全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(４): ３７０￣３７８(２０１４)
收稿日期: ２０１２￣１２￣２８ꎻ 修回日期: ２０１４￣０３￣１１
基金项目: 国家自然科学基金(３１０６０２３９)ꎻ云南省科技创新人才计划项目(２０１１ＨＢ０２６)
通讯作者: 蔡 红ꎬ教授ꎬ主要从事植物病毒及类似病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｃａｉｈｏｎｇ０６２３＠１２６.ｃｏｍ
第一作者: 万琼莲ꎬ女ꎬ云南玉溪人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｗａｎｑｌｉａｎ４５６＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０４.００５
云南花生丛枝植原体 １６Ｓ ｒＲＮＡ和核糖体
蛋白基因序列分析
万琼莲１ꎬ 杨子祥２ꎬ 王连春１ꎬ３ꎬ 蔡 红１∗ꎬ 陈海如１
( １云南农业大学植物病理重点实验室ꎬ昆明 ６５０２０１ꎻ ２云南省农业科学院热区生态农业研究所ꎬ元谋 ６５１３００ꎻ
３玉溪师范学院资源环境学院ꎬ玉溪 ６５３１００)
摘要:利用植原体 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因及核糖体蛋白基因( ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ｒｐ)通用引物对发生在云南元谋的花生丛枝病病株
ＤＮＡ进行 ＰＣＲ扩增ꎬ并对扩增片段进行序列测定ꎮ 扩增获得的云南元谋花生丛枝植原体(ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ)１６Ｓ ｒＤＮＡ、１６Ｓ￣
２３Ｓ ｒＤＮＡ和 ２３Ｓ ＤＮＡ片段总长 １ ８０６ ｂｐꎬｒｐ基因扩增片段长 １ １７１ ｂｐꎮ 云南株系与来源于台湾和海南的花生丛枝植原体
均有较高同源性ꎮ 比较 １６Ｓ ｒＤＮＡ片段ꎬ发现云南株系在 ５个位点上与来自台湾或海南的株系存在碱基差异ꎬ其中有 １ 个
位点的差异是云南元谋株系特异的ꎻ再分别比较核糖体蛋白 ｒｐｌＶ￣ｒｐｓＣ ２ 个基因所编码的氨基酸序列ꎬ发现云南株系 ｒｐｓＣ
编码的第 １９４位氨基酸与台湾和海南的株系存在差异ꎮ 经 １６Ｓ ｒＤＮＡ片段系统进化及 ｉＰｈｙＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ在线分析ꎬ表明 ＰｎＷＢ￣
ＹＮｙｍ在分类上属于 １６ＳｒＩＩ￣Ａ亚组成员ꎬ与候选种‘Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｅ’相关ꎻ基于 ｒｐ基因构建的系统进化
树表明ꎬＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ与 １６ＳｒＩＩ￣Ａ亚组各成员聚为同一亚进化支( ｉｉｉ)ꎮ
关键词:云南元谋花生丛枝ꎻ 植原体ꎻ １６Ｓ ｒＤＮＡꎻ 核糖体蛋白基因ꎻ 序列分析
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ａｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣
ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ＷＡＮ Ｑｉｏｎｇ￣ｌｉａｎ１ꎬ ＹＡＮＧ Ｚｉ￣ｘｉａｎｇ２ꎬ
ＷＡＮＧ Ｌｉａｎ￣ｃｈｕｎ１ꎬ３ꎬＣＡＩ Ｈｏｎｇ１ꎬＣＨＥＮ Ｈａｉ￣ｒｕ１ ( １ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｙｕｎｎａｎ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｉｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｅｃｏ￣ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌ￣
ｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｙｕａｎｍｏｕ ６５１３００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔꎬＹｕｘｉ Ｎｏｒｍａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹｕｘｉ ６５３１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ｆｏｒ １６Ｓ ｒＲＮＡ ａｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ( ｒｐ)
ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’￣ｂｒｏｏｍ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｙｕａｎｍｏｕ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｙｕｎ￣
ｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ. ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｂｏｕｔ １ ８０６ ｂｐ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡꎬ １６Ｓ￣２３Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ２３Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ １ １７１ ｂｐ ｏｆ ｒｐ
ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｅａｎｕｔ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｙｕａｎ￣
ｍｏｕ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’￣ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ (ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ) . Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＰｎＷＢ￣
ＹＮｙｍ ｓｈａｒｅｄ ｈｉｇｈ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ＰｎＷＢ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ ａｎｄ Ｈａｉｎａｎ. Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｆｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｔｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｔａｉｗａｎ ａｎｄ Ｈａｉｎａｎꎬ ａｎｄ
ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍꎬ ｔｈｅ ｏｎｅ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ. Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｒｐｌＶ
ａｎｄ ｒｐｓＣ ｉｎ ｒｐ ｇｅｎｅｓꎬ ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ １９４ｔｈ ｏｆ ｒｐｓＣ ｇｅｎｅ ｏｆ ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ ｗａｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｔａｉｗａｎ ａｎｄ Ｈａｉｎａｎ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎｄ ｏｎｌｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉＰｈｙＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｆｏｒ １６Ｓ
ｒＤＮＡ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ ｗａｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐ １６ＳｒＩＩ￣Ａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ
‘Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｅ’ . Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅꎬ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ ｗａｓ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｒｐ ｓｕｂｃｌａｄｅ(ｉｉｉ) ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｓｕｂｇｒｏｕｐ １６ＳｒＩＩ￣Ａ.
４期 万琼莲ꎬ等:云南花生丛枝植原体 １６Ｓ ｒＲＮＡ和核糖体蛋白基因序列分析
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｄｉｓｅａｓｅꎻ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎻ １６Ｓ ｒＤＮＡꎻ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ａｎａｌｙｓｉｓ
中图分类号: Ｓ４３２.１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０４￣０３７０￣０９
花生丛枝病是由花生丛枝植原体( Ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔ￣
ｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎬＰｎＷＢ)引起ꎬ分布于国
内外热带亚热带地区的一类重要植物病害ꎬ也是我
国南方花生产区的主要病害之一ꎮ 在我国ꎬ１９５２
年范怀忠等在广州首次报道该病ꎬ之后在海南、广
东、广西、福建、湖南、山东和台湾等地相继报道ꎬ研
究者对该病的病原、介体昆虫、发病规律和血清学
等进行了相关研究[１~４]ꎮ
花生丛枝植原体(ＰｎＷＢ)作为植原体 １６ＳｒＩＩ
组的代表株系ꎬ自发现以来已对其 １６Ｓ ｒＲＮＡ、ｒｐ、
ｓｅｃＹ、ｒｐｓＴ、ＧｒｐＥ和 ＤｎａＫ 等多个基因进行了克隆
及序列分析[５~１１]ꎬ所分析的株系均来自台湾ꎮ
２００９~ ２０１３ 年ꎬ车海彦、田国忠、李永等分别在
ＧｅｎＢａｎｋ中登录了来自海南(ＰｎＷＢ￣Ｈｎ１)、海南河
口 ( ＰｎＷＢ￣Ｈｎｈｋ２００４ ) 及 海 南 三 亚 ( ＰｎＷＢ￣
Ｈｎｓｙ２００５)的花生丛枝植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ 以及 ｒｐ
基 因 核 苷 酸 序 列 ( ＧＵ１１３１４８、 ＪＮ６８１２７３、
ＪＮ６８１２７４、ＫＣ５９３２８０、ＫＣ５９３２８１)ꎮ 除此之外ꎬ未
见其他来源的花生丛枝植原体相关基因报道ꎮ
云南元谋属金沙江干热河谷区ꎬ气候干热ꎬ素
有“天然温室”之称ꎬ是种植热带耐旱植物、果树和
发展反季蔬菜不可多得的地方ꎬ其中花生年种植面
积近万亩ꎮ 笔者于 ２０１０ ~ ２０１２ 年ꎬ在对该地区进
行植原体病害调查时ꎬ连续 ３年在花生种植地中发
现该病ꎬ发病率约为 ５％~６％ꎮ 在枣树或其它经济
林果间套种花生的地块中ꎬ发病率偏高ꎬ约为
１０％ꎬ对花生造成一定的产量损失ꎮ
本研究采用分子生物学方法对云南省元谋县
的花生丛枝植原体进行 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因及核糖体
蛋白基因的扩增、克隆及序列分析ꎬ与已报道的相
关株系进行序列同源性比较并明确该株系的分类
地位ꎬ为进一步研究元谋花生丛枝病发生规律和防
治方法提供理论依据ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 实验材料和主要试剂
花生丛枝病标样采自云南省元谋县ꎮ
ＥａｓｙＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、氨苄青霉素和
ＩＰＴＧ购自北京全式金生物技术有限公司ꎻｐＭＤ１９￣
Ｔ和 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购自 ＴａＫａＲａ公司ꎻＤＮＡ提取试
剂盒以及凝胶回收试剂盒购自 Ｏｍｅｇａ 公司ꎻ感受
态 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α菌株为本室保存ꎮ
１.２ 植株总 ＤＮＡ的提取
取 ０.１ｇ 感病植株幼嫩叶片ꎬ采用 Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ
Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ试剂盒分别提取感病植株和健康植株总
ＤＮＡꎮ ＤＮＡ溶解于 ５０ μＬ 灭菌去离子水中备用ꎮ
１.３ 引物合成
１６Ｓ ｒＲＮＡ基因扩增参照 Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ 等[１２]设计
的植原体通用引物 Ｐ１ / Ｐ７ 以及 Ｌｅｅ 等[６]设计的
Ｒ１６Ｆ２ｎ / Ｒ１６Ｒ２序列合成ꎮ 核糖体蛋白基因 ｒｐ 参
照 Ｍａｒｔｉｎｉ等[７]设计的 ｒｐ( ＩＩ) Ｆ１ / ｒｐ( ＩＩ)Ｒ１ 合成ꎮ
(表 １)ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＰＣＲｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｓｉｚｅ ｏｆ
ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ / ｂｐ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ / ５′￣３′
Ｐ１ / Ｐ７
１６Ｓ ｒＲＮＡꎬ１６Ｓ￣２３Ｓ
ｒＤＮＡꎬ２３Ｓ ｒＲＮＡ
１ ８００
ＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＴ
ＣＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＴＴ
Ｒ１６Ｆ２ｎ / Ｒ１６Ｒ２ １６Ｓ ｒＲＮＡ １ ２００
ＧＡＡＡＣＧＡＣＴＧＣＴＡＡＧＡＣＴＧＧ
ＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＣＣＣＣＧ
ｒｐ( ＩＩ)Ｆ１ / ｒｐ( ＩＩ)Ｒ１ ｒｐ １ ２００
ＧＣＴＣＴＴＡＣＴＣＧＴＡＡＡＹＡＴＧＴＡＧＴ
ＴＴＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＡ
１７３
植物病理学报 ４４卷
１.４ ＰＣＲ扩增及克隆
将植株总 ＤＮＡ 稀释 ２５ 倍后进行扩增ꎮ 采用
巢式 ＰＣＲ 技术扩增 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因:直接 ＰＣＲ 扩
增的反应循环为 ９４℃预处理 ５ ｍｉｎꎻ９４℃ １ ｍｉｎ ꎬ
４８℃１ ｍｉｎꎬ７２℃２ ｍｉｎꎬ共 ３０ 个循环ꎻ最后 ７２℃ 延
伸 １０ ｍｉｎꎻ巢式 ＰＣＲ 以直接 ＰＣＲ 扩增产物的 ２５
倍稀释产物为反应模板ꎬ反应循环为 ９５℃预处理 ５
ｍｉｎꎻ９５℃３０ ｓꎬ５５℃１ ｍｉｎꎬ７２℃ １ ｍｉｎ ３０ ｓꎬ共 ３５个
循环ꎻ最后 ７２℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎮ
采用直接 ＰＣＲ方法对 ｒｐ 基因进行扩增ꎬ反应
循环为 ９４℃预处理 ５ ｍｉｎꎻ９４℃１ ｍｉｎꎬ４９℃１ ｍｉｎꎬ
７２℃２ ｍｉｎꎬ共 ３５ 个循环ꎻ最后 ７２℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎮ
ＰＣＲ产物于 １％ 琼脂糖凝胶中电泳检测ꎮ
目标产物经 ＤＮＡ 割胶纯化试剂盒纯化后与
ｐＭＤ１９￣Ｔ载体连接ꎬ转化到大肠杆菌 ＤＨ５α 中ꎬ经
蓝白斑筛选并利用 ＰＣＲ反应筛选出阳性克隆后送
北京华大基因公司进行序列测定ꎮ
１.５ 核苷酸的序列测定和分析
用 ＳｅｑＭａｎ 软件对测序结果拼接去载体ꎬ并通
过 ＢＬＡＳＴ 在 ＮＣＢＩ 中搜索同源性序列ꎮ 采用
ＭＥＧＡ５ 通过最大似然法 (Ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ
ｍｅｔｈｏｄ)分别构建基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｒｐ 核苷酸序列
的系统进化树ꎬ同时选用植原体 １６ＳｒＶ－Ａ亚组中的
暂定种Ｃａ. Ｐ. ｕｌｍｉ以及 Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ为外
群ꎬ以 １ ０００为重复值进行 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 校验ꎮ 建树所
涉及到的花生丛枝植原体组各株系见表 ２ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ａｎｄ ｒｐ ｇｅｎｅ
ｉｎ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｇｒｏｕｐ
Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ Ｇｅｏｇｒａｐｈ－ｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎ
１６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ
ＲＦＬＰ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ
１６ｓ ｒＲＮＡ ｒｐ
Ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍꎬ ＰｎＷＢ Ｔａｉｗａｎ １６ＳｒＩＩ￣Ａ Ｌ３３７６５ ＥＦ１９３３７５
Ｓｅｓａｍｅ ｐｈｙｌｌｏｄｙꎬ ＳＥＰＮ Ｔｈａｉｌａｎｄ １６ＳｒＩＩ￣Ａ ＥＦ１９３３５７ ＥＦ１９３３７７
Ｓｅｓａｍｅ ｐｈｙｌｌｏｄｙꎬ ＳＥＰＴ Ｔｈａｉｌａｎｄ １６ＳｒＩＩ￣Ａ ＧＵ００４３７３ ＥＦ１９３３７８
Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ＳＰＷＢ Ｔａｉｗａｎ １６ＳｒＩＩ￣Ａ Ｌ３３７７０ ＥＦ１９３３７６
Ｌｉｍｅ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍꎬ
‘Ｃａ. Ｐ. ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ’ ＬＷＢ
Ｏｍａｎ １６ＳｒＩＩ￣Ｂ ＥＦ１８６８２８ ＥＦ１８６８１５
Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ ｐｈｙｌｌｏｄｙꎬ ＣｒＰ Ｔｈａｉｌａｎｄ １６ＳｒＩＩ￣Ｃ ＥＦ１９３３５５ ＥＦ１８６８１８
Ｆａｂａ ｂｅａｎ ｐｈｙｌｌｏｄｙꎬ ＦＢＰ Ｓｕｄａｎ １６ＳｒＩＩ￣Ｃ ＥＦ１９３３５４ ＥＦ１８６８１７
Ｓｏｙｂｅａｎ ｐｈｙｌｌｏｄｙꎬ ＳＯＹＰ Ｔｈａｉｌａｎｄ １６ＳｒＩＩ￣Ｃ ＥＦ１９３３５３ ＥＦ１８６８１６
Ｃａｃｔｕｓ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ＹＮ１６ꎬ ＣａＷＢＹＮ１６ Ｃｈｉｎａ １６ＳｒＩＩ￣Ｃ ＥＵ０９９５６１
Ｃｏｔｔｏｎ ｐｈｙｌｌｏｄｙ ＣｏＰ Ｕｎｋｎｏｗｎ １６ＳｒＩＩ￣Ｃ ＥＦ１８６８２７ ＥＦ１８６８１４
Ａｌｆａｌｆａ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍꎬ ＡｌｆＷＢ Ｏｍａｎ １６ＳｒＩＩ￣Ｄ ＥＦ１９３３６０ ＥＦ１９３３７１
Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｔｏｍａｔｏ ｂｉｇ ｂｕｄꎬ
‘Ｃａ.Ｐ. ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ’ ＴＢＢ
Ａｕｓｔｒａｌｉａ １６ＳｒＩＩ￣Ｄ ＥＦ１９３３５９ ＥＦ１９３３７３
Ｉｔａｌｉａｎ ａｌｆａｌｆａ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍꎬ ＩＡＷＢ Ｉｔａｌｙ １６ＳｒＩＩ￣Ｅ ＥＦ１９３３５６ ＥＦ１９３３８０
Ｐｉｃｒｉｓ ｅｃｈｉｏｉｄｅｓ ｐｈｙｌｌｏｄｙꎬ ＰＥＰ Ｉｔａｌｙ １６ＳｒＩＩ￣Ｅ Ｙ１６３９３ ＥＦ１９３３８１
Ｃａｃｔｕｓ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ＹＮ１１ꎬ ＣａＷＢＹＮ１１ Ｃｈｉｎａ １６ＳｒＩＩ￣Ｆ ＥＵ０９９５５６
Ｃａｃｔｕｓ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ＹＮ２３ꎬ ＣａＷＢＹＮ２３ Ｃｈｉｎａ １６ＳｒＩＩ￣Ｇ ＥＵ０９９５６８
Ｃａｃｔｕｓ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ＹＮ２４ꎬ ＣａＷＢＹＮ２４ Ｃｈｉｎａ １６ＳｒＩＩ￣Ｈ ＥＵ０９９５６９
Ｃａｃｔｕｓ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ＹＮ０６ꎬ ＣａＷＢＹＮ０６ Ｃｈｉｎａ １６ＳｒＩＩ￣Ｉ ＥＵ０９９５５１
Ｃａｃｔｕｓ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ＹＮ０７ꎬ ＣａＷＢＹＮ０７ Ｃｈｉｎａ １６ＳｒＩＩ￣Ｊ ＥＵ０９９５５２
Ｃａｃｔｕｓ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ＹＮ２８ꎬ ＣａＷＢＹＮ２８ Ｃｈｉｎａ １６ＳｒＩＩ￣Ｋ ＥＵ９９０５７２
Ｃａｃｔｕｓ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ＹＮ０１ꎬ ＣａＷＢＹＮ０１ Ｃｈｉｎａ １６ＳｒＩＩ￣Ｌ ＥＵ０９９５４６
Ｅｌｍ ｙｅｌｌｏｗｓꎬ ‘Ｃａ. Ｐ. ｕｌｍｉ’ ＥＹ１ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １６ＳｒＶ￣Ａ ＡＹ１９７６５５ ＡＹ１９７６７５
Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ Ｍ２３９３２ Ｍ７４７７１
２７３
４期 万琼莲ꎬ等:云南花生丛枝植原体 １６Ｓ ｒＲＮＡ和核糖体蛋白基因序列分析
１.６ １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 ｉＰｈｙＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ 在线分析及
真实 ＲＦＬＰ分析
利用植原体分类鉴定在线工具 ｉＰｈｙＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ
(ｈｔｔｐ: / / ｐｌａｎｔｐａｔｈｏｌｏｇｙ. ｂａ. ａｒｓ. ｕｓｄａ. ｇｏｖ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ /
ｒｅｓｏｕｒｃｅ / ｉｐｈｙｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ.ｃｇｉ)进行相关植原体株系候
选种的确定(‘Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ’ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｓ￣
ｓｉｇｎｍｅｎｔ)和基于相似系数分析的 １６Ｓｒ 组 /亚组的
确定 (１６Ｓｒ ｇｒｏｕｐ / ｓｕｂｇｒｏｕｐ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ)ꎮ 并将整理得到的 １６Ｓ ｒＤＮＡ
Ｆ２ｎＲ２序列进行虚拟 ＲＦＬＰ 酶切分析以及图谱比
较分析[１３]ꎮ 并选用前述 ＲＦＬＰ 比较分析中能区别
１６Ｓｒ亚组的重要内切酶对 １６Ｓ ｒＤＮＡ 巢式 ＰＣＲ 扩
增产物进行酶切ꎬ经 ３％琼脂糖凝胶电泳进行分
析ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 感病植株症状表现
植株严重矮化ꎬ节间缩短ꎬ腋芽大量萌发出丛
生枝条ꎬ叶片细小黄化ꎮ 大多数病株只结少量荚果
甚至不结荚果(图 １)ꎮ
２.２ ＰＣＲ检测结果
感病植株总 ＤＮＡ 经 ＰＣＲ扩增后ꎬ分别得到约
１ ８００ ｂｐ(直接)和 １ ２００ ｂｐ(巢式)的 １６Ｓ ｒＤＮＡ片
段以及 １ １００ ｂｐ的 ｒｐ基因片段ꎮ 片段大小与引物
设计相符ꎬ以健康植株总 ＤＮＡ 为模板的对照均未
扩增出特异性条带(图 ２)ꎮ 说明感病植株中含有
植原体ꎬ将该株系命名为云南元谋花生丛枝植原体
(ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ)ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｙｕａｎｍｏｕ ＣｏｕｎｔｙꎬＹｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
Ｌｅｆｔ: Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔꎻ Ｍｉｄｄｌｅ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ: Ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｌａｎｔ.
Ｆｉｇ. ２ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｒｐ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’￣ｂｒｏｏｍ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｌａｎｔｓ
Ａ: Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ １６ｓ ｒＤＮＡꎻ Ｂ: Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ １６ｓ ｒＤＮＡꎻ Ｃ: Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｒｐ ｇｅｎｅ.
Ｍ: ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １－３: Ｄｉｓｅａｓｅｄ ｐｅａｎｕｔ ｐｌａｎｔｓꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｈｅａｌｔｈｙ ｐｅａｎｕｔ ｐｌａｎｔ.
３７３
植物病理学报 ４４卷
２.３ １６Ｓ ｒＤＮＡ的序列分析及系统进化树构建
云南元谋花生丛枝植原体(ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ)１６Ｓ
ｒＤＮＡ扩增片段含有 １ ８０６ 个核苷酸(ＧｅｎＢａｎｋ 登
录号为 ＪＸ８７１４６７)ꎬ包括完整的 １６Ｓ ｒＤＮＡ(１ ~ １
５２５)、包含 ｔＲＮＡ￣Ｉｌｅ的 １６Ｓ￣２３Ｓ ｒＤＮＡ间区(１ ５２６
~１ ７５１)和部分 ２３Ｓ ｒＤＮＡ 序列(１ ７５２ ~ １ ８０６)ꎮ
该株系与目前在 ＧｅｎＢａｎｋ 中登录的来源于台湾及
海南的 ５个花生丛枝植原体株系的核苷酸序列同
源性高达 ９９.８％ 以上ꎬ在第 ５９９、６２７、６２８、７９０ 和 １
３３０位这 ５个位点上与来自台湾或海南的株系存
在碱基差异ꎬ其中第 ５９９位的差异是云南元谋株系
特异的(表 ３)ꎮ
从构建的基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列的系统进化树
可看出(图 ３)ꎬ１６ＳｒＩＩ 组各株系明显形成一稳定进
化支ꎬ而云南元谋花生丛枝植原体(ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ)
又 与 １ ６ ＳｒＩＩ ￣ Ａ亚组中的花生丛枝 ( ＰｎＷＢ ) 、
Ｔａｂｌｅ ３ Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ(ＳＮＰｓ) ｉｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ ＰｎＷＢ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｕｒｃｅ
ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｍｂｅｒ Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎ
ＳＮＰ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ
５９９ ６２７ ６２８ ７９０ １ ３３０
Ｈｏｍｏｌｏｇｙ (％)
ＪＸ８７１４６７ Ｙｕａｎｍｏｕꎬ Ｙｕｎｎａｎ ＡＴＧＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＡＧ－ＴＣＣＡＡＴＣＧＣＧ
ＧＵ１１３１４８ Ｈａｉｎａｎ ＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＡＧ－ＴＣＣＡＡＴＴＧＣＧ ９９.９
ＪＮ６８１２７３ Ｈｅｋｏｕꎬ Ｈａｉｎａｎ ＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＴＡＧ－ＴＣＣＡＡＴＣＧＣＧ ９９.８
ＪＮ６８１２７４ Ｓａｎｙａꎬ Ｈａｉｎａｎ ＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＴＧＴＡＧ－ＴＣＣＡＡＴＣＧＣＧ ９９.９
ＪＸ４０３９４４ Ｔａｉｗａｎ ＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＡＧ－ＴＣＣＡＡＴＣＧＣＧ ９９.９
Ｌ３３７６５ Ｔａｉｗａｎ ＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＡＧＧＴＣＣＡＡＴＣＧＣＧ ９９.９
Ｆｉｇ. ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
１６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ １６ＳｒＩＩ ｇｒｏｕｐ
４７３
４期 万琼莲ꎬ等:云南花生丛枝植原体 １６Ｓ ｒＲＮＡ和核糖体蛋白基因序列分析
甘薯丛枝(ＳＰＷＢ)、芝麻花变叶(ＳＥＰＮꎬ ＳＥＰＴ)等
株系形成一进化亚支ꎬ 表明 ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ 与
１６ＳｒＩＩ￣Ａ 亚组株系遗传进化关系最近ꎬ其次为
１６ＳｒＩＩ￣Ｄ亚组的 Ｃａ. Ｐ. ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ 和 ＡｌｆＷＢ 株系ꎮ
说明 ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ属于 １６ＳｒＩＩ￣Ａ 亚组成员ꎮ
２.４ 云南元谋花生丛枝植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ在线分
析及真实 ＲＦＬＰ分析
应用 ｉＰｈｙＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ在线工具分析ꎬ显示该序列
与候选种‘Ｃａ. Ｐ. ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｅ’(ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ:
Ｙ１００９７) 核苷酸同源性最高ꎬ为 ９９.８％ꎬ认为该植
原体与‘Ｃａ. Ｐ. ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｅ’相关ꎮ 基于相似系数
(ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔꎬＦ)进行 １６Ｓ组 /亚组的分类ꎬ
结果显示该片段的模拟 ＲＦＬＰ 图谱与 １６ＳｒＩＩ￣Ａ 亚
组的参照株系 ＰｎＷＢ(Ｌ３３７６５)的 １７ 种限制性内
切酶的酶切图谱完全一致(图 ４￣Ａ)ꎬ相似系数为 １.
００ꎮ 模拟 ＲＦＬＰ图谱中的 ２个内切酶 Ｔａｑ Ｉ 和 Ｍｓｅ
Ｉ即可明显的把 ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ 与其它 １６Ｓ ｒＩＩ 各亚
组株系区别开(图 ４￣Ｂ、４￣Ｃ)ꎬ并且用这 ２ 个酶对
１６Ｓ ｒＤＮＡ巢式 ＰＣＲ 扩增产物进行 ＲＦＬＰ 所得到
的真实酶切图谱与虚拟 ＲＦＬＰ 及 １６Ｓ ｒＩＩ￣Ａ 亚组成
员的银胶菊花变绿植原体(ＰａｒＶＰ)酶切图谱完全
一致(图 ４￣Ｄ)ꎬ进一步验证了虚拟 ＲＦＬＰ 分析的结
果并说明该株系属于 １６ＳｒＩＩ￣Ａ 亚组成员ꎮ
Ｆｉｇ. ４ Ｖｉｒｔｕａｌ ａｎｄ ａｃｔｕａｌ ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ １６Ｓ ｒＤＮＡ Ｆ２ｎＲ２ ｆｒａｇｍｅｎｔ
(Ａ) Ｖｉｒｔｕａｌ ＲＦＬＰ ｐｒｏｆｉｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ ｗｉｔｈ １７ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ.
(Ｂ) ａｎｄ (Ｃ) Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ Ｔａｑ Ｉ ａｎｄ Ｍｓｅ Ｉ ｐｒｏｄｕｃｅ ｕｎｉｑｕｅ ＲＦＬＰ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ (ｓｕｂｇｒｏｕｐ １６ＳｒＩＩ￣Ａ) ｆｒｏｍ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｄｅｌｉｎｅａｔｅｄ １６ＳｒＩＩ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ.
(Ｄ) ＰＣＲ￣ＲＦＬＰ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｆｒｏｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ
ａｎｄ ＰａｒＶＰ Ｆ２ｎＲ２ ａｍｐｌｉｃｏｎ ｂｙ Ｔａｑ Ｉ ａｎｄ Ｍｓｅ Ｉ. ＭＷ: ΦＸ１７４ＤＮＡ Ｈａｅ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ
５７３
植物病理学报 ４４卷
２.５ ｒｐ基因的序列分析及序列系统进化树构建
ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ 核糖体蛋白基因扩增片段长 １
１７１ ｂｐ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号为 ＪＸ８７１４６９)ꎮ 经 ＢＬＡＳＴ
在 ＧｅｎＢａｎｋ 中搜索同源序列ꎬ并用 ＤＮＡＭＡＮ 构
建同源矩阵ꎬ发现该株系与均属于花生丛枝植原体
组(Ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｇｒｏｕｐꎬ１６Ｓ ｒＩＩ ｇｒｏｕｐ)的
序列同源性均在 ９０.１％以上ꎬ与目前在 ＧｅｎＢａｎｋ
中登录的来源于台湾及海南的 ４ 个花生丛枝植原
体株系的同源性高达 ９９.７％~９９.８％ꎮ
ＤＮＡＭＡＮ７ 软件分析表明ꎬ该序列包括核糖
体蛋白全部 Ｌ２２(ｒｐｌＶꎬ９０￣４７６)和大部分 Ｓ３( ｒｐｓＣꎬ
４６０￣１ １７１)基因ꎬ２基因相互重叠ꎬ分别编码 １２８ 和
２３７个氨基酸ꎮ 分别比较 ２ 个基因所编码氨基酸
序列ꎬ发现云南元谋株系 ｒｐｌＶ 基因编码的第 ４５ 位
氨基酸与台湾的一个株系有差异ꎬ而 ｒｐｓＣ 基因编
码的第 １９４ 位氨基酸却与台湾和海南的株系都有
差异(表 ４)ꎮ
从构建的系统进化树可看出ꎬ基于 ｒｐ 的进化
树与基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ 的系统进化树相似ꎬ１６ＳｒＩＩ 组
各植原体株系也明显形成聚为一群ꎬ而 ＰｎＷＢ￣
ＹＮｙｍ与花生丛枝(ＰｎＷＢ)、甘薯丛枝(ＳＰＷＢ)、
芝麻花变叶(ＳＥＰＮꎬ ＳＥＰＴ)以及苜蓿丛枝、候选种
Ｃａ.Ｐ.ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ等株系聚为同一亚进化支( ｉｉｉ)(图
５)ꎮ
Ｔａｂｌｅ ４ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｒｐｌＶ ａｎｄ ｒｐｓＣ
ｏｆ ＰｎＷＢ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｕｒｃｅ
Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎ
ｒｐｌＶ ｒｐｓＣ
ＧｅｎＢａｎｋ
Ｎｕｍｂｅｒ
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ / ４５ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ / ％
ＧｅｎＢａｎｋ
ｎｕｍｂｅｒ
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ / １９４ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ / ％
Ｙｕａｎｍｏｕꎬ Ｙｕｎｎａｎ ＡＦＺ８９０２８ ..ＴＮＫＡＡＡＩ.. / ＡＦＺ８９０２９ ..ＶＡＡＲＴＩＨ.. /
Ｔａｉｗａｎ ＡＢＯ２６５１３ ..ＴＮＫＳＡＡＩ.. ９９.０ ＡＢＯ２６５１４ ..ＶＡＡＫＴＩＨ.. ９９.６
Ｔａｉｗａｎ ＡＦＫ７５８６２ ..ＴＮＫＡＡＡＩ.. １００ ＡＦＫ７５８６３ ..ＶＡＡＫＴＩＨ.. ９９.６
Ｈｅｋｏｕꎬ Ｈａｉｎａｎ ＡＧＭ３４００５ ..ＴＮＫＡＡＡＩ.. １００ ＡＧＭ３４００６ ..ＶＡＡＫＴＩＨ.. ９９.６
Ｓａｎｙａꎬ Ｈａｉｎａｎ ＡＧＭ３４００７ ..ＴＮＫＡＡＡＩ.. １００ ＡＧＭ３４００８ ..ＶＡＡＫＴＩＨ.. ９９.６
Ｆｉｇ. ５ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｒｐ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ １６ＳｒＩＩ ｇｒｏｕｐ
６７３
４期 万琼莲ꎬ等:云南花生丛枝植原体 １６Ｓ ｒＲＮＡ和核糖体蛋白基因序列分析
３ 讨论
１６Ｓ ｒＲＮＡ基因是原核生物进化过程中一个比
较保守的基因ꎬ自 Ｌｉｍ 等[１４]在 ２０ 世纪 ８０ 年代末
期开始用 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因对植原体进行系统发育
研究以来ꎬ研究者们也尝试用 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列
对植原体进行分类[６ꎬ １５]ꎮ 但随着对植原体的深入
研究ꎬ发现采用进化过程中相对不及 １６Ｓ ｒＤＮＡ序
列保守的其它分子标记ꎬ如 ｒｐꎬ可对亲缘关系比较
近的植原体株系进行进一步的划分[１６ꎬ １７]ꎮ Ｍａｒｔｉｎｉ
等[７]２００７年根据对 ｒｐｌＶ￣ｒｐｓＣ 的序列分析ꎬ建立了
１９个不同的植原体 ｒｐ 亚进化支( ｓｕｂｃｌａｄｅｓ)ꎬ其中
花生丛枝组(１６ＳｒＩＩ)包括了 ４ 个 ｒｐ 亚进化支( ｉｉｉ、
ｘｖｉｉｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉ)ꎮ 本研究对云南元谋花生丛枝植原
体的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列以及 ｒｐ 序列进行分析ꎬ表明
引起云南元谋花生丛枝病的植原体属于 １６ＳｒＩＩ￣Ａ
亚组和 ｒｐ亚进化支 ｉｉｉꎬ明确了该株系的分类地位ꎮ
从本实验所构建的基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列的系
统进化树还可看出ꎬ除 １６ＳｒＩＩ￣Ｅ、Ａ、Ｄ 各亚组所构
成的分支外ꎬ该进化树还包括一个由 １６ＳｒＩＩ￣Ｂ、Ｃ
以及 １６ＳｒＩＩ￣Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ等 ７个新亚组株系组
成的分支ꎬ该分支所涉及到的 ７个 １６ＳｒＩＩ新亚组株
系均来源于云南的仙人掌丛枝植原体ꎬ这些株系的
１６Ｓ ｒＤＮＡ￣ＲＦＬＰ酶切图谱均显示与之前所鉴定的
５个亚组(１６ＳｒＩＩ￣Ａꎬ Ｂꎬ Ｃꎬ Ｄꎬ Ｅ)至少有一个酶切
位点的差异[１８]ꎮ 结合本实验结果ꎬ可看出 １６ＳｒＩＩ
组植原体株系在云南存在具有一定的广泛性和多
样性ꎮ
随着计算机软件的发展ꎬ自 ２００７ 年 Ｗｅｉ
等[１９ꎬ ２０]开始采用计算机虚拟 ＲＦＬＰ 分析快速准确
的对植原体进行分类鉴定ꎮ Ｚｈａｏ 等[１３]于 ２００９ 年
设计的植原体分类鉴定在线工具( ｉＰｈｙＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ)ꎬ
可依据对植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ Ｆ２ｎＲ２ 扩增序列的分
析进行相关株系候选种的确定(‘Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙ￣
ｔｏｐｌａｓｍａ’ｓｐｅｃｉｅｓ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ)和基于相似系数分析
的 １６Ｓｒ组 /亚组的确定(１６Ｓｒ ｇｒｏｕｐ / ｓｕｂｇｒｏｕｐ ｃｌａｓ￣
ｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ)ꎬ同时还可
得到单个 １６Ｓ ｒＤＮＡ Ｆ２ｎＲ２序列的 １７ 种限制性酶
切图谱(ＶｇｅｌＭＥ)以及多个序列的同一个限制性
酶切图谱(ＶｇｅｌＭＳ)ꎮ 本实验中利用该分析工具ꎬ
对 ＰｎＷＢ￣ＹＮｙｍ 的 １６Ｓ ｒＤＮＡ Ｆ２ｎＲ２ 扩增片段进
行在线分析ꎬ结果显示该株系与‘Ｃａ. Ｐ. ａｕｓｔｒａｌａｓｉ￣
ａｅ’相关ꎮ 从得到的 １７ 种限制性内切酶图谱和单
一的 Ｔａｑ Ｉ、Ｍｓｅ Ｉ 酶切图谱也说明该株系属于
１６ＳｒＩＩ￣Ａ 亚组成员ꎮ
比较花生丛枝植原体 ３ 个不同来源(台湾、海
南和云南)的 １６Ｓ ｒＤＮＡ片段以及 ｒｐ 基因片段ꎬ发
现均具有较高的同源性ꎬ推测这些不同地理来源的
病害应该是由同一种植原体侵染所致ꎮ 有关该病
原的传播途径、传播媒介等有待于研究ꎮ 通过进一
步比较 １６Ｓ ｒＤＮＡ片段ꎬ发现有 １ 个位点的差异是
云南元谋株系特异的ꎬ再分别比较核糖体蛋白
ｒｐｌＶ￣ｒｐｓＣ ２ 个基因所编码的氨基酸序列ꎬ发现云
南元谋株系 ｒｐｓＣ基因编码的第 １９４ 位氨基酸与台
湾和海南的株系均存在差异ꎬ表明云南花生丛枝植
原体有一定特殊性ꎬ推测该特殊性与云南元谋特殊
的地理、气候和环境有关ꎮ
参考文献
[１] Ｃｈｅｎ Ｚ Ｙꎬ Ｓｈｅｎ Ｊ Ｙꎬ Ｐｅｎｇ Ｊ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ￣
ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ (ｐｅａｎｕｔ) ｗｉｔ￣
ｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｄｉｓｅａｓｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉ￣
ｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (上海: 生物化学与生物物理
学报)ꎬ １９８１ꎬ１９(３): ３１７－３１８.
[２] Ｈｕａｎｇ Ｙ Ｚꎬ Ｃｈｅｎ Ｘ Ｗꎬ Ｚｈｕ Ｚ Ｔ. Ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｙ
ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｉｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (北京: 植物病理
学报)ꎬ １９９３ꎬ２３(３): ２２９－２３０.
[３] Ｙａｎｇ Ｊ Ｙꎬ Ｌｉａｎｇ Ｚ Ｈꎬ Ｔａｎｇ Ｗ Ｗ. Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ
ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ
ｄｉｓｅａｓｅ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｉｌ ｃｒｏｐ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ (武汉: 中国油料作物学报)ꎬ ２０００ꎬ２２(４):
５８－６１.
[４] Ｃｈｅｎ Ｍ Ｒꎬ Ｚｈａｎｇ Ｓ Ｇꎬ Ｚｈｅｎ Ｇ Ｂꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｔｕｄｙ ｏｆ
ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣
ｂｒｏｏｍ ｆｒｏｍ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｈｉｎａ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｇｕａｎｇ￣
ｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ (广州: 广东农业科学)ꎬ
１９９４ꎬ(２): ３３－３５.
[５] Ｌｅｅ Ｉ－Ｍꎬ Ｂｏｔｔｎｅｒ ＫＤꎬ Ｚｈａｏ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ
ｓｅｃＹ ｇｅｎｅ[Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１０ꎬ６０: ２８８７－２８９７.
[６] Ｌｅｅ Ｉ－Ｍꎬ Ｈａｍｍｏｎｄ Ｒ Ｗꎬ Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ｕｎｉｖｅｒ￣
ｓａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ １６ＳｒＲＮＡ ｆｏｒ
７７３
植物病理学报 ４４卷
ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌｉｋｅ ｏｒ￣
ｇａｎｉｓｍｓ[Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９９３ꎬ８３(８): ８３４－８４２.
[７] Ｍａｒｔｉｎｉ Ｍꎬ Ｌｅｅ Ｉ￣Ｍꎬ Ｂｏｔｔｎｅｒ Ｋ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ￣ｂａｓｅｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｆｏｒ ｆｉｎｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ [ Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
２００７ꎬ５７: ２０３７－２０５１.
[８] Ｃｈｅｎ Ｓ Ｋꎬ Ｃｈｕ Ｐ Ｗꎬ Ｈｏ Ｋ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｓｉｇｍａ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ ｂｒｏｏｍ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ Ｂｕｌｌ.ꎬ
２００８ꎬ１７: ２７９－２８７.
[９] Ｃｈｕ Ｐ Ｗꎬ Ｃｈｅｎ Ｓ Ｋꎬ Ｃｈｅｎ Ｗ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒ￣
ｏｎｅｓ ＧｒｐＥꎬ ＤｎａＫ ａｎｄ ＤｎａＪ ｆｒｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｓｓｏｃｉ￣
ａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ ｂｒｏｏｍ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎꎬ ２００７ꎬ１６: １８１－１９０.
[１０] Ｌｖ Ｐ Ｙꎬ Ｌｉｎ Ｃ Ｐ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｐｓＴꎬ ｓｅｒＳ
ａｎｄ ｈｆｌＢ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ｗｉｔｃｈｅｓ－ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ (台湾: 植
病會刊)ꎬ ２００９ꎬ１８: ５７－６６.
[１１] Ｃｈｅｎｇ Ｙ Ｙꎬ Ｌｉｎ Ｃ Ｐ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙ￣
ｔｏｐｌａｓｍａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ
ｉｍｐꎬ ｉｄｐＡ ａｎｄ ａｍｐ. ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ (台湾: 植病會刊)ꎬ ２０１０ꎬ１９: ９－１８.
[１２] Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｂꎬ Ｓｅｅｍüｌｌｅｒ Ｅꎬ Ｓｍａｒｔ Ｃ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｈｙｌｏｇｅ￣
ｎｅｔｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌｉｋｅ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｏｒ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ [Ｍ] . Ｓａｎ ＤｉｅｇｏꎬＣａｌｉｆꎬ:
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓꎬ １９９５: ３６９－３８０.
[１３] Ｚｈａｏ Ｙꎬ Ｗｅｉ Ｗꎬ Ｌｅｅ Ｉ－Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏｏｌꎬ ｉＰｈｙ￣
Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒꎬ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅａｃｈ
Ｘ－ｄｉｓｅａｓｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｇｒｏｕｐ (１６ＳｒＩＩＩ) [ Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａ￣
ｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉ￣
ｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ５９: ２５８２－２５９３.
[１４] Ｌｉｍ Ｐ Ｏꎬ Ｓｅａｒｓ Ｂ Ｂ. １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ
ｔｈａｔ ｐｌａｎｔ￣ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｒｅ
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ [ Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９８９ꎬ１７１(１１): ５９０１－５９０６.
[１５] Ｓｅｅｍüｌｌｅｒ Ｅꎬ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｂꎬ Ｍａｅｕｒｅｒ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｈｙｌｏｇｅ￣
ｎｅｔｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ ｂｙ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６ Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ[Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａ￣
ｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９９４ꎬ ４４
(３): ４４０－４４６.
[１６] Ｌｅｅ Ｉ￣Ｍꎬ Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ￣Ｒｉｎｄａｌ Ｄ Ｅꎬ Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｒｅｖｉｓｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ａｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ [Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９８ꎬ４８(４): １１５３－
１１６９.
[１７] Ｌｅｅ Ｉ￣Ｍꎬ Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｅꎬ Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ￣Ｒｉｎｄａｌ Ｄ Ｅ. Ｐｈｙｔｏ￣
ｐｌａｓｍａ: ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ [ Ｊ ] . Ａｎｎｕａｌ
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０００ꎬ５４: ２２１－２５５.
[１８] Ｃａｉ Ｈꎬ Ｗｅｉ Ｗꎬ Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ａｍｏｎｇ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ｏｐｕｎｔｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ: ｖｉｒｔｕａｌ
ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｅｗ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅａｎｕｔ
ｗｉｔｃｈｅｓ’ ￣ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｇｒｏｕｐ [ Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
２００８ꎬ５８(６): １４４８－１４５７.
[１９] Ｗｅｉ Ｗꎬ Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｅꎬ Ｌｅｅ Ｉ￣Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｍｐｕｔｅｒ￣ｓｉｍｕｌａ￣
ｔｅｄ ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅｓ: ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｅｎ ｎｅｗ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｇｒｏｕｐｓ[Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒ￣
ｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
２００７ꎬ５７: １８５５－１８６７.
[２０] Ｗｅｉ Ｗꎬ Ｌｅｅ Ｉ－Ｍꎬ Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＲＦＬＰ
ｐａｔｔｅｒｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ
１６Ｓｒ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ｌｉｎｅａｇｅｓ [ Ｊ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００８ꎬ５８:
２３６８－２３７７.
责任编辑:张宗英 曾晓葳
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