全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(１): １￣７(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０１￣０６ꎻ 修回日期: ２０１３￣１０￣２３
基金项目: 湖北省自然科学基金 (２０１１ＣＤＢ１５０)ꎻ 教育部新教师基金 ( ２０１００１４６１２００３７)ꎻ 中央高校基本科研业务费专项资金资助
(２０１０ＱＣ０３３)
通讯作者: 王国平ꎬ教授ꎬ研究方向为果树病理学ꎻ Ｔｅｌ:０２７￣８７２８７５７６ꎬ Ｆａｘ: ＋８６￣２７￣８７３８４６７０ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｇｐｗａｎｇ＠ｍａｉｌ.ｈｚａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 王利平ꎬ女ꎬ主要从事果树病毒研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗｌｐ０９＠ｍａｉｌ.ｈｚａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
来源于湖北省枣疯病植原体分离物
１６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｒｐ基因的序列分析
王利平１ꎬ２ꎬ 洪 霓１ꎬ２ꎬ 王国平１ꎬ２∗
( １华中农业大学湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７０ꎻ ２ 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７０)
摘要:以田间采集的来源于我国湖北省枣树产业主产区随州市随县种植的表现为“枣疯病”症状的枣树分离株为试材ꎬ对其
１６Ｓ ｒＤＮＡ和核糖体蛋白( ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ｒｐ)基因采用 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ进行扩增以及序列分析ꎮ 结果表明ꎬ湖北 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ
植原体分离物 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因的核苷酸序列与我国山东、河南等地的分离株一致率均为 ９９％以上ꎬ在进化树中位于同一亚
组的不同进化分支ꎻ虚拟 ＲＦＬＰ图谱分析表明ꎬＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 属于 １６ＳｒＶ￣Ｂ 亚组一个成员ꎬ与其进化树分组结果一致ꎮ ＪＷＢ￣
Ｈｕｂｅｉ分离株 ｒｐ基因的核苷酸序列也与我国山东、陕西等地区的分离株一致率均为 ９９％以上ꎬ在进化树中聚为同一亚组ꎬ
与报道的基于 ＲＦＬＰ分类属于 ｒｐＶ￣Ｃ亚组的中国枣疯病分离物(ＪＷＢ)聚集于同一亚组不同分支ꎮ 该研究结果明确了湖北
省枣疯病植原体的分类地位以及与来源于我国不同地区枣疯病分离株之间的遗传进化关系ꎬ为进一步研究植原体的株系
划分、基因遗传变异研究提供了理论基础ꎮ
关键词:枣疯病ꎻ １６Ｓ ｒＤＮＡꎻ ｒｐ基因ꎻ 进化树分析
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｒｐ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ
ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ′￣ｂｒｏｏｍ ( ＪＷＢ) ｆｒｏｍ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ＷＡＮＧ Ｌｉ￣ｐｉｎｇ１ꎬ２ꎬ ＨＯＮＧ Ｎｉ１ꎬ２ꎬ
ＷＡＮＧ Ｇｕｏ￣ｐｉｎｇ１ꎬ２ ( １ Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕ￣
ｈａｎ ４３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂ. ｏｆ Ａｇｒｏｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ (ｒｐ) ｏｆ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｊｕｊｕｂｅ ｔｒｅｅｓ
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｓｕｉ ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｓｕｉｚｈｏｕ ｃｉｔｙꎬ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ. Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ
ｐｕｒｉｆｉｅｄꎬ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ. Ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｒｐ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ １ ２４７ ｂｐ ａｎｄ
１ １９６ ｂｐꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ (ｎｔ) ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｒｐ ｗｅｒｅ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ
ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ９９％ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇꎬ Ｈｅｎａｎ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ ｓｏ ｏｎꎬ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｓｅｐａｒａｔｅ ｓｕｂ￣ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｕｂ￣ｇｒｏｕｐ. Ｖｉｒｔｕａｌ ＲＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＪＷＢ￣ Ｈｕｂｅｉ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ １６ＳｒＶ￣Ｂ ｓｕｂｇｒｏｕｐꎬ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｎ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ. Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｐｌ２２￣ｒｐｓ３ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｓｏｌａｔｅｓ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ９９％ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇꎬ ａｎｄ Ｓｈａｎｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ.
Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｓｅｐａｒａｔｅ
ｓｕｂ￣ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｕｂ￣ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＪＷＢ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａꎬ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ｒｐＶ￣Ｃ ｓｕｂｇｒｏｕｐ. Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ ｉｓｏｌａｔｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｌａｙ
ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ′￣ｂｒｏｏｍꎻ １６Ｓ ｒＤＮＡꎻ ｒｐ ｇｅｎｅꎻ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
植物病理学报 ４４卷
中图分类号: Ｓ４３６.６ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０１￣０００１￣０７
植原体(Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ)是一类寄
生于韧皮部、筛管的活体原核生物ꎬ不能进行体
外培养ꎬ以往研究者主要是基于植原体寄生的寄
主、介体种类以及地理分布不同的生物学特性进
行分类[１] ꎮ 近年来ꎬ随着分子生物学的迅速发
展ꎬ采用 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ、Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ￣ＰＣＲ 和 ＲＦＬＰ 等
分子技术对植原体的一些保守序列ꎬ如 １６Ｓ ｒＤ￣
ＮＡ序列、核糖体蛋白( ｒｐ)基因、延伸因子( ｔｕｆ)
基因、转运蛋白 ( ＳｅｃＹ ) 基因以及外膜蛋白
(ＯＭＰ)基因进行分析ꎬ能够快速、有效的对植原
体进行鉴定和分类[２ꎬ３] ꎮ 根据已经公布的植原体
１６Ｓ ｒＤＮＡ序列ꎬ其 ＲＦＬＰ 分析将植原体分为 ２８
个组 ５０ 个亚组ꎬ有效的提高了基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序
列的植原体分类系统[４~ ６] ꎮ
枣疯病 ( Ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ′￣ｂｒｏｏｍꎬ ＪＷＢ)是一
种重要的植原体病害ꎬ在我国河北、河南、山东和
北京等省(市)枣树栽培区均有严重发生ꎮ 该病
可使枣树树势衰退直至死亡ꎬ给枣树产业造成严
重经济损失[７ꎬ８] ꎮ 引起我国不同地区的枣疯病的
病原是植原体ꎬ基于生物学和分子鉴定属于
１６ＳｒＶ组ꎮ １６ＳｒＶ组植原体寄主范围比较广ꎬ均
可侵染不同种植物ꎮ 基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ、ｒｐ 和 ＳｅｃＹ
保守基因序列的 ＲＦＬＰ分析可将 １６ＳｒＶ组植原体
分为 ５ 个 １６ＳｒＶ亚组ꎬ１２ 个 ｒｐＶ 亚组和 １６ 个 ｓｅ￣
ｃＹ亚组[９ꎬ１０] ꎮ
本研究以我国湖北表现为“枣疯病”症状的蜜
枣植株为材料ꎬ对其植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ和核糖体蛋
白(ｒｐｌ２２￣ｒｐｓ３)进行序列测定、ＲＦＬＰ图谱及其系统
发育进化分析ꎬ明确了来源于湖北省枣疯病植原体
的分类地位及其与我国其他产区枣树分离株的遗
传进化关系ꎬ旨在为枣疯病植原体遗传变异群体分
析ꎬ病害流行发生发展规律以及枣疯病防控措施制
定提供分子依据ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 枣树植原体样品
２０１０年 １１ 月在湖北省随州市随县ꎬ随机从疑
似感染植原体的 ４株蜜枣植株ꎬ以及 １株健康枣树
植株上分别采集叶片、枝条ꎬ分别标记为 ５ 个待检
样品ꎬ置于冷库 ４℃保藏ꎬ用于提取基因组 ＤＮＡꎮ
１.２ 化学试剂
ＰＣＲ 产物回收试剂盒、 ＴａｑＤＮＡ 聚合酶、
ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ分子量标准 ＭａｒｋｅｒⅢ、限制性内切酶
等购自 ＴａＫａＲａ 公司ꎻ巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异
丙醇等化学试剂均购自上海生工生物技术有限公
司ꎮ
１.３ 扩增引物与合成
采用植原体通用引物 Ｐ１ / Ｐ７和 Ｒ１６Ｆ２ｎ / Ｒ２扩
增 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因[１１]ꎬ ｒｐＩＢ / ｒｐｓＣ / ｒｐＩＰ 和 ｒｐ (Ｖ)
Ｆ１Ａ / ｒｐ(Ｖ)Ｒ１Ａ 引物[９]扩增 ｒｐ 基因ꎮ 引物均由
上海生工合成ꎮ
１.４ ＣＴＡＢ法提取植物组织基因组 ＤＮＡ
取植株韧皮部和叶脉部位经液氮研磨后ꎬ采用
ＣＴＡＢ法[１２]提取其基因组 ＤＮＡꎮ 经 １％琼脂糖凝
胶电泳检测 ＤＮＡ的质量并测定其浓度ꎮ
１.５ Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ 扩增 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因和 ｒｐ
基因
以样品基因组 ＤＮＡ为模板ꎬ Ｐ１ / Ｐ７ 为引物进
行 ＰＣＲ扩增ꎬ将其 ＰＣＲ 产物按照 １ ∶ １０ 稀释作为
模板ꎬ以 Ｒ１６Ｆ２ｎ / Ｒ２为引物进行 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲꎬ用于
１６Ｓ ｒＤＮＡ 基因的扩增ꎮ Ｐ１ / Ｐ７ 和 Ｒ１６Ｆ２ｎ / Ｒ２ 引
物的 ＰＣＲ 反应程序均为:９４℃预变性 ２ ｍｉｎꎬ９４℃
４５ ｓꎬ５５℃ ６０ ｓꎬ７２℃ ９０ ｓꎬ３５ 个循环ꎻ７２℃延伸 ７
ｍｉｎ[１１]ꎮ 同时也对其样品 ｒｐ 基因进行扩增ꎬ ｒｐＩＢ
和 ｒｐｓＣ / ｒｐＩＰ为引物进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ将其 ＰＣＲ 产
物按照 １ ∶ １０稀释作为模板ꎬ以 ｒｐ(Ｖ)Ｆ１Ａ / ｒｐ(Ｖ)
Ｒ１Ａ 为引物进行 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲꎮ ｒｐＩＢ / ｒｐｓＣ / ｒｐＩＰ 和
ｒｐ(Ｖ) Ｆ１Ａ / ｒｐ(Ｖ)Ｒ１Ａ 引物的 ＰＣＲ 反应程序均
为:９４℃预变性 １１ ｍｉｎꎬ９４℃ １ ｍｉｎꎬ５０℃ ２ ｍｉｎꎬ
７２℃ ３ ｍｉｎꎬ３８ 个循环ꎻ７２℃延伸 ７ ｍｉｎꎮ １％琼脂
糖凝胶电泳后观察扩增产物目标条带[９]ꎮ
１.６ １６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｒｐ基因克隆及其序列分析
纯化的 ＰＣＲ 产物连接到 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体
(ＴａＫａＲａ)ꎬ转化到 Ｅ. ｃｏｌｉ 菌株 ＤＨ５α 感受态细
胞ꎬ涂布于含 Ａｍｐ 的 ＬＢ 平板上ꎬ３７℃培养过夜ꎬ
挑选单菌落ꎬ以菌液为模板ꎬ进行 ＰＣＲ 扩增及琼脂
糖电泳检测ꎮ 经 ＰＣＲ鉴定为阳性的重组质粒送南
２
１期 王利平ꎬ等:来源于湖北省枣疯病植原体分离物 １６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｒｐ基因的序列分析
京金斯瑞生物科技有限公司进行测序ꎮ 将所得
ＤＮＡ序列输入到 ＧｅｎＢａｎｋ(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.
ｎｉｈ.ｇｏｖ)进行 Ｂｌａｓｔ检索ꎬ选择相应序列下载ꎬ采用
ＤＮＡＭＡＮ、ＣｌｕｓｔｅｒＸ和 ＭＥＧＡ ４ 软件[１３ꎬ１４]对所得
到的核苷酸序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中收录的其他相应基
因的核苷酸序列进行比较和分析ꎬ构建系统进化
树ꎮ
１.７ １６Ｓ ｒＤＮＡ基因的虚拟 ＲＦＬＰ分析
采用 Ｚｈａｏ等[６]在线植原体分类工具 ｉＰｈｙＣｌａ￣
ｓｓｉｆｉｅｒ( ｈｔｔｐ: / / ｐｌａｎｔｐａｔｈｏｌｏｇｙ. ｂａ. ａｒｓ. ｕｓｄａ. ｇｏｖ / ｃｇｉ￣
ｂｉｎ / ｒｅｓｏｕｒｃｅ / ｉｐｈｙｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ.ｃｇｉ)对测定的 １６Ｓ ｒＤＮＡ
序列进行相似性系数分析和 １７ 种酶的虚拟 ＲＦＬＰ
分析ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 枣疯病田间症状观察结果
２０１０年 １１ 月调查湖北省随州市随县的枣树
感染植原体病害危害症状ꎬ结果表明ꎬ田间种植蜜
枣疑似感染植原体ꎬ表现为丛枝、小叶ꎬ节间缩短ꎬ
树势衰退ꎻ茎干周围有大量的分蘖症状(图 １)ꎮ
２.２ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ不同分离物 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因的
Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ检测结果
以疑似植原体病害的枣树样品的总 ＤＮＡ 为
模板ꎬＰ１ / Ｐ７和 Ｒ１６Ｆ２ｎ / Ｒ２为引物对其 １６Ｓ ｒＤＮＡ
基因进行 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲꎬ电泳检测结果表明ꎬ疑似植
原体引起枣疯病病害的 ４ 个样品均检测到约为
１ ２ ｋｂ单一条带ꎬ与预期目标片段大小一致ꎬ阴性
对照的健康植株样品没有目标片段ꎮ
２.３ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 分离物 ｒｐ 基因的 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ
结果
以疑似植原体病害的枣树样品的总 ＤＮＡ 为
模板ꎬ以 ｒｐＩＢ / ｒｐｓＣ / ｒｐＩＰ和 ｒｐ(Ｖ)Ｆ１Ａ / ｒｐ(Ｖ)Ｒ１Ａ
为引物对其 ｒｐ 基因进行 Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲꎬ电泳检测结
果表明ꎬ疑似植原体的 ４个样品均检测到一条约为
１.２ ｋｂ的条带ꎬ与预期目标片段大小一致ꎬ而健康
植株样品没有扩增到目标片段ꎮ
２.４ 枣疯病分离物 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因的序列分析
将来源于湖北枣树产区感染枣疯病的 ４ 个分
离物扩增的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因 ＰＣＲ 产物进行回收、
克隆ꎬ每个样品选取 ３个阳性克隆进行测序ꎮ 序列
分析结果表明ꎬ４ 个分离物的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因克隆
片段大小均为 １ ２４７ ｂｐꎬ序列同源性为 １００％ꎬ与
１６ＳｒＶ 组内其他分离物的核苷酸序列同源性均高
于 ９０％ꎮ 选取 １ 个分离物ꎬ命名为 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ
( Ｊｕｊｕｂｅ ｗｉｔｃｈｅｓ′￣ｂｒｏｏｍ￣Ｈｕｂｅｉ)ꎬ登录在 ＧｅｎＢａｎｋ
(ＪＱ９７９４３９)ꎮ 将 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 分离物与 ＧｅｎＢａｎｋ
上登录的来源于不同国家不同寄主ꎬ代表基于
１６Ｓ ｒＤＮＡ基因分类的不同组以及 １６ＳｒＶ组内 ５ 个
不同亚组分离物的 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列ꎬ进行进化
树构建并对其遗传进化关系分析ꎬ结果表明ꎬ来源
Ｆｉｇ. １ Ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｊｕｊｕｂｅ ｔｒｅｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ
Ａ: Ｊｕｊｕｂｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍ ｗｉｔｈ ｗｉｔｃｈｅｓ′￣ｂｒｏｏｍꎬ ｌｉｔｔｌｅ ｌｅａｖｅｓꎻ
Ｂ: Ｊｕｊｕｂｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍ ｏｆ ｔｉｌｌｅｒｉｎｇ ａｒｏｕｎｄ ｔｒｅｅ ｔｒｕｎｋ.
３
植物病理学报 ４４卷
于湖北的 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ与来源于我国不同地区的枣
疯病分离物均聚集为同一亚组不同进化分支ꎬ且与
来源于我国山东、陕西分离物聚集为同一进化分
支ꎮ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ分离物与报道的归属于 １６ＳｒＶ￣Ｂ
亚组的枣疯病( ＪＷＢ)和樱桃致死黄化病(ＣＬＹ￣５)
分离物[１５]聚集在同一亚组ꎬ表明 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 分离
物与 １６ＳｒＶ￣Ｂ 亚组亲缘关系最近ꎻ与已报道代表
植原体 １６Ｓｒ其他不同组的分离物在进化树中分别
位于不同组群、遗传关系较远ꎬ与来源于同一组
１６ＳｒＶ的 ４ 个不同亚组在进化树中分别位于同一
组群不同亚组(图 ２)ꎮ
２.５ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 分离物 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因 ＲＦＬＰ
分析
采用在线植原体分类工具 ｉＰｈｙＣｌａｓｓｉｆｉｅｒ 对
ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ分离物 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列进行 １７ 种
酶的 ＲＦＬＰ分析ꎬ结果表明ꎬＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 分离物与
在系统进化中聚集为一簇的 １６ＳｒＶ￣Ｂ 亚组的 ＪＷＢ
和 ＣＬＹ￣５具有相同的模拟 ＲＦＬＰ酶切图谱(图 ３)ꎬ
基于 ＲＦＬＰ酶切图谱的相似系数也为 １.００ꎬ与 Ｌｅｅ
等[９]的 １６ＳｒＶ其他亚组图谱不同ꎬ相似系数均低
于 ０.９７ꎮ 因此ꎬＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ分离物是 １６ＳｒＶ￣Ｂ亚组
的一个成员ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ３２ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ
ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ １６Ｓｒ ｇｒｏｕｐ / ｓｕｂｇｒｏｕｐ
Ｔｈｅ ｎｅａｒｌｙ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ３２
ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ａｓ ｓｔｒａｉｎ ｎａｍｅ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｏｒｉｇｉｎꎬ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ＲＦＬＰ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ｏｎ １６Ｓｒ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅ. Ｔｈｅ ｔｒｅｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ (ＭＥＧＡ ４.０) . Ｎｏｄａｌ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ １０００ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ.
Ｔｈｅ ｂａｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ０.００１ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｓｉｔｅ. Ｏｎｌｙ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ>５０％ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ.
４
１期 王利平ꎬ等:来源于湖北省枣疯病植原体分离物 １６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｒｐ基因的序列分析
Ｆｉｇ. ３ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ￣ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｐｕｔａｔｉｖｅ ＲＦＬＰ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｆｒｏｍ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｓｔｒａｉｎ
ＭＷ: Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒ ΦＸ１７４ ＨａｅⅢ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ. Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｓｉｚｅ (ｂｐ) ｗｅｒｅ ( ｆｒｏｍ ｔｏｐ ｔｏ ｂｏｔｔｏｍ) １ ３５３ꎬ
１ ０７８ꎬ ８７２ꎬ ６０３ꎬ ３１０ꎬ ２８１ꎬ ２７１ꎬ ２３４ꎬ １９４ꎬ １１８ ａｎｄ ７２ ｂｐ.
２.６ 枣疯病分离物 ｒｐ基因的序列分析
将湖北省蜜枣产区感染枣疯病的 ４ 个分离物
的 ｒｐ基因 ＰＣＲ 产物分别回收、克隆ꎬ每个样品选
取 ３个阳性克隆进行测序ꎮ 序列分析结果表明ꎬ４
个分离物的 ｒｐ 基因克隆片段大小均为 １ １９６ ｂｐꎬ
对应编码完整 ｒｐＬ２２ 和 ｒｐＳ３ 蛋白以及部分 ｒｐＳ１９
蛋白基因的核苷酸ꎬ分离物之间序列同源性为
１００％ꎮ 该分离物 ｒｐｌ２２￣ｒｐｓ３ 基因核苷酸序列与
１６ＳｒＶ 组内不同亚组其他分离物的同源性均高于
９０％ꎬ与报道的来源于我国不同地区枣疯病分离物
核苷酸差异 １￣３ 个碱基ꎮ 将其 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 分离物
ｒｐｌ２２￣ｒｐｓ３ 基因序列登录在 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库上
(ＪＱ９７９４４０)ꎮ 将来源于湖北枣疯病分离物 ＪＷＢ￣
Ｈｕｂｅｉ以及选取有代表性的在 ＧｅｎＢａｎｋ 上登录的
来源于 １６ＳｒＶ组内基于 ｒｐ 基因 ＲＦＬＰ分类归属于
ｒｐＶ 不同亚组的的代表性分离物序列进行进化树
分析ꎬ结果表明ꎬ湖北枣疯病分离物 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 与
来源于山东、陕西省以及大连市不同分离物在进化
树中位于同一亚组不同分支ꎬ且与报道的归属于
ｒｐＶ￣Ｃ亚组的中国枣疯病分离物 ＪＷＢ(ＧｅｎＢａｎｋ
登录号 ＡＹ１９７６８１)序列聚集在一起位于同一亚
组ꎬ遗传关系较近ꎻ该分离物与已报道的在进化树
中位于 ｒｐＶ其他不同亚组分离物聚集于不同分支ꎬ
遗传关系较远(图 ４)ꎮ
３ 讨论与结论
枣疯病是植原体引起的在我国普遍发生的一
种重要病害ꎬ给枣树产业造成严重损失ꎮ 在我国发
生严重的一些地区ꎬ如北京、山西、陕西、河北、河
南、山东等地均有对枣疯病病原鉴定、分类ꎬ传播方
式以及遗传变化等相关研究的报道ꎬ为枣疯病防治
策略的制订提供信息[７ꎬ１０]ꎮ 目前为止ꎬ湖北省已有
枣疯病病害发生报道ꎬ但对其病原植原体的 １６Ｓ
ｒＤＮＡ和 ｒｐ基因序列尚未见报道ꎬ未明确其湖北
省枣疯病植原体分子水平上的分类地位ꎮ
本研究通过湖北省随县枣树感染植原体引起
枣疯病进行田间症状调查ꎬ采用分子生物学方法ꎬ
对其 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因进行虚拟 ＲＦＬＰ 分析ꎬ结果表
明 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ分离物 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因的 ＲＦＬＰ 酶
切图谱与分类属于 １６ＳｒＶ￣Ｂ 亚组的樱桃致死黄化
植原体 ＣＬＹ￣５ 分离物图谱一致ꎬ表明 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ
分离物属于 １６ＳｒＶ￣Ｂ 亚组的一个成员(图 ２)ꎻ１６Ｓ
ｒＤＮＡ基因核苷酸序列分析表明ꎬＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 分离
物与 １６ＳｒＶ￣Ｂ 亚组植原体分离物的同源性高达
９９.８％ꎬ在进化树中与来源于我国山东、陕西两省
植原体聚集为一簇(图 ２)ꎻｒｐｌ２２￣ｒｐｓ３ 基因序列分
析结果表明ꎬＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 分离物与来源于山东、陕
西省以及大连市不同分离物在进化树中位于同一
５
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｐｌ２２￣ｒｐｓ３ ｆｒｏｍ
ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ
ｔｈｅ １６ＳｒＶ￣ｇｒｏｕｐ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ (Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４) ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ
Ｔｈｅ ｒｐｌ２２￣ｒｐｓ３ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ２０ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ
ｉｓｏｌａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ａｓ ｓｔｒａｉｎ ｎａｍｅ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｏｒｉｇｉｎꎬ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒꎬ ａｎｄ ＲＦＬＰ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｕｂｇｒｏｕｐ ｂａｓｅｄ
ｏｎ ｒｐＶ ｌｅｖｅｌ. Ｎｏｄａｌ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ １０００ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ. Ｔｈｅ ｂａｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ０.００５ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ
ｐｅｒ ｓｉｔｅ. Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ (>５０％) ｆｏｒ １０００ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ ｏｎ ｂｒａｎｃｈｅｓ.
亚组不同分支ꎬ与 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因遗传进化趋势一
致(图 ２、图 ４)ꎬ表明 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 分离物与我国不
同地区枣疯病分离物均为同一个种ꎬ不存在株系的
分化ꎻ揭示了我国不同的 ＪＷＢ 分离物的亲缘关系
呈现一定的地域相关性ꎮ
植原体 １６Ｓ ｒＤＮＡ和 ｒｐ 基因均为植原体比较
保守的基因序列ꎬ可对植原体进行分子水平上的分
类鉴定ꎬ揭示植原体之间遗传进化关系[１５~１８]ꎮ 本
研究结果表明ꎬＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ与引起樱桃致死黄化病
ＣＬＹ￣５分离物基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因序列分析均属
于 １６ＳｒＶ￣Ｂ亚组ꎻ基于其 ｒｐｌ２２￣ｒｐｓ３ 基因序列分析
表明ꎬＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ和 ＣＬＹ￣５核苷酸之间有 １０ 个碱
基的差异ꎬ在进化树中分别位于 ｒｐＶ￣Ｃ和 ｒｐＶ￣Ｂ亚
组的 ２个不同分支ꎬ亲缘关系较远ꎬ表明从 ｒｐ 基因
上来看ꎬ ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ 和 ＣＬＹ￣５ 存在株系的差异ꎮ
该结果揭示了 ｒｐ 基因序列保守性较 １６Ｓ ｒＤＮＡ
低ꎬ序列可变性强ꎬ因此ꎬ相对于 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因序
列有较大变异的 ｒｐ基因序列更适合于亲缘关系比
较近的植原体亚组及株系分类鉴定ꎬ以获取更丰富
的系统发育进化关系 [３ꎬ７ꎬ１０] ꎮ 本研究结果也表明ꎬ
基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因序列虚拟 ＲＦＬＰ 图谱分析与
其进化树分析结果一致ꎬ进一步明确了 ＪＷＢ￣Ｈｕｂｅｉ
的分类地位ꎬ属于 １６ＳｒＶ￣Ｂ 亚组一个成员ꎻ同时也
揭示了 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因序列模拟 ＲＦＬＰ 可以对植
原体进行快速、准确、高效的分类鉴定ꎮ
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责任编辑:于金枝
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