全 文 ：书珠芽蓼内生菌犣５产犐犃犃和抑菌
能力测定及其鉴定
李振东１，陈秀蓉１，李鹏１，满百膺２
（１．甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，
甘肃 兰州７３００７０；２．广州大学松田学院，广东 广州５１１３７０）
摘要：以珠芽蓼内生细菌Ｚ５为研究对象，采用Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ比色法和平板对峙法测定其分泌植物生长素（ＩＡＡ）的能
力和对病原真菌的抑菌能力；并利用１６ＳｒＤＮＡ序列分析结合生理生化特征对Ｚ５进行了鉴定。结果表明，Ｚ５在含
有色氨酸和不含色氨酸的Ｋｉｎｇ培养基中分泌ＩＡＡ分别为６８．６２和５．１４ｍｇ／Ｌ；Ｚ５对番茄灰霉病菌、小麦离蠕孢
菌、玉米大斑病菌、油菜菌核病菌、番茄早疫病菌、辣椒立枯丝核病菌、甜瓜枯萎病菌７种病原真菌有抑制作用，说
明Ｚ５具有较广的抑菌谱。Ｚ５菌体杆状，大小为１．６５～３．３４μｍ×０．４６～０．７１μｍ，Ｇ
＋，中生芽孢，生理生化特性和
１６ＳｒＤＮＡ基因序列测试结果均表明，Ｚ５为枯草芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊）。本研究为高寒草地特有的植物内生
促生拮抗菌的开发和利用提供依据，也为开发经济环保的生物农药提供菌种资源。
关键词：内生菌；植物生长素；拮抗作用；鉴定
中图分类号：Ｑ９４９．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１０）０２００６１０８
农药的广泛使用，在产生巨大经济效益和社会效益的同时，其大量生产、运输和使用也对农产品和环境造成
了污染，农产品农药残留，给人民生命健康造成了危害。另外，农药使用过程中病原生物不断出现的适应性和抗
药性［１］，迫使农药使用量的加大或农药的毒性增大，进一步加深了农药造成的危害。生物防治可以减少农药的使
用，进而避免农药残留对农作物造成的污染。植物内生细菌作为一种生防资源，已成为近年来生防菌剂研制开发
的热点。
植物内生菌是指真菌、细菌或放线菌，其生活史的一定阶段或全部阶段是生活于植物各组织器官内部或细
胞间隙，但又不引起任何病症的微生物，突出强调了内生菌与植物的互惠共生关系［２］。文献报道水稻（犗狉狔狕犪狊犪
狋犻狏犪）［３］、马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）［４］、番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）［５］、棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌狌犿）［６］、辣
椒（犆犪狆狊犻犮狌犿犪狀狀狌狌犿）［７］等作物和石斛（犇犲狀犱狉狅犫犻狌犿）［８］、蓝麻黄（犈狆犺犲犱狉犪犵犾犪狌犮犪）［９］、甘草（犌犾狔犮狔狉狉犺犻狕犪犵犾犪
犫狉犪）［１０］、蛇足石杉（犎狌狆犲狉狕犻犪狊犲狉狉犪狋犪）［１１］等药用植物以及红树（犚犺犻狕狅狆犺狅狉犪犪狆犻犮狌犾犪狋犪）［１２］、樟树（犆犻狀狀犪犿狅犿狌犿
犮犪犿狆犺狅狉犪）［１３］、苦豆子（犛狅狆犺狅狉犪犪犾狅狆犲犮狌狉狅犻犱犲狊）［１４］、大花金挖耳（犆犪狉狆犲狊犻狌犿犿犪犮狉狅犮犲狆犺犪犾狌犿）［１５］等植物体内已分
离筛选到对多种植物病原真菌和细菌性植物病害具有良好抑制或防治效果的内生细菌。Ｃｈｅｎ等［１６］从棉花中分
离到的２５株内生细菌能诱导黄瓜（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）对炭疽病产生抗性，李进荣等［１７］从大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）根瘤
中分离并筛选出４株对大豆胞囊线虫胞囊孵化有强烈抑制性的菌株。除了可以有效防止病虫害的发生，部分植
物内生菌还兼有产生植物激素，促进植物生长的作用，Ｓｕｒｅｔｔｅ和Ｓｔｕｒｚ［１８］研究发现，胡萝卜（犇犪狌犮狌狊犮犪狉狅狋犪）内生
细菌中对胡萝卜有促生作用的占８３％，用胡萝卜内生细菌处理马铃薯，有３３％可以促进马铃薯的生长。内生细
菌可以产生植物激素直接促进植物生长，或者通过诱导植物产生植物激素，提高对不良环境及病虫害的抵抗
力［１９］，以促进植株生长。
目前，对于高寒草地珠芽蓼内生细菌抗病促生的研究鲜见报道。珠芽蓼（犘狅犾狔犵狅狀狌犿狏犻狏犻狆犪狉狌犿）为多年生
草本植物，分布在海拔２０００～３９００ｍ的草甸和高原草甸，广泛分布于全国各省区。珠芽蓼果实含有丰富的蛋
第１９卷 第２期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
６１－６８
２０１０年４月
收稿日期：２００９１０２６；改回日期：２００９１１２５
基金项目：国家级重点学科学术骨干科研项目暨草业生态系统教育部省部共建重点实验室资助（ＣＹＧＧ２００６０１）和国家自然基金项目
（３０４７１２３２）资助。
作者简介：李振东（１９７８），男，甘肃临夏人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｚｈｅｎｄｏｎｇ７８＠ｔｏｍ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｘｉｕｒｏｎｇ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
白质和总糖，氨基酸种类齐全，并含有多种对人体有益的矿物质元素［２０］。不仅可作为优良的饲料，而且具有较高
的食用价值；也可提栲胶；全草捣烂制成粉剂或溶液能防治农作物害虫［２１］。珠芽蓼属传统藏药，又名“高原拳
参”，有退烧、止泻、调经、收敛止血的功效［２２］。近年来研究发现珠芽蓼根茎具有明显的抗超氧自由基作用［２３］、清
除羟自由基作用［２４］和抗肿瘤作用［２１］。本试验以东祁连山高寒草地珠芽蓼内生细菌Ｚ５为研究对象，对其分泌
ＩＡＡ和抑制植物病原真菌能力进行了测定，并利用１６ＳｒＤＮＡ序列分析结合生理生化特征对Ｚ５进行了鉴定，以
期为高寒草地所特有的植物内生促生拮抗菌的开发和利用提供依据，也为开发经济环保的生物农药提供菌种资源。
１ 材料与方法
１．１ 材料
供试菌株Ｚ５由草地微生物多样性实验室提供，是该实验室用参考文献［２５］中的方法从２００７年７月在甘肃
省天祝县金强河地区甘肃农业大学高寒草原试验站前采集的优势植物珠芽蓼内分离获得的内生细菌。枯草芽孢
杆菌标准菌株（犅犪犮犻犾犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。８种病原真菌：①辣椒立枯丝核病菌
（犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻）、②油菜菌核病菌（犛犮犾犲狉狅狋犻狀犻犪狊犮犾犲狉狅狋犻狅狉狌犿）、③番茄早疫病菌（犃犾狋犲狉狀犪狉犻犪狊狅犾犪狀犻）、④番茄
灰霉病菌（犅狅狋狉狔狋犻狊犮犻狀犲狉犲犪）、⑤玉米大斑病菌（犈狓狊犲狉狅犺犻犾狌犿狋狌狉犮犻犮狌犿）、⑥小麦离蠕孢（犅犻狆狅犾犪狉犻狊狊狅狉狅犽犻狀犻犪狀犪）、
⑦甜瓜枯萎病菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｓｐ．犿犲犾狅狀犻狊）、⑧玉米小斑病菌（犅犻狆狅犾犪狉犻犪犿犪狔犱犻狊），均为甘肃农业大学
植物病理实验室保存菌种。
１．２ 试剂和培养基
ＴａｑＤＮＡ聚合酶、蛋白酶Ｋ、溶菌酶、ｄＮＴＰ和氯仿、苯酚购自上海生工生物技术公司，ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ购自
宝生物（ＴａＫａＲａ）工程有限公司。其他化学试剂均为国产分析纯。用于ＤＮＡ提取的试剂制备参考《精编分子生
物学实验指南》等［２６］。
培养基［２７］：肉汁胨培养基（ＮＡ）用于Ｚ５的活化和保存，金氏培养基Ｂ（Ｋｉｎｇ）用于Ｚ５产ＩＡＡ的测定，马铃薯
葡萄糖培养基（ＰＤＡ）用于植物病原真菌的培养和对峙试验。
１．３ 主要仪器
水平凝胶电泳装置；凝胶成像系统ＵｖｉｔｅｃＡ６０３０；台式高速冷冻离心机；ＭｙＧｅｎｉｅ３２ＴｈｅｒｍａｌＢｌｏｃｋＰＣＲ热
循环仪；各种剂量移液枪（均为Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司）；电热恒温水浴锅（江苏常熟医疗器械厂）；Ｓ２０００型分光光度计、
ＡＬ１０４型电子天平、ＩＯＣ４０２．ＸＸＩ．Ｃ型控温振荡器、ＭＪＸ智能霉菌培养箱、ＨＨ１．５Ｐｌｕｓ型超净工作台。
１．４ 方法
１．４．１ 分泌植物生长素（ＩＡＡ）能力的定性测定 ＰＣ比色液的配制，称取ＦｅＣｌ３１２ｇ溶于３００ｍＬ蒸馏水，然后
缓慢加入４２９．７ｍＬ９８％ Ｈ２ＳＯ４，待冷却后定容至１Ｌ，测定范围０．３～２０ｍｇ／Ｌ；Ｓ２比色液的配制，将４．５ｇ
ＦｅＣｌ３ 溶于３００ｍＬ蒸馏水，然后缓慢加入５８７．４ｍＬ９８％ Ｈ２ＳＯ４，待冷却后定容至１Ｌ，测定ＩＡＡ范围５～２００
ｍｇ／Ｌ。
采用Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ比色法［２８］测定Ｚ５分泌ＩＡＡ的能力。将Ｚ５接种在ＮＡ液体培养基中培养１２ｈ（２８℃、１２０
ｒ／ｍｉｎ）后，用无菌水调节ＯＤ６００值为０．０５，取１００μＬＺ５菌悬浮液分别接到不含色氨酸的Ｋｉｎｇ培养液和含有１００
ｍｇ／Ｌ色氨酸的Ｋｉｎｇ培养液中，每三角瓶盛有５０ｍＬ的培养液，重复３次，以加１００μＬ无菌水的培养液为空白
对照，一起置于２８℃、转速为１２０ｒ／ｍｉｎ的控温振荡器中培养１２ｄ。分别取Ｚ５菌悬浮液和空白对照５０μＬ各加
入５０μＬ比色液，置室温下静置，１５ｍｉｎ内观察其颜色变化，３个重复均变红为阳性，表示能分泌ＩＡＡ，颜色越深
表示分泌数量多；３个重复均不变色为阴性，表示不分泌ＩＡＡ。
１．４．２ 分泌ＩＡＡ能力的定量测定 标准曲线采用纯３ＩＡＡ制作。配制２组３ＩＡＡ溶液，浓度依次为２．５，５．０，
７．５，１０．０，１２．５，１５．０，１７．５ｍｇ／Ｌ和２５，５０，７５，１００，１２５，１５０，１７５ｍｇ／Ｌ，分别取上述３ＩＡＡ溶液４ｍＬ，在第１组
中加入ＰＣ比色液４ｍＬ，第２组中加入Ｓ２比色液４ｍＬ，在黑暗中静置０．５ｈ，取出立即用分光光度计测定ＯＤ５３０
值，以加了比色液的蒸馏水调０，重复３次，获得数据制作标准曲线。
Ｚ５的培养方法同１．４．１，将经Ｋｉｎｇ培养液培养１２ｄ的Ｚ５菌悬浮液和空白对照１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ
取上清液４ｍＬ加等量比色液，在黑暗中静置０．５ｈ，取出立即用分光光度计测定ＯＤ５３０值，每个样品重复测３次，
２６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
以加了比色液的空白对照调０。用相应的标准曲线计算出该株菌分泌ＩＡＡ的量，并根据ＰＣ比色液和Ｓ２比色液
的测定范围对结果进行选择，最终确定其分泌的数量。
１．４．３ 对病原菌拮抗谱的测定 采用平板对峙培养法［２９］测定抑菌效果。菌株Ｚ５于ＮＡ培养基上活化培养２４
ｈ，病原真菌置ＰＤＡ培养基上扩大培养后打成直径为７ｍｍ的菌饼，接种在制作好的ＰＤＡ培养基中央，再将Ｚ５
点接在距菌饼２．５ｃｍ处，每平板接４点，３个重复，以在距菌饼２．５ｃｍ处点接无菌水为对照，置２５℃恒温培养箱
中培养，待对照中病原菌长满培养皿后测量抑菌带宽度（即Ｚ５菌落边缘到相对病原菌菌落边缘的距离）。
１．４．４ 菌株Ｚ５的鉴定 形态特征的观察及生理生化测定：参照相关文献［３０，３１］进行菌体形态观察和生理生化试
验。用枯草芽孢杆菌作为对照标准菌株。
１６ＳｒＤＮＡ序列分析：细菌基因组ＤＮＡ的提取参考奥斯伯等［２６］的方法，略加改进。增加了２步操作：第１，
用溶菌酶裂解细菌。在用蛋白酶Ｋ之前先加５μＬ的溶菌酶（５０ｍｇ／ｍＬ），３７℃水浴１ｈ；第２，用等体积氯仿／异
戊醇（２４∶１）除去苯酚。将酚／氯仿／异戊醇（２５∶２４∶１）处理后的上清液移于另一离心管中，加等体积氯仿／异戊
醇（２４∶１）充分混匀，离心，将上清液转移到一１．５ｍＬ新离心管中进行后续操作。
根据细菌１６ＳｒＤＮＡ两端的保守序列，设计１对细菌的通用引物，用于ＰＣＲ扩增，引物序列，引物１：５′ＣＣＧ
ＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡ３′，引物２：５′ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡ
ＣＧＡＣＴＴ３′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。ＰＣＲ反应体系１０×ｂｕｆｆｅｒ（含２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ２）５μＬ，ｄＮＴＰ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，引物１（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，引物２（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙ
ｍｅｒｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ，ＴｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ１μＬ，补ｄｄＨ２Ｏ至５０μＬ（加超纯水１μＬ为阴性对照）。扩增程序为：
９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延长１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃下延伸８ｍｉｎ。扩增后，取５μＬ
的扩增样品在１％的琼脂糖凝胶上８０Ｖ电压下进行电泳检测，将亮度好、纯度高的特异性条带（１５００ｂｐ左右）
的ＰＣＲ产物置于－２０℃下保存待测序。
将所测得的基因序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的相关数据进行Ｂｌａｓｔ相似性分析。然后，用ＤＮＡ分析软件ＣＬＵＳＴ
ＡＬＸ１．８进行多重序列比较，再用 Ｍｅｇａ（版本４．０）中的邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ）建立１６ＳｒＤＮＡ基因的系统发
育树，其中的遗传距离用ＴａｍｕｒａＮｅｉ公式计算，枝长代表了分歧程度，各枝上的数字是５００次自举（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）
重抽样分析的支持百分比。
２ 结果与分析
２．１ ＩＡＡ的定性测定
图１ 犣５比色反应
犉犻犵．１ 犣５犮狅犾狅狉犻犿犲狋狉犻犮狉犲犪犮狋犻狅狀
通过比色发现不含色氨酸的培养液在比色反应中
颜色变化不明显，含１００ｍｇ／Ｌ色氨酸的培养液在比
色反应中呈红色，与对照有明显的差异（图１），说明在
Ｋｉｎｇ培养基中加入１００ｍｇ／Ｌ的色氨酸能明显增加
Ｚ５合成ＩＡＡ的量。
２．２ ＩＡＡ定量测定
采用纯３ＩＡＡ制作标准曲线（图２，３）。Ｚ５经连续培养１２ｄ后，用ＰＣ和Ｓ２两种比色液在５３０ｎｍ处测定
ＯＤ值，结果，不含色氨酸的Ｋｉｎｇ培养液ＯＤ５３０值为ＰＣ＝０．２３８和Ｓ２＝０．１６２，含１００ｍｇ／Ｌ色氨酸的Ｋｉｎｇ培养
液ＯＤ５３０值为ＰＣ＝０．９８６和Ｓ２＝１．１９８，在不含色氨酸的Ｋｉｎｇ培养基中菌株Ｚ５分泌ＩＡＡ的浓度为５．１４ｍｇ／
Ｌ，在含１００ｍｇ／Ｌ色氨酸的Ｋｉｎｇ培养基中分泌ＩＡＡ的浓度为６８．６２ｍｇ／Ｌ，ＩＡＡ的合成量是前者的１３．４倍。
色氨酸的存在能明显增加Ｚ５合成ＩＡＡ的量。说明色氨酸是Ｚ５合成ＩＡＡ重要前体物质。细菌合成ＩＡＡ根据
前体中是否包括色氨酸可分为色氨酸途径和非色氨酸途径，因此，Ｚ５合成ＩＡＡ的主要途径是色氨酸途径，与李
法峰等［３２］的报道一致。
２．３ 拮抗能力测定
对峙试验结果表明，Ｚ５对所选的８种病原真菌中的番茄灰霉病菌、小麦离蠕孢菌、玉米大斑病菌、油菜菌核
病菌、番茄早疫病菌、辣椒立枯丝核病菌和甜瓜枯萎病菌７种有不同的拮抗作用（图４），其中，Ｚ５对前４种病原真
菌的生长有较强的抑制作用，抑菌带宽分别为：９，８，７和６ｍｍ。表明菌株Ｚ５对多种植物根部病原菌和叶斑病菌
３６第１９卷第２期 草业学报２０１０年
均具有良好的抑制作用，抑制的病原菌种类涉及到丝核菌属（犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪）、核盘菌属（犛犮犾犲狉狅狋犻狀犻犪）、链格孢属
（犃犾狋犲狉狀犪狉犻犪）、葡萄孢属（犅狅狋狉狔狋犻狊）、突脐蠕孢属（犈狓狊犲狉狅犺犻犾狌犿）、蠕孢属（犅犻狆狅犾犪狉犻狊）、镰刀菌属（犉狌狊犪狉犻狌犿）７个属
的植物病原真菌，说明Ｚ５具有较广的抑菌谱。
２．４ 菌株Ｚ５的鉴定
２．４．１ 形态特征和生理生化特性 内生菌Ｚ５好氧具有运动性，革兰氏阳性，中生芽孢，菌体杆状（图５，６），大小
为１．６５～３．３４μｍ×０．４６～０．７１μｍ，菌落平展，近圆形，中央隆起、有褶皱，灰白色，无光泽，不透明，边缘不整齐
（图７）。Ｚ５能在ｐＨ５～１１内生长（图８）；生理生化特性测试结果见表１，所测试项目中标准菌株的反应均与文
献报道一致。根据伯杰细菌鉴定手册第八版［３０］与东秀珠和蔡妙英［３１］《常见细菌系统鉴定手册》初步鉴定Ｚ５为
枯草芽孢杆菌。
图２ 犘犆标准曲线
犉犻犵．２ 犘犆狊狋犪狀犱犪狉犱犮狌狉狏犲
图３ 犛２标准曲线
犉犻犵．３ 犛２狊狋犪狀犱犪狉犱犮狌狉狏犲
图４ 犣５与７种病原真菌对峙照片
犉犻犵．４ 犣５犮狅狀犳狉狅狀狋狊犲狏犲狀犽犻狀犱狊狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犳狌狀犵犻狆犺狅狋狅狊
１．辣椒立枯丝核病菌犚．狊狅犾犪狀犻，２．油菜菌核病菌犛．狊犮犾犲狉狅狋犻狅狉狌犿，３．番茄早疫病菌犃．狊狅犾犪狀犻，
４．番茄灰霉病菌犅．犮犻狀犲狉犲犪，５．玉米大斑病菌犈．狋狌狉犮犻犮狌犿，６．小麦离蠕孢
犅．狊狅狉狅犽犻狀犻犪狀犪，７．甜瓜枯萎病菌犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｓｐ．犿犲犾狅狀犻狊
４６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２
图５ 犣５革兰氏染色
犉犻犵．５ 犣５犌狉犪犿
图６ 犣５芽孢染色
犉犻犵．６ 犣５犅犪犮犻犾狌狊狊狋犪犻狀
图７ 犣５的菌落
犉犻犵．７ 犣５’狊犮狅犾狅狀狔
图８ 犣５最适狆犎
犉犻犵．８ 犣５狅狆狋犻犿狌犿狆犎
２．４．２ １６ＳｒＤＮＡ序列系统发育学分析 提取的细
菌基因组ＤＮＡ经１％琼脂糖凝胶电泳检测，条带清
楚，且无非特异性条带，即该基因组ＤＮＡ浓度较高，
纯度较好，可用作ＰＣＲ扩增的模板。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，在
１５００ｂｐ左右处有一明亮的ＰＣＲ特异性条带，浓度约
为６０～１００ｎｇ／μＬ，且无其他非特异性条带（图９）。说
明ＰＣＲ扩增获得的目的ＤＮＡ片断产量!、纯度好，
可用于测序。Ｚ５的１６ＳｒＤＮＡ基因有１４６２个碱基，
其基因序列在ＧｅｎＢａｎｋ中登录号为ＥＵ２３６７３７。
经 Ｂｌａｓｔ相似 性 分 析，Ｚ５ 和 枯 草 芽 孢 杆 菌
（ＡＹ５５３０９４）相似度达９９．８６％；从系统发育树（图
１０）来看，Ｚ５与枯草芽孢杆菌（ＡＹ５５３０９４）的遗传距离
小于０．００２１。说明Ｚ５与ＡＹ５５３０９４同为枯草芽孢杆
菌。综合以上分子生物学和生理生化结果，确定Ｚ５
为枯草芽孢杆菌（犅．狊狌犫狋犻犾犻狊）。
３ 讨论
植物为内生菌提供相对稳定的生存环境，内生菌
分泌ＩＡＡ，可以促进植物的生长。细菌分泌ＩＡＡ的量
差异较大，目前报道在１．４０～６２．０３ｍｇ／Ｌ［３２，３３］，但Ｚ５
分泌ＩＡＡ的量为６８．６２ｍｇ／Ｌ，高于文献报道。植物
自身合成ＩＡＡ的能力受到抑制时，外源ＩＡＡ可以促
进植物幼苗的伸长并降低幼苗细胞膜透性［３４］，增强植
物对不良环境的适应能力；郑国华等［３５］认为短时间低
温处理下，枇杷（犈狉犻狅犫狅狋狉狔犪犼犪狆狅狀犻犮犪）幼果中ＩＡＡ含
量较快增长并出现峰值，以应对逆境提高抗寒能力，吴
俊江等［３６］报道大豆叶片内ＩＡＡ含量升高致使品种抵
御病菌能力增强，因此，根据本试验结果，推测Ｚ５分
表１ 犣５的生理生化特征
犜犪犫犾犲１ 犘犺狔狊犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾狆狉狅狆犲狉狋犻犲狊狅犳犣５
试验项目
Ｔｅｓｔｉｔｅｍ
枯草芽孢杆菌
犅．狊狌犫狋犻犾犻狊
Ｚ５
葡萄糖利用 Ｕｓｅｏｆｇｌｕｃｏｓｅ ＋ ＋
葡萄糖产气Ｇａｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｇｌｕｃｏｓｅ － －
ＶＰ试验 Ｖ．Ｐ．ｔｅｓｔ ＋ ＋
淀粉水解Ｓｔａｒｃｈｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ＋ ＋
马尿酸盐水解Ｂｅｎｚｏｙｌｇｌｙｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ － －
硝酸盐还原Ｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ＋ ＋
接触酶Ｃａｔａｌａｓｅ ＋ ＋
明胶液化Ｇｅｌａｔｉｎｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ ＋ ＋
酪蛋白水解Ｃａｓｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ＋ ＋
阿拉伯糖利用Ｕｓｅｏｆａｒａｂｉｎｏｓｅ ＋ ＋
甘露醇利用Ｕｓｅｏｆｍａｎｉｃｏｌ ＋ ＋
注：“－”表示阴性，“＋”表示阳性，“ＮＤ”表示未测。
Ｎｏｔｅ：“－”ｎｅｇａｔｉｖｅ，“＋”ｐｏｓｉｔｉｖｅ，“ＮＤ”ｎｏｔｔｅｓｔ．
泌大量ＩＡＡ与珠芽蓼对高寒环境的适应性可能有很大的相关性。
另外，Ｚ５作为一株芽孢杆菌，其抗菌物质对植物病原真菌具有抗菌谱广的特征，抑制的病原菌种类涉及到丝
核菌属、核盘菌属、链格孢属、葡萄孢属、突脐蠕孢属、蠕孢属、镰刀菌属７个属的植物病原真菌，与相关文献报道
一致［３７，３８］。目前国内报道珠芽蓼病害的发生很少，仅在新疆报道有珠芽蓼白霉病（犅狅狊狋狉犻犮犺狅狀犲犿犪犪犾狆犲狊
狋狉犲犮犲狊）［３９］发生，甘肃天祝报道有珠芽蓼黑粉病（犝狊狋犻犾犪犵狅犫犻狊狋狅狉狋犪狉狌犿）［４０］发生，未见丝核菌属、核盘菌属、链格孢
属、葡萄孢属、突脐蠕孢属、蠕孢属、镰刀菌属７个属的植物病原真菌在珠芽蓼上引起病害的报道。但笔者在
５６第１９卷第２期 草业学报２０１０年
天祝采样时少有珠芽蓼发生病害，说明珠芽蓼对以上
图９ 犣５１６犛狉犇犖犃犘犆犚电泳图
犉犻犵．９ 犣５１６犛狉犇犖犃犘犆犚犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊犿犪狆
７个属的植物病原真菌有较强的抵御病菌能力，也说
明了珠芽蓼内生菌Ｚ５对珠芽蓼抗植物病原真菌有很
大的作用。植物病原菌在自然界中是广泛存在的，包
括真菌、细菌、病毒等。真菌病害是植物病害中种类最
多的，报道的真菌近几万种，其中可以为害植物的近３
万种［２７］。侯金伟和南志标［４１］认为病原真菌是导致土
壤种子库种子死亡的重要原因之一，Ｚ５拮抗植物病原
真菌能力可以减少高寒草地土壤种子库中珠芽蓼种子
的死亡，对珠芽蓼保持其优势种的地位有积极的作用。
孔庆科和丁爱云［４２］认为植物内生细菌作为生防
因子有四大优点，即：占据有利的生态位，能经受住植
物防卫反应，与病菌直接作用及作为外源基因的载体
图１０ 犣５的１６犛狉犇犖犃系统发育树
犉犻犵．１０ １６犛狉犇犖犃狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犣５
等，同时内生细菌也受植物的保护，不易受到外界环境的影响，可较长期地发挥生物学效应，是天然的植物病害生
防资源菌。本研究也得到类似的结论，认为产ＩＡＡ的珠芽蓼内生菌Ｚ５兼具抗病和促生作用，是一株具有开发前
景的植物病害生防菌。因此，高寒草地这样特殊生境中的植物内生菌是植物病害生防资源菌的来源之一，这与赵
国玉等［４３］认为“今后在寻找真菌致病菌的拮抗菌时，其寻找范围不应仅仅局限于致病菌所寄生的植物或染病植
株的根际土壤”一致。但有关Ｚ５的促生抑菌机制及环境相容性等尚需进一步研究。
４ 结论
珠芽蓼内生细菌Ｚ５菌体杆状，大小为１．６５～３．３４μｍ×０．４６～０．７１μｍ，革兰氏阳性，中生芽孢，生理生化特
性和１６ＳｒＤＮＡ基因序列测试结果均表明，Ｚ５为枯草芽孢杆菌。Ｚ５在含１００ｍｇ／Ｌ色氨酸和不含色氨酸的
Ｋｉｎｇ培养基中分泌ＩＡＡ分别为６８．６２和５．１４ｍｇ／Ｌ；Ｚ５对番茄灰霉病菌、小麦离蠕孢菌、玉米大斑病菌、油菜菌
核病菌、番茄早疫病菌、辣椒立枯丝核病菌、甜瓜枯萎病菌７种病原真菌有抑制作用，说明Ｚ５具有较广的抑菌谱；
Ｚ５具有促生和抑制植物病原真菌生长的能力，是一株具有开发为经济环保生物农药潜力的菌种。
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犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘狅犾狔犵狅狀狌犿狏犻狏犻狆犪狉狌犿犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪犣５犪狀犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲
犮犪狆犪犮犻狋狔狋狅狊犲犮狉犲狋犲犐犃犃犪狀犱犪狀狋犪犵狅狀犻狊狋犻犮犮犪狆犪犮犻狋狔狋狅狑犪狉犱狊狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犳狌狀犵犻
ＬＩＺｈｅｎｄｏｎｇ１，ＣＨＥＮＸｉｕｒｏｎｇ１，ＬＩＰｅｎｇ１，ＭＡＮＢａｉｙｉｎｇ２
（１．ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＣｏｌｅｇｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍＭｉｎｉｓｔｒｙ
ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｉｎｏＵ．Ｓ．ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＧｒａｚｉｎｇｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍＳｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｏｎｔａｎＣｏｌｅｇｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１１３７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｓｔｕｄｙｉｓｆｏｃｕｓｅｄｏｎ犘狅犾狔犵狅狀狌犿狏犻狏犻狆犪狉狌犿ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａＺ５．Ｓａｌｋｏｗｓｋｉｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｆｒｏｎｔｉｎｇｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｎＰＤＡｐｌａｔｅｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｈａｖｅｂｅｅｎｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃａｐａｃｉｔｙｏｆＺ５
ｔｏｓｅｃｒｅｔｅＩＡＡａｎｄＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉｏｆＺ５．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ
ｔｉｃｓａｎｄ１６ＳｒＤＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｈａｖｅａｌｓｏｂｅｅｎｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＺ５．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＩＡＡｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙＺ５ｉｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１００ｍｇ／ＬｔｒｙｐｔｏｐｈａｎＫｉｎｇｉｓ６８．６２ｍｇ／Ｌ，ａｎｄｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｎｅｗｉｔｈｏｕｔｔｒｙｐｔｏｐｈａｎＫｉｎｇｉｓ５．１４ｍｇ／Ｌ．Ｚ５ｃａｎｉｎｈｉｂｉｔＰａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ，ｓｕｃｈａｓ犚犺犻
狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻，犛犮犾犲狉狅狋犻狀犻犪狊犮犾犲狉狅狋犻狅狉狌犿 （ｒａｐｅｓｔｒａｉｎ），犃犾狋犲狉狀犪狉犻犪狊狅犾犪狀犻，犅狅狋狉狔狋犻狊犮犻狀犲狉犲犪，犈狓狊犲狉狅犺犻犾狌犿狋狌狉犮犻
犮狌犿，犅犻狆狅犾犪狉犻狊狊狅狉狅犽犻狀犻犪狀犪，犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｉｓ，ｓｈｏｗｉｎｇｔｈａｔＺ５ｈａｓａｗｉｄｅｒＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｚ５ｉｓＲｏｄｓｈａｐｅｄｗｉｔｈａｓｉｚｅｏｆ１．６５－３．３４μｍ×０．４６－０．７１μｍ，Ｇｒａｍｐｏｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄｃａｎｐｒｏｄｕｃｅ
ｓｐｏｒｅｉｎｔｈｅｃｅｎｔｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄ１６ＳｒＤＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗ
ｔｈａｔＺ５ｉｓ犅犪犮犻犾犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊．Ｔｈｅｓｔｕｄｙｗｉｌｐｒｏｖｉｄｅｅｖｉｄｅｎｃｅｓｆｏｒｔｈｅｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｍｏｔｉｎｇ
ｇｒｏｗｔｈａｎｄＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗａｎｄｉｔｗｉｌａｌｓｏｐｒｏｖｉｄｅｓｔｒａｉｎｒｅｓｏｕｒｃｅｆｏｒｍａｋ
ｉｎｇｅｃｏｎｏｍｉｃａｌａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｒｉｅｎｄｌｙＢｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ；ＩＡＡ；ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
８６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２