全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(２): １１３￣１２０(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０５￣０９ꎻ 修回日期: ２０１４￣０１￣１５
基金项目: 江苏省出入境检验检疫局科技项目(２０１０ＫＪ０７)
通讯作者: 郑小波ꎬ教授ꎬ主要从事植物病原真菌分子生物学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｘｂｚｈｅｎｇ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 纪 睿ꎬ女ꎬ农艺师ꎬ主要从事植物检疫学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｊｉｒｕｉ０３＠ｙａｈｏｏ.ｃｏｍ.ｃｎꎮ
雪松疫霉(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ)的快速分子检测
纪 睿１ꎬ 王健生２ꎬ 廖太林１ꎬ 李百胜１ꎬ 张正光２ꎬ 郑小波２∗
( １昆山出入境检验检疫局ꎬ 昆山 ２１５３００ꎻ ２ 南京农业大学植物保护学院 /农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室ꎬ 南京 ２１００９５)
摘要:由雪松疫霉(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ)引起的疫病是一类植物检疫性病害ꎮ 为建立该病原菌的快速检测技术ꎬ本文比较
分析了雪松疫霉和其他疫霉的 ｔＲＮＡ序列ꎬ在此基础上设计了一对检测雪松疫霉的特异性引物 Ｔ１ / Ｔ２ꎬ该对引物从雪松疫
霉中扩增得到 １条 １９２ ｂｐ的条带ꎬ而其他 １５种疫霉和其他真菌菌株均无扩增条带ꎬ表明该对引物对雪松疫霉具有特异性ꎮ
在 ２５ μＬ ＰＣＲ反应体系中ꎬ引物 Ｔ１ / Ｔ２检测灵敏度为 １０ ｐｇ基因组 ＤＮＡꎻ而以引物 Ｔ３ / Ｔ４和 Ｔ１ / Ｔ２进行巢式 ＰＣＲ扩增ꎬ能
够检测到 １ ｆｇ基因组 ＤＮＡꎬ使检测灵敏度提高了 １０ ０００倍ꎮ 该检测体系对灭菌水中游动孢子的检测灵敏度可达 ０. ５个游
动孢子ꎬ对人工接种发病的植物组织能够特异性地检测到该病原菌ꎮ 此外ꎬ进一步建立了该病原菌的实时荧光定量 ＰＣＲ
检测体系ꎮ
关键词:雪松疫霉ꎻ 分子检测ꎻ ＰＣＲ
Ｒａｐｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ ｂｙ ＰＣＲ　 ＪＩ Ｒｕｉ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ￣ｓｈｅｎｇ２ꎬ
ＬＩＡＯ Ｔａｉ￣ｌｉｎ１ꎬ ＬＩ Ｂａｉ￣ｓｈｅｎｇ１ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ￣ｇｕａｎｇ２ꎬ ＺＨＥＮＧ Ｘｉａｏ￣ｂｏ２ 　 ( １ Ｋｕｎｓｈａｎ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｋｕｎｓｈａｎ ２１５３００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ
Ｃｒｏｐ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｐｅｓｔ Ｉｎｓｅｃｔｓꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ ｗｅｒｅ ｒｉｓｋｙ ａｎｄ ｑｕａｒａｎｔｉｎａｂｌｅ. Ａ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ
ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｏｏｍｙｃｅｔｅ Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗａｓ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ.ꎬ ａ
ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｔ１ / Ｔ２ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ. Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １５ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ
ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓꎻ Ｔ１ / Ｔ２ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｏｎｌｙ ａ ｕｎｉｑｕｅ １９２ ｂｐ ｂａｎｄ ｆｒｏｍ
Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ. Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｔ１ / Ｔ２ ｗａｓ １０ ｐｇ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｉｎ ２５ μＬ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ. Ａ
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｕｓｉｎｇ Ｔ３ / Ｔ４ ａｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ￣ｒｏｕｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｗｉｔｈ Ｔ１ / Ｔ２ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ １０ ０００￣ｆｏｌｄ ｔｏ １ ｆｇ. Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ ｉｎ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ｗａｓ ０.５ ｚｏｏｓｐｏｒｅ. Ｔｈｅ
ｄｕｐｌｅｘ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ (Ｔ１ / Ｔ２ ａｎｄ Ｔ３ / Ｔ４) ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ
ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｗｅｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ
ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒ ｔｈｅ Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４１￣３０　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０２￣０１１３￣０８
　 　 雪松疫霉根腐病菌 ( Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ
Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ Ｍｉｂｒａｔｈ)能引起雪松根部腐烂病ꎮ 该病
害 １９２０年在美国华盛顿西雅图首次发现[１]ꎮ 该病
菌在世界广泛分布[２]ꎬ２０１０ 年在我国台湾首次报
道[３]ꎬ大陆地区尚未发现ꎬ是一类危险性植物检疫
性病害ꎮ 雪松疫霉根腐病菌不仅危害雪松ꎬ还可以
　
植物病理学报 ４４卷
侵染美国扁柏、短叶红豆杉、美国尖叶扁柏、猕猴
桃、扁柏、杜松、侧柏、杜鹃花属植物[４]ꎮ
该病害诊断困难ꎬ按常规方法分离会产生杂
菌ꎬ影响病原菌的准确分离ꎮ 疫霉形态特征复杂ꎬ
变异快ꎬ且 Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ 与其他病原菌如 Ｐ􀆰 ｃｉｎｎａ￣
ｍｏｍｉ、Ｐ􀆰 ｇｏｎａｐｏｄｙｉｄｅｓ 难以区分[５]ꎮ 常规的病害
诊断技术难以快速准确鉴定该病原菌ꎮ 随着分子
生物学技术的发展ꎬ国内外对疫霉的分子检测进行
了广泛研究[６~１４]ꎮ 由于 ｔＲＮＡ 序列在真菌(卵菌)
种间高度变异ꎬ而在种内稳定ꎬ因此该序列为病原
菌的分子检测提供了理想的靶序列ꎮ 本研究分析
比较了雪松疫霉与其他疫霉的 ｔＲＮＡ 序列ꎬ旨在通
过设计检测雪松疫霉的特异性引物ꎬ结合 ＰＣＲ 技
术ꎬ建立一套快速、高灵敏度、稳定可靠的雪松疫霉
分子检测技术ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试菌株、寄主及来源
本研究所用菌株及相关信息见表 １ꎮ
１.２　 培养基
１０％ Ｖ８培养基: １００ ｍＬ Ｖ８汁ꎬＣａＣＯ３ ０.２ ｇꎬ
加水定容至 １ Ｌ[１５]ꎮ ＰＤＡ培养基 (Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ
Ａｇａｒ): 琼脂粉 ２０ ｇꎬ 马铃薯 ２００ ｇꎬ 葡萄糖 ２０ ｇꎬ
加水定容至 １ Ｌꎮ
１.３　 菌丝体培养与收集
将供试疫霉菌株转至 Ｖ８ 固体培养基平板上ꎬ
２０℃黑暗培养 ３ ｄ后从菌落边缘切取 １０ 块(２ ｍｍ
×２ ｍｍ)菌落块ꎬ转至 Ｖ８ 液体培养基ꎬ２５℃振荡培
养 ５~７ ｄꎬ过滤收集菌丝ꎬ经冷冻抽干、研磨成粉ꎬ
－２０℃保存备用ꎮ
１.４　 菌丝 ＤＮＡ的提取
参考 Ｒｉｓｔａｉｎｏ等[１６]方法稍加改进ꎮ 取少量菌
丝粉ꎬ加 ９００ μＬ ２％ ＣＴＡＢ 提取液和 ９０ μＬ １０％
ＳＤＳꎬ漩涡混匀ꎬ于 ５５℃水浴 １ ｈꎬ期间每 １０ ｍｉｎ 上
下颠倒几次ꎮ １２ ０００ ｇ离心 １０ ｍｉｎꎬ取上清加等体
积酚 /氯仿 /异戊醇(２５ ∶ ２４ ∶ １)ꎬ颠倒混匀ꎬ１２ ０００
ｇ离心 １０ ｍｉｎꎬ将上清液移至新管ꎬ加等体积氯仿ꎬ
轻轻颠倒混匀ꎬ１２ ０００ ｇ 离心 ５ ｍｉｎꎮ 上清转移至
新管中ꎬ加 ２ 倍体积的无水乙醇和 １ / １０ 体积的 ３
ｍｏｌ / Ｌ ＮａＡｃ (ｐＨ ５.２)ꎬ－２０℃沉淀(>１ ｈ)ꎮ １２ ０００
ｇ离心 １０ ｍｉｎꎬ倾去上清ꎬ 沉淀用 ７０％乙醇洗涤 ２
次ꎬ室温晾干ꎮ 加适量灭菌超纯水或 ＴＥ (ｐＨ ８.０)
溶解沉淀(含 ２０ μｇ / ｍＬ ＲＮａｓｅ)ꎬ３７℃处理 １ ｈ
后ꎬ－２０℃ 保存备用ꎮ
１.５　 游动孢子液 ＤＮＡ的提取
参照 Ｚｈｅｎｇ[１５]的方法诱导 Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ 释放游
动孢子ꎮ 游动孢子 ＤＮＡ 粗提方法:在 ６０ μＬ 无菌
水中加入 ６０个游动孢子(显微镜下直接计数) ꎬ加
０.０５ ｇ 石英砂ꎬ在涡旋器上剧烈振荡 ３ ｍｉｎꎬ稍离
心ꎬ上清液即为游动孢子 ＤＮＡ 粗提液ꎬ分别取 ０.５
~１０ μＬ上清液直接作为模板进行 ＰＣＲ扩增ꎮ
１.６　 发病植物组织 ＤＮＡ的提取
将供试疫霉转至 Ｖ８ 固体平板上ꎬ２０℃黑暗培
养 ３ ｄ后从菌落边缘切取 ３块(２ ｍｍ×２ ｍｍ)菌落
块ꎬ创伤接种于美国扁柏上ꎮ ２０℃黑暗保湿培养ꎬ
一段时间后切取发病组织参考 Ｗａｎｇ 等[１７] 的
ＮａＯＨ法(稍加改进)提取基因组 ＤＮＡꎮ 具体操
作:取一段发病的植株组织ꎬ每毫克组织加入 １０
μＬ ０.５ ｍｏｌ / Ｌ ＮａＯＨꎬ在研钵中充分研磨后转移至
１.５ ｍＬ的 ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中ꎬ１２ ０００ ｇ 离心 ５ ｍｉｎꎬ取
５ μＬ 上清液加入 ４９５ μＬ ０. １ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ ( ｐＨ
８􀆰 ０) ꎬ混匀后取 １ μＬ直接用于 ＰＣＲ 反应ꎮ
１.７　 引物的设计
１.７.１　 特异性引物 Ｔ１ / Ｔ２的设计　 对 ＧｅｎＢａｎｋ 中
的 Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ和其他疫霉中的 ｔＲＮＡ 序列进行比
较分析(图 １)ꎬ设计了一对特异性引物 Ｔ１ / Ｔ２ꎬ序
列为:Ｔ１ (５′￣ＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＡＧＡＴ￣３′)和
Ｔ２(５′￣ＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＡＴ￣３′)ꎮ 设计的引
物重新在 ＧｅｎＢａｎｋ中 ＢＬＡＳＴ分析验证其特异性ꎮ
１.７. ２ 　 巢式 ＰＣＲ 外引物 Ｔ３ / Ｔ４ 的设计 　 根据
Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ的 ｔＲＮＡ 序列ꎬ使此引物在特异性引物
外侧ꎬ设计一对外引物 Ｔ３ / Ｔ４ꎬ序列为:Ｔ３(５′￣ＧＴ￣
ＴＣＧＡＡＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＣ￣３′)和 Ｔ４ (５′￣ＣＡＡＣＡ￣
ＡＡＴＴＴＡＣＡＧＴＣＴＧＣＣＧＣ￣３′)ꎮ
４１１
　
　 ２期 纪 睿ꎬ等:雪松疫霉(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ)的快速分子检测
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｇｉ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｈｏｓｔ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｉｓｏｌａｔｅ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｐｒｉｍｅｒ Ｔ１ / Ｔ２
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｌａｗｓｏｎｉａｎａ ＵＳＡ １ ＋
Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｌａｗｓｏｎｉａｎａ ＵＳＡ １ ＋
Ｐ. ｂｏｅｈｍｅｒｉａｅ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｐ. ｃｒｙｐｔｏｇｅａ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ １ －
Ｐ. ｐａｒａｓｉｔｉｃａ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｐ. ｐａｌｍｉｖｏｒａ Ｔｒａｃｈｙｃａｒｐｕｓ ｆｏｒｔｕｎｅｉ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｐ. ｍｅｌｏｎｉｓ Ｂｅｎｉｎｃａｓａ ｈｉｓｐｉｄａ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｐ. ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｐ. ｃａｍｂｉｖｏｒａ Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｐ. ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｖａｒ. ａｌｔｉｓｓｉｍａ ＵＳＡ １ －
Ｐ. ｆｒａｇａｒｉａｅ Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｐ. ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｐ. ｈｉｂｅｒｎａｌｉｓ Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ ＵＳＡ １ －
Ｐ. ｓｏｊａｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｐ. ｃａｃｔｏｒｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｐ. ｉｎｆｅｓｔａｎｓ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｎｉｖｅｕｍ Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ Ｆｕ Ｊｉａｎ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｓｏｌａｎｉ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｅｑｕｉｓｅｔｉ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｍｏｎｉｆｏｒｍｅ Ｏｒｙｚａ ｓｔｉｖａ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｆ. ｃｕｌｍｏｒｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｆ. ｎｉｖａｌｅ Ｔｒｉｔｉｃｕｍａ ｅｓｔｉｖｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｆ. ａｖｅｎａｃｅｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｆ. ｇｒａｍｉｎｅｒｕｍ Ｔｒｉｔｉｃｕｍａ ｅｓｔｉｖｕｍ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｅｌｏｎｉｓ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) ４ －
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｒｕｎｃａｔｕｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) ５ －
Ｐｅｒｏｎｏｐｈｙｔｈｏｒａ ｌｉｔｃｈｉ Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｐｙｔｈｉｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ １ －
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｊｉａｎｇｓｕ(Ｃｈｉｎａ) １ －
　 “＋”: １９２ ｂｐ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒ Ｔ１ / Ｔ２ꎻ “－”: Ｎｏ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ.
５１１
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. １　 Ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｔ１ / Ｔ２ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｒｔｉａｌ ｔＲＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ
１.８　 ＰＣＲ扩增
常规 ＰＣＲ 扩增体系为:１０ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２. ５
μＬꎬＭｇＣｌ２ ２ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ ２.５ ｍｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰ ０.５ μＬ ꎬ
引物(２０ μｍｏｌ / Ｌ) ０ .２５ μＬꎬＴａｑ ＤＮＡ 酶(５ Ｕ /
μＬ) ０.２５ μＬꎬ模板 ０.２５ μＬꎬ扩增体系为 ２５ μＬꎬ用
灭菌水补足体积ꎮ 在 ＴａＫａＲａ ＰＣＲ 扩增仪上进行
扩增反应ꎬ反应程序为:９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４℃变
性 ３０ ｓꎬ４６℃退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸 ３０ ｓꎬ共 ３５ 个循
环ꎻ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ 巢式 ＰＣＲ 第一轮扩增用引
物 Ｔ３ / Ｔ ４ꎬ扩增体系同上ꎬ退火温度为 ６０℃ꎮ 然后
以 Ｔ１ / Ｔ２ 为特异性引物ꎬ以第一轮 ＰＣＲ 产物
(１ μＬ)为模板进行第二轮 ＰＣＲ 扩增ꎮ 体系同上ꎬ
退火温度为 ４６℃ꎬ其他参数不变ꎮ 所有试剂均购
于 ＴａＫａＲａ 公司ꎮ 取 ５ μＬ 扩增产物于 １.０％琼脂
糖凝胶中电泳(电压 ５ Ｖ / ｃｍ )ꎮ
荧光定量 ＰＣＲ 扩增体系为:１０. ０ μＬ ＳＹＢＲ
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ(２×)ꎬ０.４ μＬ ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ
ＩＩ(５０×)ꎬ引物(１０ μｍｏｌ / Ｌ)各 ０.４ μＬꎬ模板 ２ μＬꎬ
扩增体系为 ２０ μＬꎬ用灭菌水补足体积ꎮ 优化后的
反应程序为:９４℃预变性 ３０ ｓꎻ９４℃变性 ５ ｓꎬ４６℃
退火 ３４ ｓꎬ４０ 个循环ꎻ９５℃ １５ ｓꎬ６０℃ １ ｍｉｎꎬ ９５℃
１５ ｓꎬ６０℃ １５ ｓꎮ 荧光定量 ＰＣＲ 仪器为 ７５００ Ｒｅａｌ￣
Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍꎮ
２　 结果与分析
２.１　 引物特异性验证
设计的引物 Ｔ１ / Ｔ２只能从 ２个供试的 Ｐ. ｌａｔｅ￣
ｒａｌｉｓ菌株中特异地扩增出一条 １９２ ｂｐ 的条带ꎬ而
其他供试菌株及空白对照均无扩增条带 (表 １、
图 ２ ) ꎮ表明该引物具有种的特异性 ꎬ可以将
Ｆｉｇ. ２　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ￣ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｔ１ / Ｔ２
Ｌａｎｅ Ｍ: ２ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣４３: Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｓ Ｔａｂｌｅ １ꎻ Ｌａｎｅ ４４: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
６１１
　
　 ２期 纪 睿ꎬ等:雪松疫霉(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ)的快速分子检测
Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ与其他近似种及其他相关种区分开ꎮ
２.２　 引物灵敏度检测
在 ２５ μＬ的反应体系中测定了上述所建立的
检测体系的灵敏度ꎬ引物 Ｔ１ / Ｔ２ 可稳定地从 １０ ｐｇ
的基因组模板中扩增得到 １９２ ｂｐ 的特异性条带
(图 ３￣Ａ )ꎮ 而以引物 Ｔ３ / Ｔ４ 对 Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ 菌株
不同浓度的基因组 ＤＮＡ 进行 ＰＣＲ 扩增的产物为
模板ꎬ再使用特异性引物 Ｔ１ / Ｔ２ 进行第二轮巢式
ＰＣＲ扩增ꎬ可稳定地检测到 １ ｆｇ 的基因组 ＤＮＡ
(图 ３￣Ｂ )ꎬ 使检测灵敏度提高了 １０ ０００倍ꎮ
　 　 在以游动孢子为材料的基因组 ＤＮＡ 粗提液
为模板的 ＰＣＲ 反应体系中ꎬ Ｔ１ / Ｔ２ 的检测灵敏度
可达 ０.５个游动孢子(图 ４)ꎮ
２.３　 植物病组织中的病原物检测
从人工接种的植物上剪取发病组织ꎬ提取
ＤＮＡ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ发病样品均扩增出了 １９２ ｂｐ
的特异性条带 (图 ５) ꎬ而健康植株扩增不出该条
带ꎮ 说明该套技术能用于植物病组织中雪松疫霉
的快速分子检测ꎮ
２.４　 基因组 ＤＮＡ实时定量 ＰＣＲ及标准曲线建立
用引物 Ｔ１ / Ｔ２ 对 Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ 基因组 ＤＮＡ 的
１０倍梯度稀释液进行 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ＰＣＲ 扩增ꎮ
结果表明ꎬ该体系的检测下限为 １００ ｆｇ / μＬ 基因组
ＤＮＡꎮ Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ 基因组 ＤＮＡ 的 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
Ｉ ＰＣＲ 标准曲线显示: ＤＮＡ 量(ｐｇ)的对数(ｘ)和
对应的 Ｃｔ 值 (ｙ)之间呈线性关系: Ｙ ＝ －４.０５ｘ＋
４３.３６ꎬ Ｒ２ ＝０.９７(图 ６)ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ
Ａ: Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓꎻ Ｂ: Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ. Ｌａｎｅ Ｍ: ２ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣１０: ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ １０ ｎｇꎬ １ ｎｇꎬ １００ ｐｇꎬ １０ ｐｇꎬ
１ ｐｇꎬ １００ ｆｇꎬ １０ ｆｇꎬ １ ｆｇꎬ １００ ａｇ ａｎｄ １０ ａｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡꎻ Ｌａｎｅ１１: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
Ｆｉｇ. ４　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｔ１ / Ｔ２ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ
ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｃｒｕｄｅ ｚｏｏｓｐｏｒｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ
Ｌａｎｅ Ｍ: ２ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣１１: ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｃｒｕｄｅ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ０.５ ꎬ １ ꎬ ２ ꎬ ３ ꎬ ４ ꎬ ５ ꎬ ６ ꎬ ７ ꎬ ８ ꎬ ９
ａｎｄ １０ μＬ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｗｉｔｈ １ ｚｏｏｓｐｏｒｅ / μＬꎻ Ｌａｎｅ１２: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
７１１
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ５　 Ｓｉｎｇｌｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ
ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｔ１ / Ｔ２
Ｌａｎｅ Ｍ: ２ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣６: ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｃｒｕｄｅ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓꎻ
Ｌａｎｅ ７: Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅꎻ Ｌａｎｅ ８: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
Ｆｉｇ. ６　 Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｏｇ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ ａｎｄ ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ(Ｃｔ) ｆｒｏｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ａｓｓａｙ
３　 结论与讨论
本研究根据 ｔＲＮＡ 序列的差异建立了一套快
速、灵敏、高效的基于 ＰＣＲ 的检测 Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ
的方法ꎬ该方法可从发病的植物组织中检测出
Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓꎮ
转移核糖核酸( ｔＲＮＡ)是由线粒体 ＤＮＡ 基因
编码ꎬ线粒体 ＤＮＡ 属母系遗传ꎬ进化速率较核基
因快且基因组结构相对简单[１８]ꎬ作为理想的分子
标记广泛应用于群体遗传学及分子系统学研
究[１９]ꎮ 以 ｔＲＮＡ基因和其间隔区为靶点ꎬ在种和
亚种水平上鉴定菌株具有重要的应用价值[２０]ꎮ 本
研究以 ｔＲＮＡ 序列为靶点ꎬ首次应用于卵菌
Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ的鉴定ꎬ并建立起一套快速、灵敏、高效
的检测技术ꎮ
特异性是检测一种特定病原菌所必需的条件ꎮ
本文对从 ＧｅｎＢａｎｋ中得到 Ｐ. ｌａｔｅｒａｌｉｓ 和其他疫霉
种的 ｔＲＮＡ序列进行分析ꎬ设计了一对特异性引物
Ｔ１ / Ｔ２ꎬ利用该引物对其他 １５ 种疫霉和其他真菌
进行特异性扩增ꎬ发现只能从 Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ 中扩增
得到 １ 条 １９２ ｂｐ 的条带ꎬ其他菌株均无扩增条带
出现ꎬ表明该对引物具有种的特异性ꎮ
高灵敏度是病原菌检测的一个重要指标ꎬ它关
系到能否把 ＰＣＲ快速检测技术直接应用在出入境
植物和植物产品的检验检疫中ꎮ 在 ２５ μＬ 反应体
系中ꎬ普通的 ＰＣＲ方法能检测到 １０ ｐｇ Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ
基因组 ＤＮＡ (图 ３￣Ａ )ꎮ 有报道巢式 ＰＣＲ能把检
测灵敏度提高 １０~ １ ０００ 倍[６ꎬ １２ꎬ ２１ꎬ ２６ꎬ ２７]ꎬ而本研究
采用巢式 ＰＣＲ 技术将检测 Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ 基因组
ＤＮＡ的灵敏度提高到了 １ ｆｇꎬ效率提高了 １０ ０００
倍ꎬ这对于靶标病原物的量非常低或存在 ＰＣＲ 抑
制物时非常重要ꎮ 而在其他疫霉的分子检测中ꎬ灵
敏度只能到 １ ｐｇ 的 Ｐ. ｃａｐｓｉｃｉ 基因组 ＤＮＡ[６ꎬ １１]、
１０ ｐｇ 的 Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎａ 和 Ｐ. ｃｉｔｒｏｐｈｔｈｏｒａ 基因组
ＤＮＡ[１１]和 ２.５ ｐｇ的 Ｐ􀆰 ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ基因组 ＤＮＡ[１２]ꎬ
８１１
　
　 ２期 纪 睿ꎬ等:雪松疫霉(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ)的快速分子检测
这表明本研究设计的引物具有很高的灵敏度ꎮ
游动孢子能通过灌溉水传播和侵染寄主ꎬ因此
是分子检测的另一个重要对象ꎮ 本研究建立的体
系中ꎬ检测 Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ的灵敏度达到了 ０.５个游动
孢子ꎬ但条带的亮度与模板游动孢子的数目并不成
线性关系ꎬ其原因可能是提取的游动孢子粗提液中
含有 ＰＣＲ的抑制物ꎮ 该体系的高灵敏度表明ꎬ 这
种方法可以用于发病植物中病原物的分子检测ꎬ能
达到检验检疫的目的和要求ꎮ 对发病植株进行检
测时ꎬ结合简单的 ＤＮＡ 提取方法使用特异引物
Ｔ１ / Ｔ２进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ１ 个工作日就可以判断植
物是否被 Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ 侵染ꎮ 使用 ＮａＯＨ裂解法 ３０
ｍｉｎ之内即可得到病组织中病原菌的 ＤＮＡ 用于
ＰＣＲ扩增ꎬ而使用传统的方法检测至少需要 ２周ꎮ
发病植株中病原菌的精确定量对制定防治策
略及防治时机极为重要ꎬ为此本研究建立了
Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓ的实时定量 ＰＣＲ 检测体系ꎬ这对雪松
疫霉根腐病的实时监测和制定防治策略具有重要
的指导意义ꎮ 在采用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光染料进行
的实时定量 ＰＣＲ 检测体系中ꎬ熔解曲线表明ꎬ在
７７℃位置有个单一明显的峰值(数据未显示)ꎬ说
明优化后的 ＰＣＲ体系和程序避免了因非特异性扩
增及引物二聚体等因素造成的非特异性条带ꎬ提高
了检测的准确性ꎮ
本文通过设计一对特异性引物 Ｔ１ / Ｔ２ꎬ结合
ＰＣＲ扩增的方法可以有效地检测植物组织中的
Ｐ􀆰 ｌａｔｅｒａｌｉｓꎮ 此方法具有准确、快速、简单易操作
等优点ꎬ可以在病害侵染初期鉴定出病原物ꎬ可参
考应用于出入境植物和植物产品的检验检疫和田
间调查ꎬ对控制雪松疫霉传入我国具有重要意义ꎮ
同时ꎬ该体系的建立也为其他病原菌的检测提供了
技术指导和理论依据ꎮ
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责任编辑:于金枝
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