全 文 ：书腐殖质在犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊犆犢０１介导的
２，４二氯苯氧乙酸还原脱氯过程中的作用
王弋博１，２，武春媛２，周顺桂２
（１．天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃 天水７４１０００；２．广东省生态环境与土壤研究所，广东 广州５１０６５０）
摘要：从广东四会原始森林土壤中分离到一株能高效还原Ｆｅ（ＩＩＩ）和腐殖质（ＨＳ）的兼性厌氧菌，编号为ＣＹ０１，该菌
株被鉴定为犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊（韩国丛毛单胞菌）。以犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊ＣＹ０１为研究对象，研究了厌氧条件
下 ＨＳ（腐殖质）的模式物ＡＱＤＳ对微生物介导的２，４Ｄ（２，４二氯苯氧乙酸）还原脱氯过程的影响。研究结果显
示，１）ＣＹ０１具有使２，４Ｄ进行脱氯降解的能力，ＣＹ０１引起的２，４Ｄ的脱氯降解过程是伴随着电子供体葡萄糖的
氧化同时进行的；２）反应体系中加入ＡＱＤＳ，会促进２，４Ｄ的降解过程，ＡＱＤＳ在Ｆｅ（ＩＩＩ）／ＨＳ还原菌和２，４Ｄ之间
充当电子穿梭体。综合以上实验结果表明，ＣＹ０１菌株引起的２，４Ｄ的还原脱氯过程的完成是随着电子供体的氧
化产生电子，然后ＡＱＤＳ将产生的电子加速传递至２，４Ｄ，使２，４Ｄ发生还原脱氯降解。
关键词：２，４二氯苯氧乙酸；犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊；还原脱氯
中图分类号：Ｑ９４６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０１０２４８０５
２，４Ｄ（２，４二氯苯氧乙酸，２，４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）具有很强的生物活性，经常作为农田除草剂来控
制禾谷类作物、草坪、牧场、草原中的蒲公英（犜犪狉犪狓犪犮狌犿犿狅狀犵狅犾犻犮狌犿）等阔叶杂草的生长［１，２］。但其在使用过程
中的残留物将会给土壤生态系统产生严重危害，因而研究２，４Ｄ在土壤中的微生物降解机制对于污染土壤和地
下水的原位修复具有十分重要的意义。以往对２，４Ｄ的研究主要集中在有氧条件下２，４Ｄ的微生物降解作
用［３］，对厌氧条件下２，４Ｄ的分解作用研究很少。其中厌氧条件下氯代有机物最重要的分解过程是还原脱氯作
用［３，４］。
研究表明，ＨＳ（腐殖质）和ＡＱＤＳ（醌类化合物）可以作为氧化还原介体强化化学还原剂对环境中氯代有机物
的降解过程。ＨＳ在含有大量还原剂的厌氧环境中也可以作为电子穿梭体增强氯代有机物的还原降解效率［５］，
Ｌｏｖｌｅｙ等［６］发现在铁还原条件下，ＨＳ也可以促进微生物介导的氯代有机物的脱氯过程。虽然已有大量的化学
实验证实 ＨＳ可以促进氯代有机物的还原脱氯反应，但有关 ＨＳ参与了微生物介导的脱氯反应尚研究较少［７］。
在厌氧条件下，ＨＳ对还原性污染物的降解起着非常重要的作用［８］，研究表明，丛毛单胞菌属的菌株具有使２，４Ｄ
降解的能力，但迄今为止，还未见有报道是否 ＨＳ参与了丛毛单胞菌引起的２，４Ｄ还原脱氯过程，因此，研究 ＨＳ
在丛毛单胞菌介导的２，４Ｄ还原脱氯过程中的作用就显得十分重要。本研究以犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊ＣＹ０１为
研究对象，探讨了在 ＨＳ存在的情况下犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊ＣＹ０１介导的２，４Ｄ的还原脱氯过程，以期为本领
域的研究提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 菌种的分离和培养
２００７年６月从广东四会原始森林采集土壤分离菌株。实验使用严格的厌氧技术［８］，气体采用还原铜网除
氧。菌种转接、取样采用无氧针管或在无氧气体保护下进行。分离菌种时往培养液中鼓充高纯混合气体（Ｎ２／
ＣＯ２＝８０／２０）≥１ｈ，培养液中加入５ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖（电子供体）和１ｍｍｏｌ／ＬＡＱＤＳ（电子受体），ｐＨ６．５～７．０，
铝盖密封，培养液置于厌氧工作站（ＭａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄＩｎＵＳＡＢｙＳｈｅｌｄｏｎＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ３００Ｎ，２６ＴｈＣｏｒｎｅｌ
ｉｕｓ，ｏｒ９７１１３），３０℃静置培养。在４５０ｎｍ处测其光密度值计算还原态ＡＱＤＳ（ＡＨ２ＱＤＳ）产率［９］的同时观察培
２４８－２５２
２０１１年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２０卷 第１期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
收稿日期：２０１００２０４；改回日期：２０１００４２６
基金项目：国家自然基金项目（３１０６００６５），甘肃省自然基金项目（３ｚｓ０５１Ａ２５０２６）和天水师范学院‘青蓝’人才工程基金资助。
作者简介：王弋博（１９７３），女，甘肃天水人，教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｙｂ０２＠１２６．ｃｏｍ
养液颜色变化情况，随着ＡＨ２ＱＤＳ产量的增加，培养液从无色变为橙黄色，颜色逐渐加深。当培养液颜色稳定不
再变化时，以１０％的接种量富集培养，然后在严格厌氧条件下进行分离、纯化，得到纯培养物。当完成几次富集
培养后，ＡＨ２ＱＤＳ的浓度＞０．３ｍｍｏｌ／Ｌ，在本实验分离的所有菌株中ＣＹ０１表现出了最强的ＡＱＤＳ还原活性。
１．２ Ｆｅ（ＩＩＩ）／ＨＳ还原菌的培养
１．２．１ 好氧培养 ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）液体培养基，于３０℃，１８０ｒ／ｍｉｎ条件下培养。
１．２．２ 厌氧培养 采用标准厌氧操作进行，气体采用还原铜网除氧。菌种转接、采样均在无氧气体保护下进
行［８］；湿热灭菌后，加入５ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖和１ｍｍｏｌ／ＬＡＱＤＳ分别作为反应体系的电子供体和电子受体。然后
鼓充高纯混合气体（Ｎ２／ＣＯ２＝８０／２０）≥１ｈ。
１．３ 休止细胞的制备
Ｆｅ（ＩＩＩ）／ＨＳ还原菌在ＬＢ培养基中培养过夜至对数生长期，收集菌体，在４℃下８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，洗
涤２次，然后重悬浮于超纯水中，摇匀，制成休止细胞，计菌数浓度，放于４℃冰箱中备用。
１．４ 序批式血清瓶恒温培养实验
小型血清瓶（２５ｍＬ）中加入含有２，４Ｄ的反应体系，２０ｍＬ反应体系包括：２０ｍｍｏｌ／Ｌ２，４Ｄ，５ｍｍｏｌ／Ｌ葡
萄糖，３ｍｍｏｌ／ＬＡＱＤＳ和１ｍＬ休止细胞，反应初始ｐＨ为６．５，整个操作在厌氧工作站（ＭａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄＩｎＵＳＡ
ＢｙＳｈｅｌｄｏｎＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ３００Ｎ，２６ＴｈＣｏｒｎｅｌｉｕｓ，ｏｒ９７１１）中进行，反应体系中不加电子供体葡萄糖作为对
照组［１０］。所有的实验每次测定５个样本，独立重复３次，反应进行２５ｄ，每隔５ｄ随机取样１次，样品离心１５ｍｉｎ
后取上清液用０．２２μｍ滤膜过滤，４℃贮存，立刻用于指标测定，结果采用狋检验，犘＜０．０５差异显著，犘＜０．０１差
异极显著。
１．５ 指标测定
Ｃｌ－浓度的测定：用离子色谱系统测定（ＤｉｏｎｅｘＩＣＳ９０），所用离子柱为ＩｏｎＰａｃＡＳ１４Ａ４×２５０ｍｍ，流动相为
Ｎａ２ＣＯ３（８．０ｍｍｏｌ／Ｌ）／ＮａＨＣＯ３（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ），流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ，进样体积为１ｍＬ。
葡萄糖用分光光度法测定，测定方法参照 Ｍｉｌｅｒ［１１］。
２，４Ｄ浓度用高效液相色谱法测定（ＨＰＬＣ）（ｗａｔｅｒｓ１５２７／２４８７，美国制造），色谱测定条件为：色谱柱，Ｃ１８柱
（４．６×２５０ｍｍ）；进样体积１ｍＬ；流动相流速１ｍＬ／ｍｉｎ；紫外线（ＵＶ）测定波长为２８５ｎｍ；流动相为甲醇∶水∶
乙酸＝６０∶３８∶２。
２ 结果与分析
２．１ Ｆｅ（ＩＩＩ）／ＨＳ还原菌的分离和鉴定
犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊ＣＹ０１是从广东省四会原始森林土壤中分离到的一株具有较强 ＨＳ和Ｆｅ（ＩＩＩ）还原活
性的菌株，在严格厌氧条件下，使用甲酸盐、乙酸、丙酸盐、乳酸、柠檬酸、甘油、葡萄糖和蔗糖作电子供体，柠檬酸
铁、纤铁矿、赤铁矿、水铁矿以及针铁矿作电子受体验证ＣＹ０１对Ｆｅ（ＩＩＩ）的还原能力，ＣＹ０１在所有已分离的菌株
中表现出了最强的Ｆｅ（ＩＩＩ）和 ＡＱＤＳ还原活性。该菌株通过形态学鉴定、生理生化指标测定、１６ＳｒＤＮＡ分析、
ＤＮＡＧ＋Ｃ含量测定后鉴定为犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊［１２］。该菌最适生长温度和ｐＨ分别为３０～３２℃，６．５～７．０，
鉴于此，以下所有的实验均在３０℃和ｐＨ６．５条件下进行。在厌氧条件下，以甘油、葡萄糖、柠檬酸以及蔗糖为电
子供体，ＣＹ０１菌株不但可以还原Ｆｅ（ＩＩＩ）和ＡＱＤＳ，而且还可以２，４Ｄ作为末端电子受体进行脱氯呼吸。
２．２ ＡＱＤＳ对犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊ＣＹ０１在厌氧条件下降解２，４Ｄ的影响
通过同时测定反应体系中Ｃｌ－的产生以及２，４Ｄ和葡萄糖的消耗来检测犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊ＣＹ０１对２，
４Ｄ的脱氯活性，反应体系中不加葡萄糖的样品作为对照。与对照相比，在严格厌氧条件下，在２５ｄ的孵育期，
对照中２，４Ｄ、葡萄糖以及Ｃｌ－的浓度几乎都没有变化，但加入ＣＹ０１菌株的反应体系中，２，４Ｄ和葡萄糖的浓度
均有所降低，而Ｃｌ－的浓度有升高趋势（经统计学处理，犘＜０．０５，均有显著差异），这说明：１）ＣＹ０１菌株可以直接
对２，４Ｄ进行还原脱氯，但其还原脱氯活性不强；２）ＣＹ０１菌株对２，４Ｄ的降解作用必须要在电子供体葡萄糖存
在的条件下才能发生。Ｌｅａｈｙ和Ｃｏｌｗｅｌ［１３］研究发现，在厌氧条件下，兼性厌氧菌可以使有些氯代有机物脱氯降
解，本实验结果进一步证实了兼性厌氧菌的这种脱氯能力。
９４２第２０卷第１期 草业学报２０１１年
丛毛单胞菌和２，４Ｄ的微生物降解相关，但其具
图１ 犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊犆犢０１存在时犃犙犇犛对２，４犇降解
过程中犆犾－（犪）产生以及２，４犇（犫）和葡萄糖（犮）降解的影响
犉犻犵．１ 犈犳犳犲犮狋狅犳犃犙犇犛狅狀狋犺犲狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀狅犳犆犾－（犪）犪狀犱狋犺犲
犫犻狅犱犲犵狉犪犱犪狋犻狅狀狅犳２，４犱犻犮犺犾狅狉狅狆犺犲狀狅狓狔犪犮犲狋犻犮犪犮犻犱（犫）犪狀犱
犵犾狌犮狅狊犲（犮）犻狀狋犺犲狆狉犲狊犲狀犮犲狅犳犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊犆犢０１
体的降解机制还不明了［１４］。ＨＳ可以通过在氯代有
机物和微生物细胞间充当电子穿梭体来促进氯代有
机物的还原脱氯作用，那ＨＳ是否也参与了厌氧条件
下ＣＹ０１对２，４Ｄ的降解作用？为了验证这种设想，
３ｍｍｏｌ／ＬＡＱＤＳ被加到含有葡萄糖和２，４Ｄ的细
胞反应体系中，厌氧条件下，伴随着葡萄糖的氧化，
ＡＱＤＳ促进了２，４Ｄ 的还原，随之产生了大量的
Ｃｌ－，使Ｃｌ－浓度达到３ｍｍｏｌ／Ｌ（图１）。葡萄糖的氧
化和２，４Ｄ的还原之间存在着正相关关系。这说明
１）ＣＹ０１ 对 ２，４Ｄ 的高效脱氯还原作用依赖于
ＡＱＤＳ的存在，ＡＱＤＳ在反应过程中被还原；２）伴随
２，４Ｄ的还原脱氯过程，葡萄糖被氧化，ＡＱＤＳ介导
了这一过程。
３ 讨论
在厌氧环境中，Ｆｅ（ＩＩＩ）／ＨＳ还原菌影响并支配
着还原性有机污染物的行为与归趋［１５］，如果土壤或
者沉积物中具有丰富的 ＨＳ和种类足够多的能进行
ＨＳ呼吸的微生物，ＨＳ就可以作为氧化还原介体强
化化学还原剂对环境污染物的降解能力［１６］。但自然
界有机氯结构的特异性与多样性决定了细菌脱氯谱
的特异性，不同种属的细菌，甚至相同种属的不同菌
株的脱氯谱不尽相同［１７］，因此对能降解厌氧环境中
有机污染物微生物多样性的研究以及不同 ＨＳ还原
微生物对有机污染物的降解作用机理的研究是非常
有意义的［１８］。利用中间介体是一种有效的加速环境
污染物降解的土壤修复策略［１９］。
实验结果显示，ＣＹ０１菌株不但可以还原Ｆｅ（ＩＩＩ）
和ＨＳ，而且还能使２，４Ｄ脱氯降解，ＡＱＤＳ的参与
可以加速这个反应过程，这说明 ＡＱＤＳ这个特殊的
醌类化合物可以在２，４Ｄ与ＣＹ０１菌株间充当电子
穿梭体，ＡＱＤＳ中的醌基首先从Ｆｅ（ＩＩＩ）／ＨＳ还原菌
得到电子，被还原成氢醌基，氢醌再将电子传递给２，
４Ｄ，氢醌本身被化学氧化为醌基，从而进入下一轮循环［７］。ＡＱＤＳ的还原作用可以很好地证明 ＨＳ的还原作
用［１６］，ＨＳ可以在微生物的还原脱氯反应中很好地充当氧化还原介体，这是因为还原态的 ＨＳ会接受微生物传递
来的电子，然后再直接将电子传给氯代有机物，在电子传递过程中，ＨＳ被氧化，作为新的电子受体再次接受来自
微生物的电子，成为微生物和有机氯污染物间的电子穿梭体［２０２２］。
因而，微生物还原条件下 ＨＳ介导的２，４Ｄ还原脱氯的可能机制为：腐殖质（ＡＱＤＳ）被ＣＹ０１还原为其相应
的还原态腐殖质（ＡＨ２ＱＤＳ），还原态 ＨＳ可以直接将电子传递给２，４Ｄ，由于在这个化学反应过程中还原态 ＨＳ
重新被氧化，因此ＨＳ可以再次作为电子受体接受来自ＣＹ０１传递的电子。在整个反应过程中，腐殖质作为电子
穿梭体而存在。
０５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１
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［２１］ ＬｏｖｌｅｙＤＲ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｒｏｎｍａｎｇａｎｅｓｅａｎｄｏｔｈｅｒｍｅｔａｌｓ［Ｊ］．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｇｒｏｎｏｍｙ，１９９５，５４：１７５２３１．
［２２］ ＬｏｖｌｅｙＤＲ，ＣｏａｔｅｓＩＤ，ＳａｆｆａｒｉｎｉＤＡ，犲狋犪犾．Ｄｉｓｓｉｍｉｌａｔｏｒｙｉｒｏｎｒｅｄｕｃｔｉｏｎ［Ａ］．Ｉｎ：Ｗｉｎｋｅｌｍａｎ，ＣａｒｒａｎｏＣ．ＩｒｏｎａｎｄＲｅｌａｔｅｄ
ＴｒａｎｓｉｔｉｏｎＭｅｔａｌｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｍ］．Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：ＨａｒｗｏｏｄＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９７：１８７２１５．
１５２第２０卷第１期 草业学报２０１１年
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ＷＡＮＧＹｉｂｏ１，２，ＷＵＣｈｕｎｙｕａｎ２，ＺＨＯＵＳｈｕｎｇｕｉ２
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＴｉａｎｓｈｕｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｓｈｕｉ７４１００１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｃｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄＳｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６５０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅａｎａｅｒｏｂｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍｗｈｉｃｈｗａｓａｈｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔｈｕｍｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｓａｎｄＦｅ（ＩＩＩ）ｒｅｄｕｃｉｎｇ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄＣＹ０１），ｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｎａｎｃｉｅｎｔｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌｆｒｏｍＧｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａａｎｄｗａｓｉｄｅｎｔｉ
ｆｉｅｄａｓａｓｔｒａｉｎｏｆ犆狅犿犪犿狅狀犪狊犽狅狉犲犲狀狊犻狊．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｔｈｅｈｕｍｉｃｍｏｄｅｌｃｏｍｐｏｕｎｄ，ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ２，６ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ
（ＡＱＤＳ），ｉｎｔｈｅａｎａｅｒｏｂｉｃｒｅｄｕｃｔｉｖｅｄｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎｏｆ２，４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（２，４Ｄ）ｂｙ犆．犽狅狉犲犲狀狊犻狊
ＣＹ０１ｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．１）ＳｔｒａｉｎＣＹ０１ｃｏｕｌｄｃｏｕｐｌｅｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｔｏ２，４Ｄｒｅｄｕｃｔｉｖｅｄｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎ；２）
Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅｄｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎｏｆ２，４ＤｂｙｓｔｒａｉｎＣＹ０１ｗａｓｇｒｅａｔｌｙｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＡＱＤＳｗｈｉｃｈａｃｔｓａｓ
ａｎｅｌｅｃｔｒｏｎｓｈｕｔｔｌｅ．２，４Ｄｒｅｄｕｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｅｄｅｄｂｙｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｅｌｅｃｔｒｏｎｄｏｎｏｒｓａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒｅｎｃｅｏｆｅｌｅｃｔｒｏｎｓｔｏ
ｔｈｅａｃｃｅｐｔｏｒｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｒｅｄｏｘｍｅｄｉａｔｏｒ，ＡＱＤＳ．
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２５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１