全 文 ：书西北植物学报!
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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#&高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金"
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作者简介$宋少宇"
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#!女!在读硕士研究生!主要从事林木生物技术研究
2)34/5
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通信作者$王
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君!博士!副教授!硕士生导师!主要从事林木倍性育种与细胞遗传学研究
2)34/5
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三倍体(银中杨)叶肉原生质体制备的优化
宋少宇#!张俊琦!!王
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北京林业大学 林木育种国家工程实验室!林木花卉遗传育种教育部重点实验室!生物科学与技术学院!北京
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北京林
业大学 公共分析测试中心!北京
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摘
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要$以三倍体杨树品种(银中杨)"
!"
#
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7
#无菌苗叶片为材料!对其原生质体分离
及纯化条件进行研究!为进一步通过细胞融合*基因工程等进行品种改良探索新的途径结果表明$酶的种类及浓
度*渗透压*酶解时间对(银中杨)叶肉原生质体分离效果有显著影响!适宜的分离条件为
DEFG%H D?5:540?IJG
",$H K4=?L6C
9
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N
甘露醇
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!酶解时间为
8
!原生
质体产量和活力分别为
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+ 个%
7
和
",#H
&(银中杨)叶肉原生质体纯化最佳方法为上浮法蔗糖等密度离心!
且蔗糖浓度为
*"H
时原生质体产量最高"
#,"-A#"
+ 个%
7
#!可满足进一步的原生质体培养等技术的要求
关键词$(银中杨)&原生质体&分离&纯化
中图分类号$
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文献标志码$
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9
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L6M6
_
540M
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_
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植物原生质体是获得细胞无性系和选育突变体
的优良起始材料!在植物快速繁殖*远缘遗传重组*
转基因以及品种改良和创造新类型等方面具有广阔
的应用前景+#)!,利用原生质体可以进行细胞融合
和体细胞杂交!能有效克服植物有性杂交不亲和现
象!扩大种*属间的基因交流!丰富种质遗传资源!是
一种创造远缘杂种!获得同源或异源三倍体*四倍体
以及双二倍体的新途径+%)*,&同时!原生质体又是植
物基因工程的理想受体!可为外源基因*
bSP
片段*
细胞器*染色体捕获创造一种新方法+$,
杨树"
!"
#
$%$&N,
#作为木本植物生物技术及
遗传学研究的模式树种+-)+,!有关原生质体的分离与
培养已有一定的研究基础目前!国内外相继报道
了毛白杨"
!)."/*-."&
#*胡杨"
!)*$
#
0+.,1
#*美
洲黑杨
A
欧美杨"
!)2*%.",2&A!)*$+/*+,1-
#*
欧洲山杨
A
白杨"
!).+*/$%A!)%(
#等树种原生
质体的成功游离!认为酶的种类与浓度*渗透压*酶
解时间*酶解温度*
_
V
值*不同材料和取材时间对
原生质体的游离有显著影响+)##,而且!已在毛白
杨*北京杨"
!)A(*,
3
,-
4
*-&,&
#*黑杨
A
大青杨"
!)
-,
4
+A!)/5,/"6,17,,
#等树种中通过原生质体
培养获得了再生植株+!#!)#%,然而!这些研究均以
二倍体树种作为材料!而作为杨树育种的重要产
品---三倍体品种!尚未见有关原生质体游离和培
养的报道三倍体杨树通常具有较强的生长能力和
抗逆性!以三倍体原生质体为材料开展体细胞融合*
基因工程及外源基因瞬时表达等研究对于杨树遗传
改良及基因工程研究可能具有重要意义
(银中杨)"
!)%(A!)(*+"%,-*-&,&B/1C861
7
#
是以银白杨"
!)%(
#为母本!中东杨"
!)(*+"%,-*-8
&,&
#为父本!经人工远缘杂交选育而成的杨树品种!
属白杨派与黑杨派派间杂种!并经进一步鉴定为三
倍体品种+#*,(银中杨)树干通直*形态优美*可扦
插繁殖*生长迅速*材质优良!适宜作为民用建筑用
材和造纸用材&同时!(银中杨)抗逆性强*适应范围
广!且为雄性无性系!具有不飞絮的优良特性因
此!(银中杨)既是营造速生丰产林的优良树种!也是
.三北/防护林*水源涵养林及北方寒冷地区城市绿
化的优秀树种+#$,但(银中杨)扦插较难生根!成活
率低!且苗期易受白杨透翅天蛾及青杨天牛的危害!
给苗木繁育带来困难+#-)#+,本研究以(银中杨)无菌
苗为试验材料!探索了叶肉原生质体分离与纯化条
件!为通过细胞工程及基因工程育种等途径开展(银
中杨)遗传改良及品种优化提供了新的途径
#
!
材料与方法
<,<
!
材
!
料
于内蒙古通辽市采集(银中杨)
#
年生枝条!塑
料布包裹运至北京林业大学!于温室水培无菌体
系的建立和原生质体分离试验在林木良种繁育技术
研究室进行
<,=
!
原生质体分离酶种类及浓度筛选
本研究采用四因素三水平正交试验设计+
N
&
"
%
*
#,筛选酶的种类及浓度"表
#
#!并采用单因素试
验进一步对
D?5:540?IJ
浓度进行筛选"表
*
#
剪取苗龄为
!$
"
%"@
的无菌苗第
!
"
$
片伸展
叶片!将叶片切成宽
",$33
左右的细条置于含
",+
365
%
N
甘露醇的
DEF
盐溶液"
_
V$,
#中!于
*c
黑暗条件下预质壁分离
#
"
#,$8
随后将鲜重
#
7
的叶片放入
#"3N
经过滤灭菌的混合酶液中!酶液
为
DEF
盐溶液
G",-
7
%
NK2JG#
7
%
N
牛血清蛋
白
G",-365
%
N
甘露醇!
_
V$,
!
c
慢速往复式
摇床"
*"
"
-"L
%
3/1
#上黑暗酶解
+8

每个处理重复
%
次!酶解产物依次经
!""
目和
*""
目不锈钢细胞筛过滤!以除去未酶解完全的细
胞团或组织!
#"""L
%
3/1
离心
%3/1
!用新鲜洗液洗
涤
%
次收集原生质体!稀释到一定体积后统计原生
质体产量及活力
<,>
!
原生质体分离甘露醇浓度筛选
在由
%,"H D?5:540?IJG",$H K4=?L6C
9
3?
I)#"G",%H E?=M/10?B)!%
组成的混合酶液中!分
别添加
",*
*
",$
*
",-
*
",+
*
",365
%
N
甘露醇进行渗
透压调节!测定不同渗透压下的原生质体分离情况
<,?
!
原生质体分离酶解时间筛选
在由
%,"H D?5:540?IJG",$H K4=?L6C
9
3?
I)#"G",%H E?=M/10?B)!%G",-365
%
N
甘露醇组
成的混合酶液中!对(银中杨)叶片分别进行
!
**
-
*

*
#"
*
#!8
黑暗酶解!测定不同酶解时间下原生质
体的分离情况
<,@
!
原生质体纯化方法筛选
在
DEFG%,"H D?5:540?IJG",$H K4=?L)
6C
9
3?I)#"G",%H E?=M/10?B)!%G",-365
%
N
甘
露醇的混合酶液中!对(银中杨)叶片进行酶解!酶解
时间为
8
酶解完成后!酶解产物依次经
!""
目和
*""
目不锈钢细胞筛过滤!分别使用上浮法和下沉
法对(银中杨)叶肉原生质体进行纯化!测定不同纯
化方法下原生质体的纯化效果
"
#
#上浮法将滤液经
#"""L
%
3/1
离心
%
3/1
!收集沉淀并将之悬浮在蔗糖含量分别为
%"H
*
%$H
*
"H
*
$HDEFG",-365
%
N
甘露醇溶液中
在其上缓缓加入适量
DEFG",-365
%
N
甘露醇溶
液!
#"""L
%
3/1
离心
$3/1
!在蔗糖
)
甘露醇界面上
""&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
收集原生质体原生质体用
DEFG",-365
%
N
甘
露醇溶液洗涤
!
次
"
!
#下沉法将滤液经
#"""L
%
3/1
离心
%3/1
!
收集沉淀并将之悬浮在
DEFG",-365
%
N
甘露醇溶
液中在离心管中加入蔗糖含量分别为
%"H
*
%$H
*
*"H
*
$HDEFG",-365
%
N
甘露醇溶液!将原生质
体混合液缓缓铺于其上方!
#"""L
%
3/1
离心
$3/1
!
在蔗糖
)
甘露醇界面上收集原生质体原生质体用
DEFG",-365
%
N
甘露醇溶液洗涤
!
次
<,A
!
原生质体的产量与活力测定
用血球计数板统计原生质体产量!每个样品重
复计数
$
次!取平均值!最后计算原生质体产量
原生质体数"个%
3N
#
d$
个大格内原生质体总
数
A$A#""""A
稀释倍数&
原生质体产量"个%
7
#
d
+原生质体数"个%
3N
#
A
稀释后体积"
3N
#,%叶片总质量"
7
#&
对获得的原生质体产量试验数据进行开平方根
转换后!用
2`=?5
进行统计分析
用
","#H
二乙酸荧光素"
[bP
#染色进行原生
质体活力测定!每个样品观测
$
次!取平均值
!!
原生质体活力
d
"发绿色荧光的原生质体数
e
原生质体总数#
A#""H

!
!
结果与分析
=,<
!
不同酶浓度组合对原生质体分离的影响
本试验采用
N
&
"
%
*
#正交试验设计!对(银中杨)原
生质体分离所需的酶种及最佳处理浓度进行筛选
由极差分析"表
#
#可知!
D?5:540?IJ
的
9
值最大为
$+!,&
!表明
D?5:540?IJ
对(银中杨)原生质体分离
的影响最大&
V?3/=?5:540?
的
9
值最小为
#-*,&%
!表
明其影响最小各因素对(银中杨)原生质体产量的
影响顺序为$
D?5:540?IJ
#
E?=M/10?B)!%
#
K4=?L)
6C
9
3?I)#"
#
V?3/=?5:540?
本试验中第
+
个处理组
合原生质体产量最高!最接近最优组合
方差分析"表
!
#发现!
K4=?L6C
9
3?I)#"
和
V?3/=?5:540?
各个水平间差异不显著!应选择最低
浓度!而
D?5:540?IJ
和
E?=M/10?B)!%
各个水平间
差异极显著采用最小显著差数法"
NJb
#对
D?5:)
540?IJ
和
E?=M/10?B)!%
各个水平进行多重比较
"表
%
#!
D?5:540?IJ
第
%
水平最好!与第
#
*
!
水平
表
<
!
不同酶种类及其浓度处理!银中杨"叶肉原生质体产量及分析
Z4;5?#
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7
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8
9
5
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L6M6
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540M
9
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试验号
S:3;?L
因素
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H
D?5:540?
IJ
K4=?L6C
9
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E?=M/10?
B)!%
V?3/=?5:540?
试验结果
2`
_
?L/3?1ML?0:5M
"槡f#
# $ %
产量
B/?5@
%"
#"
-个%
7
#
活力
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"
#,"
#
#
"
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%*-%,- %"*&,#- %"&-,#* %#$%,%-
I $+!,& #&%,-$ !,%" #-*,&%
表
=
!
方差分析表
Z4;5?!
!
P145
9
0/06<]4L/4M/61
变异来源
g4L,
自由度
2)
:
)
平方和
;;
方差
g4L/41=? <
<
!
重复
I?
_
?M/M/61 ! *!!+,#
D?5:540?IJ ! #$%%*-,#& +--&!%,#"
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误差
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总计
Z6M45 !- !+--$#&,!%
#"&#
&
期 宋少宇!等$三倍体(银中杨)叶肉原生质体制备的优化
差异极显著由于最好的结果出现在
D?5:540?IJ
最高水平上!不能肯定是否为最佳处理浓度!因此需
要通过单因素试验进一步筛选其最佳处理浓度"表
*
#
E?=M/10?B)!%
第
!
水平处理效果最好!且与第
#
*
%
水平差异极显著!水平
!
*
%
间差异不显著!因此
E?=M/10?B)!%
最佳处理浓度为第
!
水平!即
",%H

D?5:540?IJ
单因素试验"表
*
#结果表明!
D?5)
5:540?IJ
的各处理间原生质体产量差异极显著!
D?5:540?IJ
浓度为第
#
水平"
%,"H
#时原生质体
产量极显著性高于其他处理!第
!
*
%
水平之间原生
质体产量差异不显著!且随着
D?5:540?IJ
浓度的
升高原生质体产量下降!而原生质体活力差异不显
著因此!(银中杨)叶片原生质体分离最佳酶浓度
组合为
%HD?5:540?IJG",$H K4=?L6C
9
3?I)#"
G",%HE?=M6540?B)!%

=,=
!
不同甘露醇浓度对原生质体分离的影响
在各种酶浓度一定的条件下!使用不同浓度甘
露醇调节渗透压结果"图
#
#表明!甘露醇浓度对
原生质体的产量和活力有极显著性影响当甘露醇
浓度在
",*
"
",-365
%
N
范围内逐渐升高时!原生质
体产量和活力也随之升高&当甘露醇浓度达到
",-
365
%
N
时!原生质体产量和活力均达到最高值!且显
表
>
!
B&3C3(0&DE
和
$&9)#*0&5F=>
各个水平之间的多重比较
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5?=63
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4L/06104361
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5?]?506<
D?5:540?IJ41@E?=M/140?B)!%
因素
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水平
N?]?5
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E?=M/10?B)!% %"!$,"+;O %%#%,%-4P %"&-,#*;O
!!
注$同列不同大小写字母分别表示两种酶内各浓度水平间
","#
和
","$
水平的差异显著性
S6M?
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Z8?@/<_
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7
1/@/<66?1C
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3?0,
表
?
!
B&3C3(0&DE
处理浓度对原生质体产量和活力的影响
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L6M6
_
540M
9
/?5@041@]/4;/5/M
9
浓度
D61=?1ML4M/61
%
H
产量
B/?5@
%"
#"
+个%
7
#
活力
g/4;/5/M
9
%
H
%," !,"%P %,+!
*," #,$"O ",&#
$," #,%$O +%,#
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注$同列不同字母表示
D?5:540?IJ
各浓度水平间的差异显著
性"
!
$
","#
#
S6M?
$
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1/","#5?]?5:1@?L@/<著性高于其他处理!分别为
#,*A#"
+ 个%
7
和
%,!H
"图
%
!
P
*
D
#&当甘露醇浓度为
",-
"
",
365
%
N
时!原生质体产量和活力都随着甘露醇浓度
的升高而降低因此!(银中杨)原生质体游离最佳
甘露醇浓度为
",-365
%
N

=,>
!
不同酶解时间对原生质体分离的影响
在酶浓度和渗透压一定的条件下!设置酶解时
间分别为
!
**
-
*

*
#"
*
#!8
结果"图
!
#表明!酶解
时间对(银中杨)原生质体的产量和活力有极显著性
影响随着酶解时间的增长!原生质体产量会有所
提高!但原生质体的活力逐步降低"图
!
#酶解时
间为
!
"
8
时!原生质体产量随着酶解时间的增长
而逐渐增加!且在酶解
8
时达到最高&酶解时间超
过
8
后!原生质体产量随着酶解时间的增长而减
少!在
#!8
时原生质体产量高于
#"8
但差异不显
著!这可能是由试验误差等因素引起的&当酶解时间
为
8
时!原生质体的产量极显著性高于其他酶解
时间!达
!,#%A#"
+ 个%
7
原生质体的活力随酶解
时间的增长而逐渐降低!酶解时间为
*
"
8
时!原
图
#
!
甘露醇浓度对原生质体产量和活力的影响
[/
7
,#
!
2<_
L6M6
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540M
9
/?5@41@]/4;/5/M
9
图
!
!
酶解时间对原生质体分离的影响
[/
7
,!
!
2<9
365
9
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_
L6M6
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540M/0654M/61
!"&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
%
!
(银中杨)叶肉原生质体分离与纯化
P,
纯化前的原生质体&
O,
纯化后的原生质体&
D,
用
[bP
进行原生质体活力检测
[/
7
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!
h0654M/6141@
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L6M6
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L6M6
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540M0:0/1
7
[bP
生质体活力差异不显著&酶解时间为
#"
"
#!8
时原
生质体活力降低的幅度加大!且极显著性低于酶解
时间为
8
时的原生质体活力因此!(银中杨)叶
肉原生质体最佳游离时间为
8

=,?
!
蔗糖浓度和纯化方法对原生质体纯化的影响
酶解完成后分别采用不同浓度的蔗糖对酶解产
物进行等密度离心纯化!并对比上浮法和下沉法的
纯化效果"表
$
#由表
$
可知!上浮法的纯化效果
明显优于下沉法随着蔗糖浓度的增加!纯化后原
生质体产量逐渐增加!到
*$H
时产量达到最大!但
杂质含量也达到最大&而蔗糖浓度为
*"H
时原生质
体产量也很高!为
#,"-A#"
+ 个%
7
!且杂质含量较
低!为
#&,"$H
因此!采用上浮法用
*"H
蔗糖!在
#"""L
%
3/1
下离心
$3/1
!原生质体产量较高!杂质
含量较少!纯化效果较好"图
%
!
O
#
%
!
讨
!
论
原生质体分离时!材料本身的性质和生理状态
对原生质体分离甚至培养有着重要影响+#,!组织培
养的无菌苗生长整齐!生理状态比较一致!成苗期
短!经过继代培养!可保持树木的幼态特征!是分离
原生质体比较理想的材料!能提高试验的重复
性+#&,
E4La
和
J61
从黑杨
A
大青杨杂种叶片分离
获得大量有活力的原生质体!产量为
#,"*A#"
+
个%
7
+
#%
,
&而蔡肖和康向阳以小青杨无菌苗叶片为材
料!游离原生质体的产量达到
!,**A#"
+ 个%
7
+
!"
,

可见!不同树种叶肉原生质体分离效果有所差异!这
可能与其叶片结构及细胞壁组成有关本研究采用
(银中杨)培养约
%"@
的无菌苗叶片分离原生质体!
原生质体活力为
",#H
!产量为
!,#%A#"
+ 个%
7
!
表
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!
蔗糖浓度及纯化方法对原生质体纯化效果的影响
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蔗糖浓度
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H
产量
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#"
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杂质含量
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下沉法
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上浮法
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%$ ",*# #&,$#
*" #,"- #&,"$
*$ #,! !&,#+
对照
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(
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!
%,*
可以满足进一步进行原生质体培养的要求
影响原生质体分离效果的因素有很多!酶的种
类与浓度影响最大
D61@?
和
J41M60
对比了
D?5:)
540?IJ
和
D?5:540?I)#"
对小叶榆"
=%/$&/,-"+
K/5,
#叶肉原生质体分离的影响!发现
D?5:540?IJ
分离效率更高+#&,景艳春等进行新疆杨"
!)%(
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+/,2%,&
#叶肉原生质体游离时酶液中添
加了
",$H V?3/=?5:540?
!产量可达
#,$+A#"
+
个%
7
+
!#
,
!而本研究中(银中杨)叶肉原生质体分离在
未添加
V?3/=?5:540?
情况下!产量远高于前者!达
!,#%A#"
+ 个%
7
可见!不同酶种类对原生质体分
离效果影响不同!不同树种原生质体分离所需要的
酶种类及浓度也有所差异!这可能与其细胞壁组成
成分有关本研究通过正交试验设计和单因素简单
试验设计!筛选出最佳酶组合为
%HD?5:540?IJG
",$H K4=?L6C
9
3?I)#"G",%HE?=M/10?B)!%

为保持原生质体膜稳定性!常常在酶液中加入
%"&#
&
期 宋少宇!等$三倍体(银中杨)叶肉原生质体制备的优化
甘露醇作为渗透压调节剂不同植物原生质体分离
时采用的甘露醇浓度也有所差异!一般浓度为
",%
"
",365
%
N
拟南芥"
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#
&,&.0%,-
#叶肉
原生质体分离时甘露醇浓度为
",*365
%
N
+
!!
,
!王善
平等在分离毛白杨原生质时甘露醇浓度则为
",$
365
%
N
+

,
而本研究中(银中杨)叶肉原生质体分离
适宜的甘露醇浓度为
",-365
%
N
!与王善平所采用
的甘露醇浓度有所不同!这可能是由于不同植物细
胞质浓度有所差异
酶解时间的长短对于获得原生质体的产量和活
力影响很大酶解时间短!则酶解不够充分!原生质
体产量低&酶解时间过长!对原生质体有毒害作用!
导致原生质体产量和活力降低+!%,百合"
@,%,$/
%*2*("$+,,O/600,
#叶片原生质体分离需要
!*8
+
!%
,
!
毛白杨叶肉原生质体分离需要
#!
"
#*8
+

,
!而本研
究中(银中杨)叶肉原生质体分离最佳酶解时间则为
8
可见!不同植物和材料对酶解时间的需求有所
差异酶解时间可能与起始材料*酶的种类和浓度
等因素有关!应根据具体情况进行探索另外!在本
研究中酶解
#!8
原生质体产量高于酶解
#"8
!但差
异不显著!在他人的研究结果中未发现类似情况!这
可能是由试验误差等因素引起的数据小幅度波动
原生质体纯化方法是影响原生质体产量和活力
的重要因素之一景艳春等进行新疆杨原生质体纯
化时!采用上浮法蔗糖浓度为
%"H
时纯化效果最
好+!#,然而!在(银中杨)叶肉原生质体纯化时!上
浮法蔗糖浓度为
*"H
时!纯化效果最好!产量达
#,"-A#"
+ 个%
7
可见!不同树种原生质体纯化方
法有所不同!这可能是因为其细胞大小*密度等有所
差异!纯化过程中细胞所受的离心力不同
许多杨树品种都是三倍体!杨树三倍体生殖能
力降低!材积的增益更大!在速生性*材质*抗逆性以
及对病虫害的防御能力方面具有明显优势+!*,原
生质体是理想的基因工程受体!利用转基因技术对
三倍体进行遗传改良有可能极大地提高抗性和木材
品质等三倍体原生质体的获得有利于通过功能基
因瞬时表达分析进行多倍体数量性状表达相关研
究!以及三倍体细胞内信号通路等研究同时!三倍
体与二倍体或三倍体细胞进行融合可获得五*六倍
体杂种!为育种工作提供遗传材料加强对三倍体
杨树的细胞工程及基因工程育种技术研究!可以为
育种工作提供新的途径和遗传材料!具有重要意义
参考文献#
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