全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５１９４ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
周香艳，张宁，刘柏林，裴瑞芳，司怀军，王蒂．犃犚犉基因干扰表达对不同发育阶段和贮藏条件马铃薯酶活性的影响．草业学报，２０１６，２５（４）：
１３３１３９．
ＺＨＯＵＸｉａｎｇＹａｎ，ＺＨＡＮＧＮｉｎｇ，ＬＩＵＢａｉＬｉｎ，ＰＥＩＲｕｉＦａｎｇ，ＳＩＨｕａｉＪｕｎ，ＷＡＮＧＤｉ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＲＮＡｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅ犃犚犉ｇｅｎｅｏｎｅｎｚｙｍｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓａｎｄｓｔｏｒａｇｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｉｎｐｏｔａｔｏ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（４）：１３３１３９．
犃犚犉基因干扰表达对不同发育阶段和
贮藏条件马铃薯酶活性的影响
周香艳１，２，张宁１，刘柏林２，３，裴瑞芳１，３，司怀军１，３，王蒂２，３
（１．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０；３．甘肃省作物遗传改良与
种质创新重点实验室，甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室培育基地，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：以前期研究获得的马铃薯栽培品种“甘农薯２号”ＡＤＰ核糖基化因子（犃犚犉）基因干扰表达转化植株为材料，
用ｑＲＴ－ＰＣＲ法对转基因植株的犃犚犉基因表达量进行了测定，结果表明，不同发育阶段转基因叶片中犃犚犉基因
的相对表达量先降低，生长后期略有增加，表明犃犚犉基因干扰表达量随马铃薯生长发育发生改变。犃犚犉基因干
扰表达影响马铃薯叶片中酶活性，不同发育阶段转基因叶片与对照相比，多酚氧化酶（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ）活
性升高１１．６１％～２７．８４％，硝酸还原酶（ｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＮＲ）活性提高２１．１０％～４１．３２％，磷脂酶Ｄ（ｐｈｏｓｐｈｏ
ｌｉｐａｓｅＤ，ＰＬＤ）活性降低２．８８％～５７．６４％，蔗糖磷酸合成酶（ｓｕｃｒｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＰＳ）活性提高
２９．００％～３９．５７％；不同温度（４℃和室温）贮藏的块茎中犃犚犉基因的相对表达量变化趋势一致：均先降低，再升
高，但前者较后者犃犚犉 基因相对表达量显著降低。室温较４℃贮藏的转基因块茎ＰＰＯ 活性升高３０．４４％～
５６．２８％，ＮＲ活性提高１７．４１％～４０．９２％，ＰＬＤ活性降低２４．３９％～８５．１１％，ＳＰＳ活性提高３０．８９％～４５．７８％。
室温较４℃贮藏的非转基因块茎ＰＰＯ活性升高２５．１１％～７０．６６％，ＮＲ活性提高３６．０７％～８９．６２％，ＰＬＤ活性降
低１１．３５％～７２．６４％，ＳＰＳ活性提高２７．３１％～６１．３３％。本研究通过探讨犃犚犉基因干扰表达对马铃薯生理生化
特性的影响，为进一步研究犃犚犉基因在马铃薯生长发育调控中的作用提供一定的理论基础。
关键词：马铃薯；犃犚犉基因；干扰表达；转基因植株；酶活性
犈犳犳犲犮狋狊狅犳犚犖犃犻犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳狋犺犲犃犚犉犵犲狀犲狅狀犲狀狕狔犿犲犪犮狋犻狏犻狋狔犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋
犱犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犪犾狊狋犪犵犲狊犪狀犱狊狋狅狉犪犵犲狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狊犻狀狆狅狋犪狋狅
ＺＨＯＵＸｉａｎｇＹａｎ１，２，ＺＨＡＮＧＮｉｎｇ２，ＬＩＵＢａｉＬｉｎ２，３，ＰＥＩＲｕｉＦａｎｇ１，３，ＳＩＨｕａｉＪｕｎ１，３，ＷＡＮＧＤｉ２，３
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪；２．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃犵狉狅狀狅犿狔，
犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪；３．犌犪狀狊狌犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犆狉狅狆犌犲狀犲狋犻犮犪狀犱犌犲狉犿狆犾犪狊犿犈狀犺犪狀犮犲犿犲狀狋，
犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犻犪犾犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犃狉犻犱犾犪狀犱犆狉狅狆犛犮犻犲狀犮犲，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡＤＰｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ（犃犚犉）ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｉｎａｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｏｔａｔｏｃｕｌｔｉｖａｒ“Ｇａｎ
ｎｏｎｇｓｈｕ２”ｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅ犃犚犉ｇｅｎｅｖａｒｉｅｄｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓ
ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｌｉｇｈｔｌｙａｔｌａｔｔｅｒｇｒｏｗｔｈｓｔａｇｅｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔ犃犚犉ｇｅｎｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖａｒｉｅｄｗｉｔｈｍａ
第２５卷 第４期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１３３－１３９
２０１６年４月
收稿日期：２０１５０４１４；改回日期：２０１５０７０６
基金项目：甘肃农业大学盛彤笙科技创新基金项目（ＧＳＡＵＳＴＳ１３３３），国家自然科学基金项目（３１１６０２９８），甘肃省杰出青年基金项目
（１３０８ＲＪＤＡ０１１）和甘肃省农业科技创新项目（ＧＮＣＸ２０１２４９）资助。
作者简介：周香艳（１９８３），女，内蒙古包头人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｘｙ２００８ｂｊ＠１６３．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｈｊｓｉ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｔｕｒｉｔｙ．Ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｌｅａｖｅｓｗａｓｅｆｆｅｃｔｅｄｂｙ犃犚犉ｇｅｎｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｆｏｒｌｅａｖｅｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓ，ＰＰＯａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１１．６１％－２７．８４％，ＮＲａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ
２１．１０％－４１．３２％，ＰＬＤａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ２．８８％－５７．６４％ ＳＰＳａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ２９．００％－３９．５７％
ｗｈｅｎｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅ犃犚犉ｇｅｎｅｉｎｓｔｏｒｅｄｔｕｂｅｒｓｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｏｒａｇｅ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ（ｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄ４℃）ｓｈｏｗｅｄｔｈｅｓａｍｅｔｒｅｎｄ；ｉｎｉｔｉａｌｙｄｅｃｒｅａｓｉｎｇａｎｄｔｈｅｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ．Ｆｏｒ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｕｂｅｒｓｓｔｏｒｅｄａｔｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＰＰＯｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ３０．４４％－５６．２８％，ＮＲａｃｔｉｖｉｔｙ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１７．４１％ －４０．９２％，ＰＬＤａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ２４．３９％ －８５．１１％，ＳＰＳａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ
３０．８９％－４５．７８％ ｗｈｅｎｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｕｂｅｒｓｓｔｏｒｅｄａｔ４℃．Ｆｏｒｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｕｂｅｒｓｓｔｏｒｅｄａｔ
ｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＰＰＯａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ２５．１１％－７０．６６％，ＮＲａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ３６．０７％－８９．６２％，
ＰＬＤａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ１１．３５％－７２．６４％ａｎｄＳＰＳａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ２７．３１％－６１．３３％．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｎｖｅｓｔｉ
ｇａｔｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＲＮＡｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犃犚犉ｇｅｎｅｏｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｐｏｔａｔｏｔｏ
ｐｒｏｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｒｏｌｅｏｆｔｈｅ犃犚犉ｇｅｎｅｉｎｐｏｔａｔｏｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄｓｔａｇｅｏｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｐｏｔａｔｏ；犃犚犉ｇｅｎｅ；ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ＡＤＰ核糖基化因子（ＡＤＰｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，犃犚犉）是犚犪狊基因超家族的成员，它们是大小约２０ｋＤａ的鸟
嘌呤核苷酸结合蛋白，属于小Ｇ蛋白超家族中的犃犚犉亚家族［１２］。犃犚犉于１９８２年被Ｋａｈｎ和Ｇｉｌｍａｎ［３］最早发
现并纯化出该类细胞因子，将其命名为犃犚犉，其普遍存在于真核生物细胞中，结构和功能在动植物演化发展中高
度保守［４］。近年来，人们发现犃犚犉的重要生理功能之一是作为磷脂酶Ｄ的激活剂［５６］。马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌
犫犲狉狅狊狌犿）具有产量高、营养丰富、适应性强等优良特性以及随着马铃薯产业的不断壮大和人们消费结构的变化，
马铃薯品质育种工作正在受到重视［７］。
在前期研究中获得了犃犚犉基因干扰表达转基因马铃薯植株［８］，Ｚｕｋ等［９］推测犃犚犉基因的抑制表达会激活
１４３３蛋白基因，１４３３蛋白基因对硝酸还原酶和蔗糖转化酶的活性有一定的影响，同时会使具有抗氧化能力的
酚类物质含量降低。为此，本研究通过对马铃薯犃犚犉干扰表达植株的犃犚犉 基因相对表达量、多酚氧化酶（ｐｏｌｙ
ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ）、硝酸还原酶（ｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＮＲ）、磷脂酶Ｄ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＤ，ＰＬＤ）、蔗糖磷酸合成
酶（ｓｕｃｒｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＳＰＳ）活性进行测定，研究犃犚犉基因干扰表达对以上酶活性变化的影响，以期阐
明犃犚犉基因对马铃薯生理生化特性影响的机理，从而为进一步研究犃犚犉基因在马铃薯生长发育调控中的作用
提供一定的理论基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
犃犚犉基因干扰表达载体ｐＨｅｌｓｇａｔｅａｒｆ１（含组成型表达启动子ＣａＭＶ３５Ｓ）由甘肃农业大学刘柏林博士构建，
抗性标记为卡那霉素（ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）和壮观霉素（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ，Ｓｐｅ）。马铃薯品种“甘农薯２号”转犃犚犉基
因干扰表达载体转基因株系Ｚ１２（干扰程度为９３．２２％）微型薯［８］，由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验
室提供。于２０１４年６月５日，在甘肃农业大学温室将转基因和未转基因马铃薯微型薯种植于直径为１８ｃｍ的花
盆中，每盆４株。采用自然光照，生长期间保证植株正常生长的水肥要求。
１．２ 方法
１．２．１ 转基因植株实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测 对于温室种植的每个植株，生长３０ｄ后，每１５ｄ
采取植株叶片，迅速用液氮冷冻，保存于－８０℃冰箱中。收获后，每１５ｄ采取不同贮存条件下（室温和４℃）的马
铃薯块茎，迅速用液氮冷冻，保存于－８０℃冰箱中。对不同发育阶段的马铃薯叶片和采收后不同贮存条件下（室
温和４℃）的马铃薯块茎，分别提取植株的总ＲＮＡ，用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ反转录试
剂进行反转录，具体操作按产品说明书进行。以马铃薯犲犳１犪基因为内参（扩增引物为犲犳１犪Ｆ：５′ＣＡＡＧＧＡＴ
４３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
ＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＡＧ３′和犲犳１犪Ｒ：５′ＴＴＣＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＣＧＣＣＴＧＴ３′），以犃犚犉基因序列设计１对特异性引
物犃犚犉Ｆ：５′ＧＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴ３′和犃犚犉Ｒ：５′ＣＣＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡＣ３′。重复３
次，利用ＳＹＢＲ荧光染料法进行转基因植株的ｑＲＴＰＣＲ检测与分析，根据２－ΔΔ犆狋方法［１０］计算犃犚犉基因的相对
表达量。基因表达分析均以对照为参照进行相对表达比较［１１］。计算公式为：犚犙（相对表达量）＝２－ΔΔ犆狋，
ΔΔ犆狋＝（Δ犆狋处理样品－Δ犆狋犲犳１犪）－（Δ犆狋对照样品－Δ犆狋犲犳１犪）。
１．２．２ 转基因植株酶活性测定 测定不同发育
图１ 转基因植株犃犚犉基因表达的狇犚犜－犘犆犚检测
犉犻犵．１ 犚犲狊狌犾狋狅犳犃犚犉犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀狋犺犲
狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犫狔狇犚犜－犘犆犚犪狊狊犪狔
Ａ，Ｂ分别代表不同发育阶段叶片、室温和４℃储藏块茎犃犚犉基因在不
同时期的相对表达量。马铃薯犲犳１犪基因作为内参，开始处理第０天基因
的表达水平被设定为１，使用２－ΔΔ犆狋法计算基因的相对表达量。误差线
表示３个独立实验的标准偏差，使用邓肯氏新复极差法检验差异显著性，
不同小写字母表示０．０５水平差异显著。Ａ，Ｂｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎｑｕａｌｉｔｙｏｆ犃犚犉ｇｅｎｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ
ｓｔａｇｅｓａｎｄｉｎｓｔｏｒａｇｅｔｕｂｅｒｓｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｏｒａｇｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ｒｏｏｍ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄ４℃）．Ｔｈｅ犲犳１犪ｇｅｎｅｗａｓｃｈｏｓｅｎａｓｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｃｏｎｔｒｏｌ
ｆｏｒ犃犚犉ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｅａｃｈｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎ０ｄａｙｗａｓｓｅｔａｓ
１，ａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｆｏｌｏｗｉｎｇｄａｙｓｗｅｒｅｑｕａｎｔｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅ
２－ΔΔ犆狋ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｅｒｒｏｒｂａｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｓｏｂｔａｉｎｅｄ
ｆｒｏｍｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅａｓｓａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂａｓｅｄｏｎ
Ｄｕｎｃａｎ’ｓｎｅｗｍｕｌｔｉｐｌｅｒａｎｇｅｔｅｓｔ．Ｔｈｅｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔａ
ｔｉｓｔｉｃａｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔｔｈｅ０．０５ｌｅｖｅｌ．
阶段马铃薯叶片和不同贮存条件下（室温和４℃）马
铃薯块茎的酶（ＰＰＯ、ＮＲ、ＰＬＤ和ＳＰＳ）活性。ＰＰＯ
活性测定用比色法［１２］，ＮＲ活性测定用活体比色
法［１３］，ＰＬＤ活性测定用酶联比色法［１４］，ＳＰＳ活性测
定用蒽酮比色法［１５］。
１．３ 数据处理
所有试验均重复３次，采用 ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ
２００３进行绘图与数据处理，采用ＳＰＳＳ１７．０软件进
行差异显著性检验（犘＜０．０５）。
２ 结果与分析
２．１ 转基因植株的ｑＲＴ－ＰＣＲ检测与分析
以马铃薯犲犳１犪基因为内参，采用ｑＲＴ－ＰＣＲ
法对马铃薯不同发育阶段的叶片和不同贮藏温度
（室温和４℃）的块茎中犃犚犉基因的相对表达量进
行了检测。结果表明，不同发育阶段转基因和未转
基因叶片中犃犚犉基因的相对表达量均逐渐降低，
转基因叶片较同一生长期未转基因叶片犃犚犉基因
相对表达量低（图１Ａ）。室温贮藏的转基因微型薯
块茎中犃犚犉基因相对表达量先降低，７５ｄ后逐渐
升高，后期略有下降，而未转基因微型薯块茎中
犃犚犉基因相对表达量也先降低，贮藏６０ｄ后开始
增加（图１Ｂ）；４℃与室温贮藏无论转基因还是未转
基因微型薯中犃犚犉 基因相对表达量变化趋势一
致，但前者相对表达量显著低于后者（图１Ｂ）。
２．２ 不同发育阶段转犃犚犉基因与未转基因马铃
薯叶片酶活性变化
马铃薯微型薯种植３０ｄ后，每１５ｄ采取植株
叶片进行相关酶活性的测定。结果表明，转基因与
未转基因马铃薯叶片中，ＰＰＯ和ＮＲ活性随生长发
育不同，变化趋势一致，均为先升高后降低，但ＰＰＯ
在成熟期才开始降低，而ＮＲ在生长９０ｄ左右开始
降低（图２）。二者在对照中酶活性均低于基因干扰
表达叶片中的酶活性。对照ＰＬＤ活性先升高，后降
低，再升高；转基因马铃薯叶片ＰＬＤ持续升高，但其
含量低于对照（图２）。ＳＰＳ先升高后降低再升高，
５３１第２５卷第４期 草业学报２０１６年
对照中酶活性均低于基因干扰表达叶片中的酶活性（图２）。不同发育阶段转基因叶片与对照相比，ＰＰＯ酶活性
升高１１．６１％～２７．８４％，ＮＲ活性提高２１．１０％～４１．３２％，ＰＬＤ活性降低２．８８％～５７．６４％，ＳＰＳ活性提高
２９．００％～３９．５７％。
２．３ 贮藏温度对转犃犚犉基因和未转基因马铃薯酶活性影响
收获后，每１５ｄ采取不同贮存条件下（室温和４℃）的马铃薯块茎，测定其酶活性。结果表明，不同贮藏温度
（室温和４℃）下，转基因与非转基因马铃薯４种酶酶活性变化趋势基本一致。室温和４℃贮藏的转犃犚犉基因马
图２ 不同发育阶段转犃犚犉基因与未转基因（犆犓）马铃薯叶片酶活性变化比较
犉犻犵．２ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犲狀狕狔犿犲犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪狀犱狀狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犾犲犪狏犲狊狅犳狆狅狋犪狋狅狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犪犾狊狋犪犵犲
图３ 室温和４℃贮藏下转犃犚犉基因与未转
基因马铃薯犘犘犗活性变化
犉犻犵．３ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犘犘犗犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪狀犱
狀狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狌犫犲狉狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋狅狉犪犵犲
狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲（狉狅狅犿狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲犪狀犱４℃）
图４ 室温和４℃贮藏下转犃犚犉基因与未转
基因马铃薯犖犚活性变化
犉犻犵．４ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犖犚犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪狀犱
狀狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狌犫犲狉狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋狅狉犪犵犲
狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲（狉狅狅犿狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲犪狀犱４℃）
６３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
铃薯ＰＰＯ活性先升高，生长７５ｄ左右开始呈下降趋势（图３），室温较４℃ 贮藏的转基因块茎ＰＰＯ活性升高
３０．４４％～５６．２８％，非转基因块茎ＰＰＯ活性升高２５．１１％～７０．６６％；ＮＲ活性均呈下降变化趋势（图４），转基
因块茎ＮＲ活性提高１７．４１％～４０．９２％，非转基因块茎ＮＲ活性提高３６．０７％～８９．６２％；ＰＬＤ活性均先增高后
降低（图５），转基因块茎ＰＬＤ活性降低２４．３９％～８５．１１％，非转基因块茎ＰＬＤ活性降低１１．３５％～７２．６４％；
ＳＰＳ活性均先升高后降低再升高（图６），转基因块茎ＳＰＳ活性提高３０．８９％～４５．７８％，非转基因块茎ＳＰＳ活性
提高２７．３１％～６１．３３％。
图５ 室温和４℃贮藏下转犃犚犉基因与
未转基因马铃薯犘犔犇活性变化
犉犻犵．５ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犘犔犇犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪狀犱
狀狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狌犫犲狉狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋狅狉犪犵犲
狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲（狉狅狅犿狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲犪狀犱４℃）
图６ 室温和４℃贮藏下转犃犚犉基因与
未转基因马铃薯犛犘犛活性变化
犉犻犵．６ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犛犘犛犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪狀犱
狀狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狌犫犲狉狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋狅狉犪犵犲
狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲（狉狅狅犿狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲犪狀犱４℃）
３ 讨论
转基因技术是研究基因功能的基本手段，本研究测定了不同发育阶段叶片和不同贮藏温度微型薯犃犚犉基
因表达量和４种酶（ＰＰＯ、ＮＲ、ＰＬＤ和ＳＰＳ）活性，与对照相比，转基因株系不同发育阶段叶片和不同贮藏温度试
管薯的酶活性均有变化。不同发育阶段的叶片干扰相对表达量逐渐降低，说明干扰表达程度随着叶片的生长发
育呈增强趋势。室温贮藏的转基因和未转基因微型薯块茎中犃犚犉基因相对表达量主要呈先降低，后逐渐升高
的趋势。４℃与室温贮藏无论转基因还是未转基因微型薯中犃犚犉基因相对表达量变化趋势一致，但前者相对表
达量显著低于后者。结果表明，贮藏温度会影响块茎中犃犚犉基因的干扰表达程度，４℃贮藏时，干扰程度较明
显，而室温贮藏时，随着时间的延续，干扰程度减弱。Ｌｉｕ等［１６］研究分析表明犃犚犉基因在马铃薯块茎中表达量
最高，本研究也发现块茎中的表达量高于叶片。
酶是影响代谢的基本因素，是活细胞内能催化生化反应的生物催化剂，酶的活性变化是植物体内生理活性变
化的具体反映。新收获的马铃薯块茎在整个贮藏期间，从休眠到休眠解除、顶芽萌发生长，要经过一系列的物质
分解和合成，期间都是在相应酶的作用下引起的各种变化［１７］。ＰＰＯ仅在块茎休眠时活性较高，顶芽萌动后酶活
性迅速下降，是块茎休眠期间分生组织呼吸作用的末端氧化酶系统［１８］。ＳＰＳ在蔗糖代谢中起着重要的作用，它
不但是合成蔗糖的关键酶之一，还是光合产物向蔗糖和淀粉分配的调控关键点，所以它既影响植物生长发育，又
调节光合产物在蔗糖和淀粉之间的分配，同时它还参与细胞分化与纤维细胞壁合成［１９］。大量研究也证明了ＳＰＳ
活性对作物生育、抗老、物质分配等方面都有积极的影响。Ｄｏｅｈｌｅｒｔ和 Ｈｕｂｅｒ［２０］对大豆的研究表明ＳＰＳ是大豆
叶片中蔗糖合成的关键酶，也有研究指出ＳＰＳ在小麦旗叶光合产物向蔗糖转化过程中也起到关键调节作用［２１］。
７３１第２５卷第４期 草业学报２０１６年
ＮＲ是高等植物氮代谢过程中的一个重要的调节酶和限速酶。土壤水分过低或过高都不利于硝酸还原酶活性和
蔗糖转化酶活性的提高，在块茎形成、膨大期，马铃薯植株需水肥最多，吸收矿质营养也较多，因此，ＮＲ的活性逐
渐加强，后期又有所下降［２２］。
不同发育阶段，转基因与未转基因马铃薯叶片中，ＰＰＯ和ＮＲ活性变化趋势一致，均先升高后降低，但ＰＰＯ
在成熟期才开始降低，而ＮＲ在生长９０ｄ左右开始降低。二者在对照中酶活性均低于基因干扰表达叶片。对照
ＰＬＤ活性先升高，后降低，再升高；转基因马铃薯叶片持续升高，但其含量低于对照。ＳＰＳ先升高后降低，再升
高，对照中酶活性均低于基因干扰表达叶片。不同发育阶段转基因叶片与对照相比，ＰＰＯ、ＮＲ和ＳＰＳ活性均升
高，ＰＬＤ活性降低，这与Ｚｕｋ等［９］的研究结果一致。Ｚｕｋ等［９］证实，抑制马铃薯犃犚犉基因的表达会导致１４３３
蛋白基因的激活，１４３３蛋白基因对ＮＲ和ＳＰＳ的活性有一定的影响，同时会使具有抗氧化能力的酚类物质含量
降低。本研究中，犃犚犉基因干扰表达时，ＰＰＯ的活性升高，会催化更多的酚类物质转化为醌类物质，因此酚类物
质含量降低。犃犚犉的重要生理功能之一是作为ＰＬＤ的激活剂［５６］，本研究中犃犚犉基因的表达受到干扰，导致
ＰＬＤ的活性降低。
贮藏温度会影响转基因和未转基因马铃薯酶活性，这与Ｚｕｋ等［９］、Ｂｒｏｗｎ等［５］和Ｏｒｃｉ等［６］的研究结果相一
致。不同贮藏温度（室温和４℃）下，转基因与非转基因马铃薯４种酶酶活性变化趋势基本一致。无论转基因还
是非转基因植株，室温较４℃贮藏的块茎，ＰＰＯ、ＮＲ和ＳＰＳ活性均升高，只有ＰＬＤ活性下降。研究表明，玉
米［２３］、菠菜、胡萝卜［２４］、刺槐［２５］等多种植物在冷害条件下，ＰＬＤ活性均升高。ＰＬＤ活性在低温下升高的机理有
待进一步研究。
４ 结论
马铃薯犃犚犉基因干扰表达转基因植株中，在不同发育阶段和不同贮藏温度下犃犚犉基因的干扰程度不同，
导致转基因和未转基因植株ＰＰＯ、ＮＲ、ＰＬＤ和ＳＰＳ活性均发生了不同程度的变化。研究结果为进一步研究
犃犚犉基因在马铃薯生长发育调控中的作用奠定了基础。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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９３１第２５卷第４期 草业学报２０１６年