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Research on tissue culture and medium of Nitraria tangutorum

唐古特白刺组织培养及其培养基筛选研究



全 文 :书唐古特白刺组织培养及其培养基筛选研究
郭晔红,蔺海明,武睿
(甘肃农业大学农学院,甘肃 兰州730070)
摘要:本试验选用唐古特白刺幼嫩茎段和叶片作为材料,研究白刺不同外植体的离体培养技术及其适宜的培养基。
结果表明,白刺带芽嫩茎是诱导丛生芽的良好外植体,恒温20℃以下,可有效降低白刺丛生芽初代培养污染严重的
程度;叶片是诱导愈伤组织的良好外植体,且低浓度生长素2,4D培养基较高浓度培养基形成的白刺愈伤组织致
密,也不易褐化。白刺的最适增殖、壮芽培养基为 MS+6BA2mg/L+NAA1.00mg/L,而且是以腋芽形成丛生
芽的方式进行增殖的;最适生根培养基是1/2MS+KT1mg/L+IBA0.5mg/L;形成愈伤组织较好的培养基是
MS+2,4D0.5~1.0mg/L。
关键词:唐古特白刺;组织培养;培养基;愈伤组织
中图分类号:Q943.1  文献标识码:A  文章编号:10045759(2009)06005906
   唐古特白刺(犖犻狋狉犪狉犻犪狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿)为蒺藜科(Zygophylaceae)白刺属(犖犻狋狉犪狉犻犪)植物,别名沙樱桃,俗称地
枣,是典型的沙旱生植物,在防风固沙、保护沙区绿洲中发挥着重要作用,白刺根寄生的锁阳(犆狔狀狅犿狅狉犻狌犿狊狅狀
犵犪狉犻犮狌犿),为传统名贵的温补药材[1]。近年来,从野生植物资源中寻找新的、潜在的药食同源植物,已成为国内外
学者研究的热点,而沙旱生植物白刺则是经过长期的自然筛选而保留下来的优胜者之一,白刺因其顽强的生命力
和优良的遗传基因而受到沙区人民的喜爱[2]。白刺果有调节血糖、血脂、降血压,显著提高人体免疫力、抗疲劳、
抗寒冷、增进睡眠等功效,白刺主要有效成分总糖、维生素E、铁、钙、必需氨基酸及黄酮类含量较高,因此还具有
开胃健脾,预防和治疗心脑血管疾病,抗衰老,滋补强体,保护化学性肝损伤的功效,白刺果不仅可以食用,以它为
优势种和建群种构成的草地还是我国风沙干旱地区家畜重要的天然牧场。
白刺在中国的分布主要是新疆和甘肃省,甘肃以河西走廊为白刺的主要分布区,总面积达18.8万hm2,然而
白刺品质退化相当严重,同时白刺种子存在高度休眠问题,这为人工大面积栽培和良种选育带来了很大的困难,
离体繁育技术则是保持白刺优良性状稳定性的重要途径之一[3,4]。国内外许多学者主要从植物生长量、生理特
性及经济利用等方面对白刺灌丛进行了研究,任臖和陶玲[5]对白刺属植物的生长效益进行了分析,贾宝全等[6]研
究了白刺灌丛沙包生物量的模型,常兆丰等[7]研究了白刺群落的自然更新,但是从药食同源的角度对白刺进行组
织培养的研究还少有所闻。王晨霞和陈贵林[8]进行了西伯利亚白刺的组织培养与快速繁殖的研究,张红晓和康
向阳[9]虽然对白刺组织培养和快速繁殖已有报道,但主要集中在组织快繁体系建立方面。王前等[10]用不同激素
浓度研究半夏植株再生结果认为,2,4D丁酯 (2,4D)、吲哚乙酸(IAA)和萘乙酸(NAA)有利于半夏(犘犻狀犲犾犾犻犪
狋犲狉狀犪狋犪)外植体的诱导,激动素(KT)对块茎的诱导率影响不大。而对白刺组织培养接种材料与培养基协同作用
进行研究的还未见报道,唐古特白刺具有果实圆润饱满、酸甜可口,有效成分高的优势,而且唐古特白刺寄生的中
药材锁阳品质较其他白刺种优良,因此本试验通过研究白刺接种材料与培养基协同作用,旨在确定唐古特白刺的
最佳组培材料与最佳培养基,为保持其优良性状和白刺资源快速更新复壮提供理论和技术依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验所采用的材料为唐古特白刺,于2007年5月中旬采自甘肃省靖远县,天气晴朗的午后14:00-16:00
第18卷 第6期
Vol.18,No.6
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA   
59-64
2009年12月
 收稿日期:20090525;改回日期:20090810
基金项目:甘肃省农牧厅农业生物技术专项(GNSW200707),甘肃省教育厅项目(070213)和甘肃省星火计划项目(5HS065A9100106)
资助。
作者简介:郭晔红(1968),女,内蒙包头人,副教授,在读博士。Email:guoyh@gsau.edu.cn
通讯作者。Email:linhm@gsau.edu.cn
时剪取当年生旺盛新枝,将白刺带芽和叶片茎段切成长4~5cm,带回实验室备用。在离体培养过程中,外植体
是决定培养是否成功的关键因素之一,大多数植物在其生长刚开始的季节采样较好,若在生长末期或休眠期采
样,外植体在培养中则往往反应迟钝或不能培养成功[11]。
外植体灭菌:将带回来的白刺茎段先用毛刷蘸洗涤剂溶液轻轻地刷洗,将刷洗后的茎段和叶片置于烧杯中,
用纱布封口后流水冲洗2~3h后,在超净工作台上,先用70%乙醇浸泡30s,再用0.1%升汞浸泡6min进行灭
菌,然后立即用无菌水冲洗4~6次,用灭菌滤纸吸干表面水分,用灭过菌的剪刀剪成约1.5cm左右的单芽茎段,
叶片沿叶脉剪几个裂口,接种于已灭菌的诱导培养基上[12,13]。
1.2 培养条件
试验所采用的基本培养基是 MS培养基,附加各种激素,每升培养基加糖30g,琼脂4.6g,pH值调为5.8
~6.0。组培室条件为温度25℃,光照度为2000~3000lx,光照时间为14~16h/d[14]。
1.3 方法
1.3.1 启动培养 愈伤组织诱导选择白刺叶片为外植体,再分别附加0.5,1.0,1.5,2.0mg/L2,4D,在IBA
0.5mg/L+6苄氨基嘌呤(6BA)0.2mg/L的 MS培养基上进行诱导培养,依次用D1、D2、D3、D4表示,以不加
2,4D的 MS培养基作对照,用CK表示,3次重复,30d后统计出愈率、死亡率及愈伤组织生长状况。
丛生芽的诱导采用不同的诱导培养基:吲哚丁酸(IBA)0.5,1.0,1.5mg/L分别接种于 MS和1/2MS培养
基上,分别以不加IBA培养基作对照,3次重复。
1.3.2 增殖培养 增殖培养选择 MS培养基,分别添加6BA2mg/L+NAA0.25mg/L、6BA2mg/L+NAA
0.5mg/L、6BA2mg/L+NAA0.75mg/L、6BA2mg/L+NAA1.00mg/L和6BA2mg/L+NAA1.25
mg/L,依次用N1、N2、N3、N4、N5表示,并用6BA2mg/L+NAA0mg/L作对照,用CK表示。每次接种20
个茎段,增殖培养30d后统计增殖系数和芽生物量,3次重复(统计数据均为3次试验结果的平均值)。
增殖系数=增殖后有效芽数/接种芽数
芽生物量=[增殖后试管苗重(g)-增殖前试管苗重(g)]/增殖芽数
1.3.3 生根培养 生根培养基分别选择:1/2MS+KT0.5mg/L+IBA1mg/L、1/2MS+KT1mg/L+IBA
0.5mg/L、1/4MS+ KT2mg/L+IBA0.5mg/L和1/4MS+KT1mg/L+IBA0.5mg/L;每1处理重复
3次。
2 结果与分析
2.1 启动培养
2.1.1 愈伤组织的诱导 以 MS为基本培养基,研究不同浓度生长素2,4D对白刺叶片愈伤组织的诱导,并筛
选白刺叶片愈伤组织诱导的最适培养基。经过10~15d的培养,可观察到白刺叶片周围有膨大组织的形成,可
见单独使用生长素2,4D能有效诱导白刺叶片形成愈伤组织(图1a)。
高浓度生长素2,4D对白刺叶片愈伤组织的诱导存在抑制作用,且与低浓度处理呈极显著性差异(犘<
0.01)(表1)。而低浓度对其有促进作用,当浓度在0.5~1.0mg/L时诱导效果较好,白刺出愈率达78%~
85%。试验还发现高浓度时形成的愈伤组织较松散,且易褐化;而低浓度时形成的愈伤组织较致密,不易褐化。
因此,低浓度的生长素2,4D对白刺叶片愈伤组织诱导效果较好,Tulyaganov等[15,16]在对西伯利亚白刺(犖.
狊犻犫犻狉犻犮犪)的研究中也得出过相同结论 ,本试验结果是当培养基的生长素2,4D浓度为1mg/L时,对白刺叶片愈
伤组织诱导效果最好,出愈率达85%,并与其他处理呈极显著性差异(犘<0.01)。
2.1.2 丛生芽的诱导 本试验选取带芽茎段为外植体,设计不同培养基及IBA浓度,观察白刺丛生芽的诱导情
况,来确定白刺丛生芽诱导的最佳启动培养基。结果表明,白刺带芽嫩茎在只加生长素IBA的培养基上很快诱
导腋芽分化出芽。在白刺丛生芽的诱导中,初代培养污染特别严重,用上述方式处理,污染率达到60%,而用升
汞处理8min以上,又导致外植体的死亡,研究还发现,在恒温20℃以下,可有效减少污染,在室温下接种第2天
就出现污染,第4天则全部污染,而恒温20℃以下,污染可减少到30%左右,接种10d后,接种的白刺单芽茎段
可长出叶片(图1b)。
06 ACTAPRATACULTURAESINICA(2009) Vol.18,No.6
图1 白刺组织培养过程
犉犻犵.1 犉狅狉犿犪狋犻狅狀狆狉狅犮犲狊狊狅犳犖.狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿狋犻狊狊狌犲犮狌犾狋狌狉犲
a:白刺丛生芽培养Tuftedshootformation;b:白刺叶片愈伤诱导Calusinducedfromleaf;c,d::白刺生根培养 Rooting
  MS培养基附加IBA0.5mg/L可更好地诱导白
刺嫩茎出芽,诱导率达100%,并与其他处理相比呈极
显著性差异(犘<0.01)。在同一基本培养基下,随着
生长素IBA浓度升高,其对丛生芽的诱导存在抑制作
用,在 MS培养基上,当生长素IBA的浓度从0.5升
高到1.0mg/L 时,诱导率呈显著下降趋势(犘<
0.05),升高到1.5mg/L时呈极显著下降趋势(犘<
0.01);在1/2MS培养基上,随生长素IBA的浓度升
高,各处理之间诱导率均呈极显著下降趋势(犘<
0.01);这一结果也得到了王友生等[17]对三叶草(犜狉犻
犳狅犾犻狌犿犺狔犫狉犻犱狌犿)和袁学军等[18]对假俭草(犈狉犲犿狅犮犺
犾狅犪狅狆犺犻狌狉狅犻犱犲狊)组织培养研究科学结论的支持;而在
不附加生长素IBA时,均不能诱导白刺产生丛生芽。
2.2 增殖培养
以MS为基本培养基,固定细胞分裂素6BA的
表1 不同浓度2,4犇对白刺叶片愈伤组织诱导的影响
犜犪犫犾犲1 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狅犳
2,4犇狅狀犖.狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿犾犲犪犳犮犪犾狌狊犻狀犱狌犮犻狀犵
培养基
Medium
激素
Hormone2,4D
(mg/L)
接种外植体数
No.of
explants
出愈率
Calusrate
(%)
CK 0.0 60 0.0E
D1 0.5 60 78.0B
D2 1.0 60 85.0A
D3 1.5 60 65.0C
D4 2.0 60 53.7D
 注:同列中,标有不同大写字母者差异极显著(犘<0.01),标有不同小
写字母者差异显著(犘<0.05),下同。
 Note:Valuesfolowedbydifferentuppercaseletterswithinlinesdiffer
significantly(犘<0.01),folowedbydifferentlowercaseletterswithin
linesdiffersignificantly(犘<0.05),thesamebelow.
16第18卷第6期 草业学报2009年
量为2mg/L,研究不同浓度萘乙酸(NAA)对白刺外植体芽增殖的影响,并确定其增殖的最佳培养基。白刺芽的
增殖系数和生物量均随NAA浓度的增大而增加(表3),但当NAA浓度超过1mg/L时,增殖系数和生物量均呈
极显著下降趋势(犘<0.01),即过高浓度的 NAA对白刺增殖培养有抑制作用。当 NAA浓度为0.25~1.00
mg/L时,愈伤组织的生物量随其浓度的增加而增加,且0.75~1.00mg/L的NAA浓度可极显著(犘<0.01)提
高白刺芽的增殖系数和生物量,说明适当浓度的萘乙酸对白刺愈伤组织的形成有促进作用。由此推断,白刺芽增
殖的最适培养基是:MS+6BA2mg/L+NAA1.00mg/L。
表2 不同培养基对白刺丛生芽诱导的影响
犜犪犫犾犲2 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿犲犱犻狌犿狅狀犖.狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿狊犺狅狅狋狊犿狌犾狋犻狆犾犻犮犪狋犻狅狀
处理号
Number
培养基
Medium
吲哚丁酸
IBA(mg/L)
接种外植体
Inducingexplants
死亡率
Deathrate(%)
出芽数
Sproutnumber(个Number)
诱导率
Inducingrate(%)
1 1/2MS 0.5 60 30.0cC 40cC 95.24abA
2 1/2MS 1.0 60 36.7bB 32eE 84.21cB
3 1/2MS 1.5 60 23.3dD 34eDE 73.91dC
4 1/2MS 0.0 60 100.0aA 0fF 0.00fF
5 MS 0.5 60 10.0fF 54aA 100.00aA
6 MS 1.0 60 21.7eE 44bB 93.62bA
7 MS 1.5 60 25.0cdCD 37dCD 82.22cB
8 MS 0.0 60 100.0aA 0fF 0.00fF
表3 不同增殖培养基对白刺芽增殖的影响
犜犪犫犾犲3 犈犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿犲犱犻狌犿狅狀犖.狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿狊狆狉狅狌狋狉犲狆狉狅犱狌犮犲狊
培养基 Medium
1/2MS
激素 Hormone
6苄氨基嘌呤6BA(mg/L)
萘乙酸
NAA(mg/L)
芽的增殖情况Sproutreproduce
增殖系数Reproducingcoefficient 生物量Biomass(g)
CK 2 0.00 0.50eE 0.15dD
N1 2 0.25 1.08dD 0.30cC
N2 2 0.50 1.12dD 0.35bcBC
N3 2 0.75 1.60cC 0.43bB
N4 2 1.00 2.27aA 0.58aA
N5 2 1.25 1.98bB 0.34cBC
在白刺芽的增殖培养中,产生愈伤组织较少,由此判断白刺是以腋芽形成丛生芽的方式进行增殖的,这一增
殖途径对保证白刺组培苗遗传性状稳定较为有利。李云[19]在林果花菜组织快速育苗技术一书中也阐述了相同
的研究结论。
但本试验结论与孙雪新和何正伦[20]所选增殖培养基为:MS+6BA0.2mg/L+IBA0.5mg/L的结果相差
较远。分析原因可能是所选白刺外植体材料的差异。由于唐古特白刺在自然状态下,种内及种间与大果白刺
(犖.狉狅犫狅狉狅狑狊犽犻犻)杂交非常普遍,而且不同产地和不同植龄的白刺外植体在不同培养条件下,培养结果均有所不
同,这还有待于今后对不同外植体做进一步的研究。
2.3 生根培养
根的生长状况是组培苗移栽成活的关键,增加健壮根的数量,既可提高白刺成活率,又可降低繁殖成本[21],
本试验选用1/2MS和1/4MS两种基本培养基,用不同浓度的KT和IBA两种激素搭配来诱导白刺根的生长,
确定其生根的最佳培养基。
26 ACTAPRATACULTURAESINICA(2009) Vol.18,No.6
结果表明,不同浓度的KT对白刺生根率和生根系数的影响与IBA密切相关,KT在2mg/L、IBA在0.5
mg/L时白刺生根系数最高,但生根率最低(图1c,d,表4),且与其他处理之间呈极显著差异(犘<0.01),不利于
移栽成活。而KT在1mg/L、IBA在0.5mg/L时生根率和生根系数均较大,有利于提高白刺移栽成活率,因此
判断白刺最适生根培养基是:1/2MS+KT1mg/L+IBA0.5mg/L。
表4 不同激素配比对白刺生根的影响
犜犪犫犾犲4 犈犳犳犲犮狋狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋狔狆犲狊狅犳犺狅狉犿狅狀犲狊狅狀犖.狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿狉狅狅狋犻狀犵
处理Treatment 培养基 Medium 激动素KT(mg/L) 吲哚丁酸IBA(mg/L) 生根率Rootingrate(%) 生根系数Rootingcoefficient
1 1/2MS 0.5 1.0 28cC 8.3aA
2 1/2MS 1.0 0.5 43bB 5.0bB
3 1/4MS 1.0 0.5 54aA 4.6cC
4 1/4MS 2.0 0.5 14dD 8.5aA
3 讨论
3.1 高浓度2,4D对白刺叶片愈伤组织的诱导存在抑制作用,低浓度对其有促进作用
王尚德[22]对唐古特白刺组织培养研究结果表明,唐古特白刺的愈伤组织植株再生困难。而本研究结果表
明,在2,4D浓度为1.0mg/L时白刺叶片愈伤组织诱导效果最好,出愈率达85%,且高浓度生长素2,4D培养
基较低浓度形成的白刺愈伤组织松散,且易褐化,这是因为高浓度2,4D加速了白刺愈伤组织对培养基中营养成
分的消耗。恒温20℃以下,可有效降低白刺丛生芽初代培养污染的程度,谭文澄和戴策刚[23]及葛淑俊等[24]对观
赏植物组织培养技术的研究结果也支持本试验的结论。白刺带芽嫩茎是诱导丛生芽的良好外植体,而叶片是诱
导愈伤组织的良好外植体,杨冰冰等[25]对香根草(犞犲狋犻狏犲狉犻犪狕犻狕犪狀犻狅犻犱犲狊)组织培养技术的研究也得出相同结论。
3.2 白刺是以腋芽形成丛生芽的方式进行增殖的,这一增殖途径有利于保证白刺组培苗的遗传稳定性
张红晓和康向阳[9]对西伯利亚白刺的研究结果是白刺愈伤组织在分化培养中先分化出根,但在其愈伤组织
的增殖培养过程中,发现根上始终未曾产生芽,认为是培养物上先形成根后抑制了芽的分化。本研究结果表明,
白刺芽的增殖系数和生物量均随NAA浓度的增大而增加,但当NAA浓度超过1mg/L时对白刺增殖培养有抑
制作用。NAA浓度在0.25~1.00mg/L时,愈伤组织的生物量随其浓度的增加而增加,且极显著(犘<0.01)提
高白刺芽的增殖系数和生物量,说明适当浓度的萘乙酸对白刺愈伤组织的形成有促进作用,白刺的最适增殖、壮
芽培养基是:MS+6BA2mg/L+NAA1.00mg/L。
3.3 不同浓度的KT对白刺生根率和生根系数的影响与IBA密切相关
当KT为1mg/L、IBA0.5mg/L时生根率和生根系数均较大,有利于提高白刺移栽成活率,因此白刺最适
生根培养基是:1/2MS+KT1mg/L+IBA0.5mg/L。通过激素筛选结果表明,白刺离体培养芽增殖系数可高
达2.27,芽平均生物量可达0.58g,试管苗生长健壮,生根率高达54%,能较好地满足白刺离体培养的需要。但
由于白刺是典型的沙旱生植物,生态环境对其生长也起着至关重要的作用,因此,白刺组培苗的炼苗和田间模拟
试验将是今后进一步研究的重点。
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犚犲狊犲犪狉犮犺狅狀狋犻狊狊狌犲犮狌犾狋狌狉犲犪狀犱犿犲犱犻狌犿狅犳犖犻狋狉犪狉犻犪狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿
GUOYehong,LINHaiming,WURui
(Agriculturecolege,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Youngstemsegmentsandleavesof犖犻狋狉犪狉犻犪狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿 wereselectedtoinvestigatesuitablemedia
andplantregenerationtechniquesforexplants.Immaturestemswereagoodsourceforexplantsoftufted
shoots,andcultivationat20℃canreducecontaminationratesoftuftedshoots.Leavesweregoodexplantsof
calusinductionaswelandalowerconcentrationof2,4Dwasbetterforcalusthanahigherconcentration.
Theoptimummultiplicationmediumfor犖.狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿wasMS+6BA2mg/L+NAA1.00mg/Landtufted
shootsformedfromaxilbudswerethemainmultiplicationmethod.Theoptimummediumforrootformation
was1/2MS+KT1mg/L+IBA0.5mg/LandtheoptimummediumforcalusinductionwasMS+2.4D0.5-
1.0mg/L.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犖犻狋狉犪狉犻犪狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿;tissueculture;medium;calus
46 ACTAPRATACULTURAESINICA(2009) Vol.18,No.6