全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(２): １５６￣１６２(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０１￣１０ꎻ 修回日期: ２０１３￣１１￣１５
基金项目: 山东省良种工程项目 (２００８￣２０１０)ꎻ 山东省教育厅科技计划项目(Ｊ９８Ｂ０１)
通讯作者: 丁爱云ꎬ教授ꎬ主要从事植物细菌及生物防治研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ａｙｄｉｎｇ＠ｓｄａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 王清海ꎬ男ꎬ山东嘉祥人ꎬ工程师ꎬ主要从事资源微生物应用研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｑｈｈａｉ＠１２６.ｃｏｍꎮ
拮抗链霉菌 Ｒ１５ β￣葡萄糖苷酶的纯化及特性研究
王清海１ꎬ２ꎬ 金 莹３ꎬ 万平平４ꎬ 韩玉梅５ꎬ 李安娜１ꎬ 丁爱云１∗
( １山东农业大学植物保护学院ꎬ 泰安 ２７１０１８ꎻ ２山东省林业科学研究院森林保护与生物药物研究所ꎬ 济南 ２５００１４ꎻ
３黄岛出入境检验检疫局ꎬ 青岛 ２６６５５５ꎻ ４济南市园林局ꎬ 济南 ２５００００ꎻ ５山东菏泽市曹县环保局ꎬ 菏泽 ２７４４００)
摘要:从山东泰安郊区大白菜植株根际土壤中分离筛选获得一株拮抗链霉菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ. )Ｒ１５菌株ꎮ 采用固体发酵、
粗酶液 (ＮＨ４) ２ＳＯ４ 分级沉淀、ＤＥＡＥ￣５２ 阴离子交换柱层析和 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ 凝胶柱层析等步骤从链霉菌( Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｐｐ.)Ｒ１５中分离纯化获得 β￣葡萄糖苷酶ꎮ 结果表明ꎬ纯化倍数 １６.２８ꎬ回收率为 １４.５９％ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳测得相对分子量为
６３􀆰 ８９ ｋＤａꎮ 经 ＴＬＣ分析酶解产物ꎬβ￣葡萄糖苷酶与水杨苷反应生成 Ｄ￣葡萄糖和水杨醇ꎮ 以水杨苷为底物时ꎬ该酶的 Ｋｍ
值为 １０.６４４ ｍｍｏｌ / ＬꎬＶｍａｘ为 ０.５２５ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１􀅰ｍｉｎ－１ꎮ 该酶的最适温度为 ６５℃ꎬ７０℃以下相对稳定ꎻ最适 ｐＨ为 ５ꎬｐＨ ３~
７之间相对酶活在 ７５％以上ꎮ Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋和 Ｆｅ２＋对酶有抑制作用ꎬ其中 Ｈｇ２＋和 Ｃｕ２＋的抑制作用最强ꎬ酶活力完全丧失ꎻ而
Ｃａ２＋ꎬＭｎ２＋对酶均有激活作用ꎬ相对酶活分别高达 １３７.１８％和 １１９.５２％ꎮ
关键词:链霉菌ꎻ β￣葡萄糖苷酶ꎻ 纯化ꎻ 特性ꎻ 酶解产物
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ.Ｒ１５ 　 ＷＡＮＧ
Ｑｉｎｇ￣ｈａｉ１ꎬ２ꎬ ＪＩＮ Ｙｉｎｇ３ꎬ ＷＡＮ Ｐｉｎｇ￣ｐｉｎｇ４ꎬ ＨＡＮ Ｙｕ￣ｍｅｉ５ꎬ ＬＩ Ａｎ￣ｎａ１ꎬ ＤＩＮＧ Ａｉ￣ｙｕｎ１ 　 ( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏ￣
ｔｅｃｔｉｏｎ ꎬＳｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔａｉａｎ ２７１０１８ꎬＣｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏ￣ｄｒｕｇｇｅｒｙꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ
Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙꎬ Ｊｉ ｎａｎ ２５００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ ３ Ｈｕａｎｇｄａｏ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｑｉｎｇｄａｏ
２６６５５５ꎬＣｈｉｎａꎻ ４ Ｊｉｎａｎ Ｃｉｔｙ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｐａｒｋｓꎬ Ｊｉｎａｎ ２５００００ꎬＣｈｉｎａꎻ ５ Ｃａｏｘｉａｎ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ ｏｆ Ｈｅｚｅ ꎬ Ｈｅｚｅ
２７４４００ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ. Ｉｔ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｓ ｃｅｌｌｏ￣
ｂｉｏｓｅ ａｎｄ ｃｅｌｌｏ￣ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅꎬ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕ￣
ｌａｓｅ. Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎꎬ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎꎬｉｏｎ￣ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ｏｎ ＤＥＡＥ￣５２ ａｎｄ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ.Ｒ１５ ｏｂａｉｎｅｄ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｈｉｎｅｓｅ ｃａｂｂａｇｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｕｒｂ ｏｆ ＴａｉａｎꎬＳｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｌｄ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｗｅｒｅ１６.２８ ａｎｄ １４.５９％ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎ￣
ｚｙｍｅ ｗａｓ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ６３.８９ ｋＤａ ｂｙ １２％ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ. Ｔｏ ｍａｋｅ ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ＴＬＣꎬ
β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｃａｎ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｓａｌｉｃｉｎ ｔｏ ｆｏｒｍ Ｄ￣ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｓａｌｉｃｙｌ ａｌｃｏｈｏｌꎬ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ β￣
ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ. Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｏｆ ｓａｌｉｃｉｎ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅꎬ ｔｈｅ Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｗｅｒｅ １０.６４４ ｍｍｏｌ / Ｌ
ａｎｄ ０.５２５ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１􀅰ｍｉｎ－１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ６５℃ꎬ ｔｈｅ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｗａｓ ｍｏｒｅ
ｓｔａｂｌｅ ｗｈｅｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ７０℃. Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｗａｓ ５ꎬ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ７５％
ｗｈｅｎ ｐＨ ｗａｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ３ ａｎｄ ７.Ｃｕ２＋ꎬ Ｈｇ２＋ ａｎｄ Ｆｅ２＋ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅꎬ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ａｃ￣
ｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ０ꎬ ３.６０％ꎬ ６２.９８％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｇ２＋ꎬ Ｃｕ２＋ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅｍꎬ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｌｏｓｔ. Ｃａ２＋ꎬ Ｍｎ２＋ ｃｏｕｌｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ １３７.１８％ ａｎｄ
１１９.５２％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｆｅ３＋ꎬ Ｂａ２＋ꎬ Ｍｇ２＋ꎬ Ｋ＋ꎬ Ａｌ３＋ ａｎｄ Ｚｎ２＋ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ
　
　 ２期 王清海ꎬ等:拮抗链霉菌 Ｒ１５β￣葡萄糖苷酶的纯化及特性研究
Ｐ<０.０５.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓꎻ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅꎻ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓꎻ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ１５４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０２￣０１５６￣０７
　 　 β￣葡萄糖苷酶(β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅꎬ ＥＣ ３.２.１.２１)是
纤维素酶系的组成酶之一ꎬ可以水解纤维二糖和低
分子量的纤维寡糖ꎬ防止纤维二糖的积累ꎬ减轻其
对纤维素酶的抑制作用ꎬ促进纤维素酶系的整体水
解活性ꎮ β￣葡萄糖苷酶主要应用于纤维素的糖化、
茶叶醇系增香以及部分癌症的诊断和治疗中[１ꎬ２]ꎮ
该酶在自然界中广泛存在ꎬ许多植物体、酵母、曲霉
菌、木霉菌、细菌、锈菌和链霉菌等中都可以产生ꎮ
因来源不同而性质各异[３~ ６]ꎮ 目前国内对该酶的
研究主要以黑曲霉和木霉为主ꎬ而对放线菌所产
β￣葡萄糖苷酶少见报道ꎮ 链霉菌 Ｒ１５是本实验室筛
选的一株具有高效、广谱拮抗活性的生防菌株ꎬ对
该菌的研究中发现 Ｒ１５可分泌 β￣葡萄糖苷酶ꎬ且酶
活性高、稳定性强ꎮ 本文主要报道了拮抗链霉菌
Ｒ１５所产 β￣葡萄糖苷酶的分离纯化方法ꎬ并对酶的
主要特性进行了研究ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 培养基
高氏一号液体培养基、ＰＤＡ培养基、固体发酵
培养基[７~８]
麸皮 ４０ ｇꎬ 玉米秸秆粉 ６０ ｇꎬ ＫＮＯ３ ０. ６％ꎬ
Ｋ２ＨＰＯ４ ０.３％ꎬＮａＣｌ ０.１５％ꎬＭｇＳＯ４ 􀅰７Ｈ２Ｏ ０. １５％ꎬ
ＦｅＳＯ４ ０.００３％ꎬＨ２Ｏ １００ ｍＬ ｐＨ ７.０ꎮ 先将玉米秸
秆粉和麸皮搅拌均匀ꎬ将配好的无机盐溶液倒入ꎬ
搅拌均匀ꎬ２５０ ｍＬ三角瓶中盛 ２０ ｇ 湿料ꎬ１２１℃灭
菌 ６０ ｍｉｎꎮ
１.２　 供试菌种
拮抗链霉菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ.)Ｒ１５菌株自山
东泰安郊区大白菜植株根际土壤分离获得ꎮ
１.３　 β￣葡萄糖苷酶的诱导
将活化的菌种 Ｒ１５用移菌环移入高氏一号液
体培养基中ꎬ３０℃ １８０ ｒｐｍ 振荡培养 ３ ｄꎮ 在无菌
条件下ꎬ将种子液接种到固体发酵培养基中ꎬ搅匀ꎬ
置光照培养箱中ꎬ３０℃培养ꎮ
１.４　 酶活性的测定
　 　 参照文献[７]进行ꎮ
１.５　 最佳产酶时间的确定
按上述条件接种 １０ 瓶固体发酵培养基ꎬ５ ｄ
后每天取样 １瓶ꎬ按固体:液体 １:５ 去离子水 ３０℃
浸泡 １ ｈꎬ中间振荡几次ꎬ５ ０００ ｒｐｍꎬ离心 １５ ｍｉｎꎬ
取上清液即为酶液ꎬ并测定其活性ꎮ
１.６　 β￣葡萄糖苷酶的纯化
在提取的粗酶液中加入固体(ＮＨ４) ２ＳＯ４ 至
１０％饱和度ꎬ４℃静置过夜ꎬ８ ０００ ｒｐｍ离心 １５ ｍｉｎꎬ
弃去沉淀ꎻ然后再用 ７０％饱和度的(ＮＨ４) ２ＳＯ４ 沉
淀盐析ꎬ８ ０００ ｒｐｍ离心 １５ ｍｉｎꎬ弃去上清ꎮ 用适量
的缓冲溶液 Ａ (５０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ 缓冲液ꎬｐＨ
７􀆰 ０)回溶ꎬ并在相同的缓冲溶液中透析 ２４ ｈꎬ中间
不断变换缓冲液ꎬ直至检测不出 ＳＯ４ ２
－为止ꎬ８ ０００
ｒｐｍꎬ离心 １５ ｍｉｎꎬ取上清液ꎮ 将上清液施于经缓
冲液 Ａ平衡好的 ＤＥＡＥ￣５２ 柱(１.６ ｃｍ×２０ ｃｍ)ꎬ酶
蛋白先用 ５ 倍柱床体积的缓冲溶液 Ａ 洗脱至
Ａ２８０不变后ꎬ再用 ５０ ｍＬ缓冲溶液 Ａ 和 ５０ ｍＬ含
０.３ ｍｏｌ / Ｌ、０.５ ｍｏｌ / Ｌ、１.０ ｍｏｌ / ＬＮａＣｌ 的相同缓冲
溶液进行梯度洗脱ꎬ流速为 ２.４ ｍＬ / ｍｉｎꎬ每 ５ ｍＬ
收集 １ 管ꎮ 进行酶活力测定ꎬ收集具有 β￣葡萄糖
苷酶活性的部分ꎮ 将收集到具有 β￣葡萄糖苷酶活
性的部分ꎬ用聚乙二醇 ６ ０００ 包埋浓缩至 ２ ｍＬꎬ进
行葡聚糖凝胶 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ 凝胶层析ꎬ(１.０ ｃｍ×
１００ ｃｍ)ꎬ用缓冲溶液 Ａ 洗脱ꎬ流速 ０.３ ｍＬ / ｍｉｎꎬ６
ｍｉｎ收集 １管ꎬ对具有 β￣葡萄糖苷酶活性的部分用
聚丙烯酰胺凝胶电泳(ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ)确定纯度ꎮ
１.７　 蛋白质浓度的测定[１０]
采用考马斯亮蓝 Ｇ￣２５０ 法测蛋白含量ꎬ以牛
血清蛋白做标准曲线ꎮ
１.８　 蛋白质分子量的测定(ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ)
１.９　 β￣葡萄糖苷酶的部分特性研究
１.９.１　 酶解产物分析　 将配好的含 １.１ ｍｇ / ｍＬ 水
７５１
　
植物病理学报 ４４卷
杨苷的 ｐＨ ４.８醋酸缓冲溶液与 ０.１ ｍＬ 酶液混合ꎬ
５０℃反应 ３０ ｍｉｎꎬ然后取反应液进行薄层层析
(ＴＬＣ)ꎮ 所用糖溶液为 １０ ｍｇ / ｍＬ的葡萄糖溶液、
水杨苷溶液ꎮ 使用硅胶 ＧＦ 制作的薄层层析预制
板ꎮ 展开剂 ∶ 氯仿 ∶ 冰醋酸 ∶ 水 ＝ １８ ∶ ２１ ∶ ３(Ｖ /
Ｖ)ꎬ显色液为:苯胺￣二苯胺￣磷酸显色剂丙酮溶液ꎮ
１.９.２　 温度对酶活性的影响及其热稳定性 　 在
２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５ 和 ８０℃
下测酶活性ꎬ确定温度对酶活性的影响ꎻ酶液在上
述温度中保温 ３０ ｍｉｎ 后ꎬ立即冰浴ꎬ５０℃下测酶活
性ꎬ确定热稳定性ꎮ
１.９.３　 ｐＨ 值对酶活性的影响及其酸碱稳定性 　
配制 ｐＨ分别为 ３、４、５、６、７ 和 ８ 的广泛缓冲液ꎬ分
别取 ０.１ ｍＬ 酶液ꎬ加入 ０.９ ｍＬ 水杨苷(去离子水
配 １. １ ｍｇ / ｍＬ)和 １ ｍＬ 缓冲溶液ꎬ５０℃保温 ３０
ｍｉｎꎬ测酶活性ꎻ取 ０.１ ｍＬ 酶液在 １ ｍＬ 缓冲溶液
中室温下保温 ３０ ｍｉｎꎬ调整 ｐＨ 值至 ５.０ꎬ测酶活
性ꎬ确定酸碱稳定性ꎮ
１.９.４　 金属离子对酶活性的影响　 在试管中加入
０.９ ｍＬ含水杨苷 １.１ ｍｇ / ｍＬ 的 ｐＨ ４.８ 醋酸缓冲
溶液ꎬ０.１ ｍＬ 酶液ꎬ１ ｍＬ１０ ｍｍｏｌ / Ｌ 的化合物溶
液ꎬ使各反应体系中化合物的浓度分别为 ５. ０
ｍｍｏｌ / Ｌꎬ５０℃反应 ３０ ｍｉｎꎬ以蒸馏水为对照ꎬ测定
各金属离子对酶活性的影响ꎬ所使用的化合物为
ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＭｎＳＯ４、 ＦｅＣｌ３、 Ｆｅ￣
ＳＯ４、ＫＣｌ、ＨｇＣｌ２、ＢａＣｌ２ 和 ＡｌＣｌ３ꎮ
１.９.５　 酶促反应动力学参数测定　 用 ｐＨ ４.８ 醋酸
缓冲溶液配制 ０.２、０.４、０.６、０.８、１.０、２.０、３.０ ｍｇ /
ｍＬ的水杨苷溶液ꎬ按 １.４测定酶活性ꎮ
根据 Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ￣Ｍｅｎｔｅｎ 方程ꎬ 并参考 Ｌｉｎ￣
ｅｗｅａｖｅｒ￣Ｂｕｒｋ作图法ꎬ测定和计算 β￣葡萄糖苷酶
酶促反应动力学参数(最大反应速度 Ｖｍａｘ、米氏
常数 Ｋｍ)ꎮ
１
ｖ
＝ １
Ｖｍａｘ
＋Ｋｍ
Ｖｍａｘ
􀅰 １
[Ｓ]
Ｖ:初速度(摩尔浓度变化 /分钟)ꎻ[Ｓ]:底物
浓度(摩尔浓度)ꎻＫｍ:米氏常数(摩尔浓度)
２　 结果与分析
２.１　 最佳产酶时间的测定
结果显示ꎬ诱导前 ６ ｄꎬＲ１５产酶量极少ꎬ从第７ｄ
开始迅速增加ꎬ直至第 ９ ｄ 达到一个高峰ꎬ第 １０ ｄ
开始下降(图 １)ꎬ故选第 ９ ｄ为最佳产酶时间ꎮ
Ｆｉｇ. １ 　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ
２.２　 酶的分离纯化
７００ ｍＬ 粗酶液经过 １０％ ~ ７０％饱和度的
(ＮＨ４)２ＳＯ４ 沉淀、回溶、透析ꎬ共得到酶液 ８４ ｍＬꎬ脱
盐后酶活回收率为 ５１.７８％ꎬ比活力为 ７１.８６ Ｕ􀅰
ｍｇ－１ꎮ 脱盐酶液经过 ＤＥＡＥ￣５２ 柱层析(图 ２)ꎬβ￣葡
萄糖苷酶在 ＮａＣｌ 浓度达到 ０.３ ｍｏｌ / Ｌ 时即被洗脱
下来ꎮ 共得到具有 β￣葡萄糖苷酶活性的酶液 ４３
ｍＬꎮ 将具有 β￣葡萄糖苷酶活性的部分浓缩至 ２
ｍＬꎬ进行葡聚糖凝胶 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ 凝胶层析(图
３)ꎬ收集到具有 β￣葡萄糖苷酶活性的酶液 ５ ｍＬꎮ 比
活力达到 ２４７.８１ Ｕ􀅰ｍｇ－１ꎮ β￣葡萄糖苷酶相对于粗
酶液纯化 １６.２８倍ꎬ酶比活力由 １５.２２ Ｕ / ｍｇ 升高至
２４７.８１ Ｕ / ｍｇꎬ酶的回收率为 １４.９５％(表 １)ꎮ
２.３　 β￣葡萄糖苷酶的性质
２.３.１　 酶解产物分析　 当展开剂距薄层层析板上
端约 １~２ ｃｍ时ꎬ停止扩展ꎬ取出用吹风机吹干ꎬ显
色剂喷雾均匀ꎬ在 １００℃烘箱中烘烤 １５ ｍｉｎ (图
４)ꎮ β￣葡萄糖苷酶作用于水杨苷的 β￣糖苷键ꎬ水
解产生 Ｄ￣葡萄糖和水杨醇ꎬ证明该纯化的蛋白为
β￣葡萄糖苷酶ꎮ
２.３.２ 　 β￣葡萄糖苷酶分子量( ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ)纯化
后的 β￣葡萄糖苷酶经 １２％的 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳分
析ꎬ经多次反复试验ꎬ与标准分子量相比ꎬ得出该
β￣葡 萄 糖 苷 酶 的 分 子 量 大 约 为 ６３. ８９ ｋＤａ
(图 ５)ꎮ
８５１
　
　 ２期 王清海ꎬ等:拮抗链霉菌 Ｒ１５β￣葡萄糖苷酶的纯化及特性研究
Ｆｉｇ. ２　 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｏｎ ＤＥＡＥ￣５２
Ｆｉｇ. ３　 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｏｎ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ. Ｒ１５
Ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ
/ ｍＬ
Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
/ ｍｇ
Ｔｏｔａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ
/ Ｕ
ＳＡ
/ Ｕ􀅰ｍｇ－１
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｏｌｄ
Ｙｉｅｌｄ
(％)
Ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ７００ ７９.０３ １ ２０３.２３ １５.２２ １.００ １００.００
７０％(ＮＨ４) ２ＳＯ４ ８４ ８.６７ ６２３.０７ ７１.８６ ４.７２ ５１.７８
ＤＥＡＥ￣５２ ４３ ３.２５ ５７０.２８ １７４.９５ １１.４９ ４７.３９
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５ ５ ０.７３ １７９.８６ ２４７.８１ １６.２８ １４.９５
２.３.３　 最适温度及其热稳定性　 β￣葡萄糖苷酶在
５０~７０℃范围内酶活性较高(图 ６)ꎬ相对酶活在
８０％以上ꎬ其最适温度为 ６５℃ꎬ超过 ７０℃酶活性下
降较大ꎬ至 ８０℃时相对酶活性仅为 ２３. ８８％ꎮ 另
外ꎬ该酶在 ７０℃以下保温 ３０ ｍｉｎ后酶活相对稳定ꎮ
７０℃时ꎬ残余酶活为 ７１.５８％ꎬ至 ７５℃时ꎬ酶活损失
率达 ８０％ꎬ８０℃时ꎬ酶活性几乎完全丧失ꎬ说明该
酶具有较好的热稳定性ꎮ
２.３.４　 最适 ｐＨ 及其酸碱稳定性　 β￣葡萄糖苷酶
在 ｐＨ ４~６之间酶活性较好ꎬ最适 ｐＨ为 ５ꎬ在 ｐＨ ６
以上酶活性下降较快ꎬ当 ｐＨ ８ 时ꎬ残余酶活仅为
１.１４７％ꎬ酶活性基本上丧失(图 ８)ꎮ ｐＨ ３~ ７ 处理
３０ ｍｉｎ后残余酶活在 ７５％以上ꎮ 当 ｐＨ 大于 ７ 以
后ꎬ酶活性下降较快(图 ９)ꎬ由此可见 Ｒ１５所产的
β￣葡萄糖苷酶在弱酸环境中较为稳定ꎮ
９５１
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ４　 Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅ ｂｙ ＴＬＣ
１: Ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎꎻ ２: Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎꎻ ３: Ｓｔａｎｄ￣
ａｒｄ ｓａｌｉｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ.
Ｆｉｇ. ５　 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ
Ｌａｎｅ １: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅꎻ Ｌａｎｅ ２:Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｋｅｒｓ.
２.３.５ 　 金属离子对酶活性的影响 　 结果表明ꎬ
Ｃｕ２＋ꎬＨｇ２＋ꎬＦｅ２＋对 β￣葡萄糖苷酶有抑制作用ꎬ其
中 Ｈｇ２＋和 Ｃｕ２＋的抑制作用最强ꎬ酶活性完全丧
失ꎬ其次为 Ｆｅ２＋ꎬ其相对酶活性分别为 ６２.９８％ꎬ而
Ｃａ２＋和 Ｍｎ２＋对酶均有激活作用ꎬ相对酶活分别高
达１３７.１８％和 １１９.５２％ꎻＭｇ２＋ꎬＺｎ２＋ꎬＦｅ３＋ꎬＫ＋ꎬＢａ２＋
和 Ａｌ３＋对酶活性在 Ｐ<０.０５ 水平上无显著性影响
(表 ２)ꎮ
Ｆｉｇ. ６　 Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉ￣
ｄａｓｅ
Ｆｉｇ. ７　 Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ
Ｆｉｇ. ８　 Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ
２.３.６　 酶动力学性质测定　 按照 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ
作图法作图(图 １０)ꎬ求得 β￣葡萄糖苷酶的动力学
常数及最大反应速度分别为 １０. ６４４ ｍｍｏｌ / Ｌ 和
０􀆰 ５２５ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１􀅰ｍｉｎ－１ꎮ
０６１
　
　 ２期 王清海ꎬ等:拮抗链霉菌 Ｒ１５β￣葡萄糖苷酶的纯化及特性研究
Ｆｉｇ. ９　 Ｔｈｅ ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ
３　 讨论
对链霉菌 Ｒ１５作用机制的研究发现ꎬ该菌株能
够以重寄生方式作用于烟草黑胫病菌、辣椒疫霉病
菌等植物病原真菌菌体上ꎬ通过分泌各种细胞壁降
解酶ꎬ破坏病原菌菌丝壁结构ꎬ引起菌丝畸变、扭
曲、菌丝壁消解[９]ꎮ 烟草黑胫病菌、辣椒疫霉病菌
的细胞壁主要组成成分为纤维素ꎬ由此可见Ｒ１５菌
株在抑菌过程中可产生纤维素酶类ꎮ 微生物所产
的 β￣葡萄糖苷酶是一种诱导酶ꎬ多采用底物诱导
法ꎮ 菌株不同采用的方法不同[１２ꎬ１４]ꎬ本研究采用
固体发酵法ꎬ产酶量大ꎬ酶活性高ꎬ试验材料便宜ꎬ
是一种值得推广的方法ꎮ 秸秆粉、麸皮中含有大量
的多糖ꎬ可以为 Ｒ１５菌株提供营养ꎬ并能够诱导 β￣
葡萄糖苷酶的产生ꎮ
β￣葡萄糖苷酶的相对分子量一般在 ４０ ~ ２５０
ｋＤａ之间ꎬ不同来源的 β￣葡萄糖苷酶的相对分子
量由于其结构和组成不同而差异很大ꎮ 郑淑霞、宛
晓春分别从黑曲霉发酵粉、黑曲霉发酵液中纯化的
β￣葡萄糖苷酶ꎬ分子量为 １１７. ５ ｋＤａ、 １２０ ｋＤａꎻ
Ｃｈｕ[１１]从嗜热毛壳菌中纯化的 β￣葡萄糖苷酶分子
量为 ７８.４ ｋＤａꎻＰｅｒｅｚ￣Ｐｏｎｓ ＪＡ[１３]通过功能互补的
浅紫链霉菌菌株所产的 β￣葡萄糖苷酶负突变株克
隆到链霉菌菌株 ＱＭ ￣Ｂ８１４ 所产 ＢＧＬ 基因 ｂｇ１３ꎮ
该酶分子量约为 ５２.６ ｋＤａꎮ 本研究纯化的 β￣葡萄
糖苷酶的分子量为 ６３.８９ ｋＤａꎬ这与 Ｐｅｒｅｚ￣Ｐｏｎｓ ＪＡ
等[１３]的研究接近ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ / (％) Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ / (％) Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ / (％)
ＣＫ １００.００±０.０００ ｃｄｅ ＣｕＳＯ４ ３.６０±０.０１１ ａ ＫＣｌ １０６.１７±０.０１５ ｅ
ＣａＣｌ２ １１９.５２±０.００７ ｆ ＺｎＳＯ４ １０３.６２±０.０１３ ｃｄｅ ＢａＣｌ２ １０４.６９±０.００３ ｄｅ
ＭｇＳＯ４ ９５.５１±０.０３３ ｃ ＦｅＣｌ３ １０４.４９±０.０８３ ｃｄ ＡｌＣｌ３ １０５.９７±０.００５ ｅ
ＭｎＳＯ４ １３７.１８±０.０１２ ｇ ＦｅＳＯ４ ６２.９８±０.００６ ｂ ＨｇＣｌ２ ０.００±０.０００ ａ
Ｔｈｅ ｄａｔａ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｂｌｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｍｅａｎｓ±ＳＥ(ｎ＝ ３)ꎻＭｅａｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ(Ｐ<０.０５) .
Ｆｉｇ. １０　 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ￣Ｂｕｒｋ ｐｏｌｔｓ ｏｆ β￣ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ
１６１
　
植物病理学报 ４４卷
　 　 Ｐｅｒｅｚ￣Ｐｏｎｓ ＪＡ等[１３]从链霉菌 ＱＭ￣Ｂ８１４ 菌株
中分离纯化的 β￣葡萄糖苷酶ꎬ以对硝基苯基￣β￣Ｄ￣
呋喃型葡萄糖苷和纤维二糖为底物ꎬ测得 Ｋｍ分别
为 ０.２７ ｍｍｏｌ / Ｌ和 ７.９ ｍｍｏｌ / Ｌꎮ 本试验以水杨苷
为底物ꎬ测得 β￣葡萄糖苷酶的 Ｋｍ为 １０.６４ ｍｍｏｌ /
Ｌꎬ最大反应速度为 ０.５２５ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１􀅰ｍｉｎ－１ꎮ Ｋｍ
较小ꎬ说明本试验纯化的 β￣葡萄糖苷酶与底物水
杨苷的亲和力较好ꎮ
烟草黑胫病菌、辣椒疫霉病菌是由致病疫霉
(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ)引起的植物病害ꎮ 致病疫
霉是重要的植物病原菌ꎬ属菌物中的卵菌ꎮ 卵菌细
胞壁的主要成份为纤维素ꎬ利用有益微生物所产纤
维素酶对卵菌引起的各种植物病害进行生物防治
存在理论上的可行性ꎮ 许多微生物所产纤维素酶
中的 β￣葡萄糖苷酶含量相对较少ꎬ活性较低ꎬ限制
了纤维素的降解效率ꎬ降低了病害防治的效果[１５]ꎮ
本试验从链霉菌 Ｒ１５菌株分离纯化的 β￣葡萄糖苷
酶具有广泛的热稳定性ꎬ酶活性较高ꎬ具有很好的
应用潜力ꎮ 有关 β￣葡萄糖苷酶的抑菌效果ꎬ晶体
结构ꎬ氨基酸序列分析及工程菌株的构建等问题需
要进一步研究ꎮ
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责任编辑:张宗英
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