ꎮ 根据一些
保守的看家基因设计引物开发的分子鉴定方法也
在尖孢镰刀菌海藻专化型(Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ａｌ￣
ｂｅｄｉｎｉｓ) [２４]和尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Ｆ. ｏｘｙｓｐｏ￣
ｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｒａｄｉｃｉｓ￣ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ) [２５]的分子检测上
得到应用ꎮ但上述工作只能鉴别镰刀菌不同种类
１９５
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ６　 Ｔｒｉｐｌｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ ｓｏｉｌ
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ １: ＦＯＣ ｒａｃｅ １ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ２: ＦＯＣ ｒａｃｅ ２ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ３: ＤＮＡ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ
ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ ｓｏｉｌ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔｓꎻ ４￣７: ＤＮＡ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｇａｎｓｕꎻ
８￣９: ＤＮＡ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｂｅｉｊｉｎｇꎻ
１０: ＤＮＡ ｏｆ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｕｎｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔｓꎻ １１: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ｄｄＨ２Ｏ) .
或不同专化型ꎬ不适用于尖孢镰刀菌生理小种的分
子鉴定[２６]ꎮ 近年来ꎬ根据 ＲＡＰＤ、ＳＣＡＲ 技术以及
核糖体 ＩＧＳ序列开发出的特异性引物建立起的分
子检测方法已经成功应用于多种枯萎病菌生理小
种的分子鉴定[８~１３ꎬ ２７]ꎮ 从寻找不同生理小种特有
致病基因或特有片段的角度出发建立病原菌生理
小种快速鉴定方法是更为理想的思路[４]ꎮ 从这个
角度出发ꎬ前人已经建立了番茄枯萎病菌生理小
种[２８]和香蕉枯萎病菌生理小种[１４]的分子鉴定体
系ꎮ 本研究正是在甘蓝枯萎病菌 １、２ 号生理小种
基因组测序数据的基础上ꎬ利用比较基因组学方法
得到两小种各自的特异片段并设计特异引物ꎬ结果
证明甘蓝枯萎病菌 １ 号和 ２ 号生理小种在基因组
序列上确实存在差异ꎮ
　 　 多重 ＰＣＲ检测技术已经在鉴别黄瓜枯萎病菌
和蔓枯病菌[１５]、香蕉枯萎病菌 １ 号和 ４ 号生理小
种[１４]以及瓜类黑星病菌、枯萎病菌和蔓枯病菌[２９]
等诸多病原菌的检测与鉴别方面得到了广泛应用ꎮ
对于多重 ＰＣＲ来讲ꎬ多对引物在同一个 ＰＣＲ 反应
中会有更高的错配率和非特异性扩增ꎬ并且可能会
影响体系的检测灵敏度[８]ꎮ 在已发表的工作中ꎬ
大多是研究单重 ＰＣＲ 的检测灵敏度ꎬ黄瓜枯萎病
菌和蔓枯病菌鉴别体系的检测灵敏度为 １ ｆｇ 基因
组 ＤＮＡ[１５]ꎬ香蕉枯萎病菌 ４ 号生理小种的检测灵
敏度为可在 ５０ μＬ反应体系中检测出０.０１ ｎｇ基因
组 ＤＮＡ 的存在[８]ꎮ 利用三重 ＰＣＲ 建立的香蕉枯
萎病菌 １号和 ４ 号生理小种检测体系可在 ２５ μＬ
的反应体系中检测到 ０.２ μｇ 新鲜菌丝的存在[１４]ꎬ
而本研究中所建立的甘蓝枯萎病菌１号和 ２ 号生
理 小 种 三 重 ＰＣＲ 分 子 检 测 体 系 在
２０ μＬ的反应体系中检测枯萎病菌存在的灵敏度
即可低达 ０.０１ ｎｇꎮ
　 　 基于 ＰＣＲ技术的分子手段在检测植物组织及
植物根际土壤病原菌方面的应用已见报道[３０~３５]ꎬ
植物组织及植物根际土壤微生物种类极其复杂多
样ꎬ用传统的方法分离目标病原菌有很大的困
难[１５]ꎮ 本实验中建立的三重 ＰＣＲ 检测体系可快
速准确的检测出上述样品中甘蓝枯萎病菌 １ 号和
２号生理小种的存在ꎬ且具有较高的检测灵敏度ꎮ
证明该技术可应用于甘蓝枯萎病发病区病情的检
测ꎬ具有很大的实际应用价值ꎮ
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　 ６期 张吉祥ꎬ等:甘蓝枯萎病菌 １号和 ２号生理小种的快速检测与鉴定
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３９５
　
植物病理学报 ４４卷
ｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ｉｎ ｃｅｒｅａｌｓ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ [ Ｊ] .
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９９８ꎬ
５３(１): １７－３７.
[２１] Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ Ａ Ｇꎬ Ｍｏｌｌｅｒ Ｅ Ｍꎬ Ｇｅｉｇｅｒ Ｈ Ｈ. Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ￣ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍꎬ Ｆ. ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍꎬ ａｎｄ
Ｆ. ａｖｅｎａｃｅｕｍ[ Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９９６ꎬ ８６ ( ５):
５１５－５２２.
[２２] Ｍöｌｌｅｒ Ｅꎬ Ｃｈｅłｋｏｗｓｋｉ Ｊꎬ Ｇｅｉｇｅｒ Ｈ. Ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉ￣
ｆｏｒｍｅ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｂｇｌｕｔｉｎａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｅ ｍａｉｚｅ ｅａｒ ｒｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｔｏ￣
ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９９９ꎬ １４７(９): ４９７－５０８.
[２３] Ｐａｒｒｙ Ｄꎬ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ｐ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｔｏ
ｄｅｔｅｃｔ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｏａｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ
１９９６ꎬ ４５(２): ３８３－３９１.
[２４] Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｄꎬ Ｏｕｉｎｔｅｎ Ｍꎬ Ｔａｎｔａｏｕｉ Ａꎬ ｅｔ ａｌ. Ｆｏｔ １
ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ａｌｂｅｄｉｎｉｓ
ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｖｉｄｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｄａｔｅ ｐａｌｍ ｐａｔｈｏｇｅｎ [Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ￣
ｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９８ꎬ ６４(２): ６３３－６３６.
[２５] Ｌｉｅｖｅｎｓ Ｂꎬ Ｃｌａｅｓ Ｌꎬ Ｖａｋａｌｏｕｎａｋｉｓ Ｄ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｒｏｂｕｓｔ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ
ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ.
ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ ａｎｄ ｆ. ｓｐ. ｒａｄｉｃｉｓ￣ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ[ Ｊ] . Ｅｎ￣
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ ９(９): ２１４５－２１６１.
[２６] Ｒｅｃｏｒｂｅｔ Ｇꎬ Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｃꎬ Ｏｌｉｖａｉｎ Ｃꎬｅｔ ａｌ. Ｗａｎｔｅｄ:
ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ[Ｊ] . Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ ２００３ꎬ １５９(１): ７３－
９２.
[２７] Ｆｏｕｒｉｅ Ｇꎬ Ｓｔｅｅｎｋａｍｐ Ｅ Ｔꎬ Ｐｌｏｅｔｚ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｕｒｒｅｎｔ
ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ￣
ｒｕｍ ｆｏｒｍａｅ ｓｐｅｃｉａｌｉｓ ｃｕｂｅｎｓｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ [ Ｊ ] . Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎꎬ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ ２０１１ꎬ １１(３): ５３３－５４２.
[２８] Ｈｉｒａｎｏ Ｙꎬ Ａｒｉｅ Ｔ. ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓａ￣
ｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ ａｎｄ ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒ￣
ｓｉｃｉ ａｎｄ ｒａｃｅｓ ｏｆ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ [ Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ ７２(５): ２７３
－２８３.
[２９] Ｇａｏ Ｙ Ｙꎬ Ｗａｎｇ Ｎꎬ Ｇａｏ Ｐ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｒｉｐｌｅｘ ＰＣＲ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍꎬ Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ.ｓｐ. ｎｉｖｅｕｍ ａｎｄ Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｅｌｏｎｉｓ ｉｎ
ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａ￣
ｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ ２０１０ꎬ ４０(００４):
３４３－３５０.
[３０] Ｃｕｌｌｅｎ Ｄ Ｗꎬ Ｌｅｅｓ Ａ Ｋꎬ Ｔｏｔｈ Ｉ Ｋꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ
ＰＣＲ ａｎｄ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌ￣
ｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｉｎ ｓｏｉｌ ａｎｄ ｏｎ ｐｏｔａｔｏ ｔｕｂｅｒｓ[ Ｊ] .
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００１ꎬ １０７(４):
３８７－３９８.
[３１] Ｓｔｅｆｆａｎ Ｒꎬ Ａｔｌａｓ Ｒ. Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ: ａｐｐｌｉ￣
ｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ [ Ｊ] . Ａｎｎｕａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９１ꎬ ４５(１): １３７－１６１.
[３２] Ｃａｒｎｅｇｉｅ Ｓꎬ Ｃｈｏｉｓｅｕｌ Ｊꎬ Ｒｏｂｅｒｔｓ Ａ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌｅ￣
ｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｏｃｃｏｄｅｓ ａｎｄ Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｉｎ
ｓｏｉｌｓ ｂｙ ｂｉｏａｓｓａｙ [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００３ꎬ ５２(１):
１３－２１.
[３３] Ｔｏｏｌｅｙ Ｐꎬ Ｂｕｎｙａｒｄ Ｂꎬ Ｃａｒｒａｓ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ
２ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ
ｐｏｔａｔｏｅｓ [Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣
ｇｙꎬ １９９７ꎬ ６３(４): １４６７－１４７５.
[３４] Ｈｅｎｓｏｎ Ｊ Ｍꎬ Ｆｒｅｎｃｈ Ｒ Ｃ. Ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ [ Ｊ] . Ａｎｎｕａｌ Ｒｅ￣
ｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ１９９３ꎬ３１:８１－１０９.
[３５] Ｂａｒｒｏｃａｓ Ｅ Ｎꎬ Ｍａｃｈａｄｏ Ｊ ｄ Ｃꎬ Ａｌｍｅｉｄａ Ｍ Ｆ ｄꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ ｓｐ. ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｉｚｅ ｓｅｅｄｓ [ Ｊ] .
Ｒｅｖｉｓｔａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ ｄｅ Ｓｅｍｅｎｔｅｓꎬ ２０１２ꎬ ３４(２): ２１８－
２２４.
责任编辑:李晖
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