全 文 ：书文心兰组织培养及转基因研究进展
崔广荣
（安徽科技学院植物科学学院，安徽 凤阳２３３１００）
摘要：综述了文心兰组织培养及转基因研究的主要进展。外植体、培养基及其添加物、植物生长调节剂和培养方式
对文心兰类原球茎或丛芽诱导均产生重要影响，大田植株的花梗、花芽、茎尖、根尖等均可用作初代培养的外植体，
其中花梗及花芽为最常用的外植体，试管苗的所有组织器官均是有效的外植体；文心兰离体培养以固体培养方式
为主，１／２ＭＳ、ＭＳ是用于文心兰离体培养最常用的基本培养基，培养基中植物生长调节剂种类、浓度及其配比是文
心兰离体培养成功与否的关键因素。文心兰类原球茎形成过程是典型的体细胞胚胎发生发育过程，体细胞胚胎发
生受植物生长调节剂、基因型、培养条件等影响较大。文心兰转基因研究尚处于初步阶段。
关键词：文心兰；组织培养；体细胞胚胎发生；转基因；研究进展
中图分类号：Ｑ９４３．１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１０）０４０２２０１０
　 文心兰（犗狀犮犻犱犻狌犿）又名跳舞兰、金粉蝶兰、瘤瓣兰，属复茎类洋兰，附生或地生，原产墨西哥、西印度群岛、巴
西等地［１］。花小而繁多，形态变化多样，可连续不断地开放，是重要的三大洋兰之一，在多年的园艺研究中通过种
间和属间杂交培育出了许多花色优美、四季开花的优良切花或盆栽品种。文心兰同其他兰科植物一样，按照传统
的分株繁殖方法进行繁殖时，繁殖系数较低，因而其种苗繁殖主要通过组织培养技术完成。早在１９７３年，Ｆａｓｔ［２］
就以花梗尖为外植体，成功建立了文心兰离体再生体系，此后，国内外学者用不同的外植体分别建立了文心兰的
离体快速繁殖技术体系，为文心兰种苗的工厂化生产及相关生物技术研究奠定了基础。传统杂交育种受制于种
质资源，文心兰农艺性状改良及种质创新难以获得突破，现代生物技术特别是转基因技术的发展给兰花的遗传改
良带来了希望，各种兰花包括文心兰的转基因技术研究也悄然兴起。本研究对国内外有关文心兰组织培养及转
基因研究进展进行综述，对相关文献报道进行分析，旨在为文心兰的研究提供理论参考。
１　文心兰组培快繁研究主要进展
文心兰离体快速繁殖的基本技术环节主要包括：类原球茎或丛芽诱导、类原球茎或丛芽增殖、试管苗生根及
移栽等，由于存在外植体基因型、地理区域等因素的差异，文心兰离体繁殖关键技术环节中依然存在较多值得进
一步研究的问题，不同研究者报道的相关结果也不尽相同。
１．１　类原球茎或丛芽诱导
类原球茎（ｐｒｏｔｏｃｏｒｍｌｉｋｅｂｏｄｙ，ＰＬＢ）的形成是兰花离体培养过程中特有的发育现象，通过ＰＬＢ的诱导和增
殖可以在短时间内实现兰花试管苗的大量繁殖，也是各种兰花开展工厂化种苗生产的关键环节。同其他兰花一
样，影响文心兰ＰＬＢ诱导与增殖的因素有很多，但外植体的种类、培养基类型、植物生长调节剂的种类和浓度、培
养方式等是最关键的几个因素。
１．１．１　外植体　从理论上说，文心兰所有的组织器官均能够在特定培养条件下诱导ＰＬＢ或丛芽的形成，建立其
离体繁殖技术体系，但花梗及其花芽、茎（芽）尖、根尖是文心兰初代培养最为常用的外植体。
１９７３年Ｆａｓｔ［２］报道了用花梗芽尖诱导ＰＬＢ获得成功，建立了文心兰离体繁殖技术体系；ＬｉｍＨｏ和Ｌｅｅ［３］以
及Ｓａｎｔａｎａ和Ｃｈａｐａｒｒｏ［４］也用花梗芽为外植体，通过ＰＬＢ诱导、增殖与分化，实现了文心兰试管苗的大量增殖；
中国台湾学者Ｃｈｅｎ和Ｃｈａｎｇ［５］利用花梗节间组织，经体细胞胚胎发生和芽形成途径实现植株再生和大量繁殖。
国内的陈兴贻［６］首先利用花穗和茎尖进行文心兰ＰＬＢ诱导及植株再生的研究工作，标志着大陆文心兰组织培养
２２０－２２９
２０１０年８月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第１９卷　第４期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
 收稿日期：２００９０８２１；改回日期：２００９１１１６
基金项目：安徽省自然科学基金项目（０７０４１１０１０），安徽省教育厅省级自然科学基金项目（ＫＪ２００７Ｂ０５３）资助。
作者简介：崔广荣（１９６４），男，安徽长丰人，副教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｃｕｉｇｒ６４＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
有关研究工作正式开始。彭晓明等［７］、钟士传和曹善东［８］分别用花梗为外植体诱导ＰＬＢ成功，建立了文心兰离
体快速繁殖技术体系；崔广荣等［９］以花梗为材料，比较了花原芽、幼小花苞、成熟花苞在特定培养条件下诱导丛芽
形成效应，证明只有花原芽易于形成丛芽或少量的ＰＬＢ。可见，选取花梗为培养材料时，应该注意花梗芽发育的
生理年龄。以花梗为外植体进行初代培养相对来说比较方便，也有利于保护母株免受损毁。
茎（芽）尖是文心兰初代培养的另一个常用外植体。Ｋｈａｗ等［１０］、ＬｉｍＨｏ［１１］、Ｓａｇａｗａ和Ｋｕｎｉｓａｋｉ［１２］分别以
茎（芽）尖为外植体诱导ＰＬＢ的形成而实现试管苗的大量增殖；Ｊｈｅｎｇ等［１３］用茎尖诱导形成胚性愈伤组织，再通
过胚性愈伤组织的诱导保持、增殖，实现试管苗的高效再生。国内有关茎尖培养再生植株也有较多的报道。陈兴
贻［６］、彭晓明等［７］、潘学锋等［１４］、李文玲等［１５］均用茎尖为外植体，经ＰＬＢ诱导、增殖和苗分化途径建立了文心兰
离体快速繁殖技术体系；叶秀仙等［１６］用茎尖诱导丛生芽途径实现植株的高频率再生。茎尖大小对最终的培养结
果会产生一定的影响：茎尖较大，容易成活，则易于形成芽或丛芽；茎尖较小，不易成活，则易于形成类原球
茎［１５，１７］。茎尖培养的最大问题是对母株的损毁，对于材料有限的优良植株来说要慎用，另外，消毒灭菌和茎尖剥
离也相对烦琐、操作困难。
根尖也是初代获取试管苗的一个重要途径，取材方便，也不会损毁母株，但兰花的根尖培养难度较大，不易成
功［１８，１９］，因此文心兰根尖离体培养成功报道的文献较少。Ｋｅｒｂａｕｙ［１９］在用根尖为外植体进行愈伤组织或ＰＬＢ诱
导时发现，由根尖组织细胞形成的愈伤组织形成ＰＬＢ的能力较弱，愈伤组织似乎未能彻底脱分化，依然保持其高
度分化的“根状态”（ｒｏｏｔｓｔａｔｅ），但通过植物生长调节剂和培养基的调整，最终获得大量的ＰＬＢ及再生植株；
Ｃｈｅｎ和Ｃｈａｎｇ［２０］以根尖为外植体，通过愈伤组织诱导，由愈伤组织体经细胞胚胎发生途径，实现了植株的高效
再生。笔者曾以试管苗根段进行培养试验，仅发现在根尖生长点部位膨大，形成少量的愈伤组织，但最终未能形
成ＰＬＢ及芽苗（未报道）。以盆栽植株根尖为材料的一个问题是，消毒灭菌困难，培养物易污染，这也是根培养难
以成功的另一重要原因。
有关成体盆栽植株叶片及其假鳞茎为外植体的研究尚未见报道，特别是假鳞茎有可能是一潜在的、有价值的
外植体。
初代培养获取试管无菌苗或ＰＬＢ，其幼嫩叶片、茎尖及ＰＬＢ都可作为外植体进行相关的研究。Ｃｈｅｎ和
Ｃｈａｎｇ［２１］以试管苗叶片为外植体，通过体细胞胚胎直接发生途径，实现了试管苗的有效再生；其后，他们在体细胞
胚胎发生效率等方面进行了较为系统而深入的研究［２２２６］，为文心兰体细胞胚胎发生研究奠定了坚实基础。试管
苗茎尖分生组织是ＰＬＢ诱导的好材料，能够在特定培养条件下有效诱导出ＰＬＢ［１７］，对于短时间内需要获得大量
ＰＬＢ或某些较难获得ＰＬＢ的基因型材料来说，具有一定的参考价值。利用类原球茎薄切片（ｔｈｉｎｃｅｌｌａｙｅｒｓ，
ＴＣＬ）进行培养，不仅可在短时间内高效获得大量的ＰＬＢ及再生苗，而且为文心兰转基因研究提供了良好的受体
材料，也为文心兰离体化学诱变育种提供了有效的技术平台［２７，２８］。
１．１．２　基本培养基及其添加物　选定特定的外植体后，基本培养基的类型及其添加物的选择是植物组织培养工
作者在进行任何植物离体培养前都必须认真考虑的问题，因为不同类型基本培养基的成分各有特点，它不仅影响
培养的效率，甚至决定培养的成败。除植物生长调节剂外，培养基中的各种添加物对培养物的生长发育也会产生
作用而影响培养效率。
用于文心兰组织培养的基本培养基主要有 ＭＳ（ｍｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄｓｋｏｏｇｍｅｄｉｕｍ）、１／２ＭＳ、ＶＷ（ｖａｃｉｎｅａｎｄ
ｗｅｎｔｍｅｄｉｕｍ）、ＲＭ（ｒｕｇｉｎｉｏｌｉｖｅｍｅｄｉｕｍ）、Ｎ６（ＣｈｕＮ６ｍｅｄｉｕｍ）、改良ＫＣ（ＫｎｕｄｓｏｎＣｍｅｄｉｕｍ）等，从国内外相
关文献报道看，不同的研究者结果不尽相同，其他植物组织培养研究也是如此［２９］。国外文献报道用于文心兰组
织培养的基本培养基以１／２ＭＳ居多［１１，１２，２０２６，３０］，当然，也有使用ＶＷ 基本培养基［１９］。而国内文献报道的以 ＭＳ
基本培养基为多［６，７，９，１４，１５，３１３３，］，也有使用１／２ＭＳ基本培养基或其他基本培养基［６，２７，３４４１］。尽管不同研究者使用
的基本培养基不同，但他们用不同的外植体培养时均获得了比较好的试验结果，这从另一方面说明文心兰对基本
培养基中无机盐浓度的要求并不苛刻，笔者在实践中使用 ＭＳ或１／２ＭＳ基本培养基时，也均获得了比较好的培
养效果，这与蝴蝶兰（犘犺犪犾犪犲狀狅狆狊犻狊）等其他洋兰要求的较低浓度无机盐不完全相同。彭晓明等［７］研究认为，Ｎ６
培养基中茎尖及花梗外植体分化速度和出芽率都优于 ＭＳ培养基，外植体在 ＭＳ培养基中分化出较多ＰＬＢ，而
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Ｎ６ 培养基则促进分化芽。何松林等［３４］比较了 ＭＳ、１／２ＭＳ、ＶＷ３种基本培养基对文心兰ＰＬＢ增殖和对幼苗形
成的影响时发现，１／２ＭＳ基本培养基有利于ＰＬＢ增殖，而ＭＳ基本培养基有利于幼苗形成，同时这些影响与培养
基中不同凝固剂密切相关。叶秀仙等［１６］研究认为１／２ＭＳ适合于茎尖丛芽诱导，而 ＭＳ适合于丛芽增殖，但杨玉
珍等［４０］用１／２ＭＳ基本培养基时，也得到了较高丛芽的增殖率。实际上，丛芽增殖在其他培养条件相同时，除了
与基本培养基密切相关外，还与接种连体芽苗数、芽苗大小等因素有关［３２］。分析发现，不同研究者得出试验结果
不尽相同的另一重要因素与所使用材料的基因型不同也有一定关系，在对特定基因型材料进行培养时，一定要进
行反复试验，寻找最适合自己材料培养的基本培养基。
培养基中的糖源对外植体的生长影响较大，它不仅是外植体生长所必须的碳源和能源，也是调节培养基渗透
压的重要物质。何松林等［３５］采用液体静置培养方式研究ＰＬＢ增殖时发现，以蔗糖为碳源时，ＰＬＢ在鲜重和干物
质重方面显著高于麦芽糖和山梨醇，且ＰＬＢ分化幼苗数少，有利于ＰＬＢ增殖。Ｊｈｅｎｇ等［１３］研究糖源对胚性愈伤
组织形成ＰＬＢ、ＰＬＢ发育及苗再生时证明，较高浓度的蔗糖、麦芽糖、海藻糖（１０～２０ｇ／Ｌ）有利于提高ＰＬＢ的增
殖率，麦芽糖和海藻糖促进ＰＬＢ的形成和发育；２０ｇ／Ｌ的麦芽糖和海藻糖不仅增加ＰＬＢ鲜重，而且使ＰＬＢ直径
增大、数量增加，经过６个月培养后，２０ｇ／Ｌ的海藻糖比麦芽糖更能有效促进ＰＬＢ成熟和苗形成。Ｈｏｎｇ等［３０］研
究纤维二糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖５种糖源对２种文心兰离体叶片体细胞胚胎发生的影响时发现，纤维二
糖阻碍２个品种（ＧｏｗｅｒＲａｍｓｅｙ和ＳｗｅｅｔＳｕｇａｒ）体细胞胚发生，离体叶片褐化率增加；蔗糖、葡萄糖和果糖却适
合２个品种叶片体胚的发生，但２个品种对不同种类糖源合适浓度的要求不同：ＧｏｗｅｒＲａｍｓｅｙ品种，蔗糖３０～
６０ｇ／Ｌ、葡萄糖１０～２０ｇ／Ｌ、果糖２０～３０ｇ／Ｌ；ＳｗｅｅｔＳｕｇａｒ品种，蔗糖２０～６０ｇ／Ｌ、葡萄糖１０～３０ｇ／Ｌ、果糖１０
～２０ｇ／Ｌ、麦芽糖３０～６０ｇ／Ｌ［３０］。其中３０ｇ／Ｌ的蔗糖最适合ＧｏｗｅｒＲａｍｓｅｙ品种，而２０ｇ／Ｌ葡萄糖最适合
ＳｗｅｅｔＳｕｇａｒ品种［３０］。可见品种间基因型不同对培养基中糖源种类及浓度要求均存在较大差异。崔广荣等［３３］
用液体摇床培养方法进行ＰＬＢ增殖时证明，较低浓度的蔗糖（７．５～１５．０ｇ／Ｌ）有利于ＰＬＢ的增殖和生长。
在培养基中添加特定的有机物对改善外植体的生长状态和提高培养效率也具有一定的效果。在文心兰离体
培养培养基中常用的有机添加物主要有香蕉泥（汁）、椰子汁、马铃薯汁、番茄汁、苹果汁、黄瓜汁、维生素Ｃ、蛋白
胨、酵母提取物、谷氨酰胺等，这些物质含有一些氨基酸、激素或酶等有机物质及其他成分较为复杂的天然复合
物，它们对细胞的增殖和分化有明显的促进作用［４２］。彭晓明等［７］、欧阳彤等［４１］试验证明，培养基添加１００ｇ／Ｌ香
蕉汁能促进文心兰类原球茎和芽的增殖，芽／类原球茎的增殖比值增大，而且还有壮苗的功能；潘学锋等［１４］研究
也证明香蕉汁促进文心兰植株生长，试管苗叶色浓绿、根粗而健壮，苗生长状态好于马铃薯汁。新鲜椰子汁是兰
花组织培养中最为常用的有机物之一。潘学锋等［１４］进行ＰＬＢ增殖时发现，１０％的椰子汁可有效减少ＰＬＢ的褐
化，促进ＰＬＢ的增殖；崔广荣等［３３］在液体培养条件下进行文心兰ＰＬＢ增殖时发现，添加５％（ｖ／ｖ）椰子汁可提高
ＰＬＢ增殖系数，但椰子汁添加量并非越大越好，随着椰子汁添加量加大，ＰＬＢ的增殖系数逐渐降低，ＰＬＢ的颜色
从黄绿到深绿逐渐加深，而且ＰＬＢ芽分化也较多。何松林等［３５］比较了蛋白胨、胰蛋白胨、椰子汁、番茄汁、苹果
汁等有机物对文心兰ＰＬＢ增殖及幼苗分化的作用效果，认为蛋白胨对ＰＬＢ的增殖具有显著的促进作用，５种有
机物作用效果顺序为蛋白胨＞番茄汁＞椰子汁＞苹果汁＞胰蛋白胨，但在幼苗分化时，胰蛋白胨、苹果汁和椰子
汁处理好于蛋白胨和番茄汁处理。在利用茎尖诱导ＰＬＢ中，添加一定量的蛋白胨或酵母提取物可提高ＰＬＢ的
诱导率，添加少量维生素Ｃ则可有效减少外植体的褐化［４１］。Ｃｈｅｎ和Ｃｈａｎｇ［２３］利用文心兰叶片进行体细胞胚胎
发生研究时证明，培养基中添加０．１～１．０ｇ／Ｌ的蛋白胨和１．０ｇ／Ｌ水解酪蛋白能显著提高离体叶片体细胞胚胎
的发生率，蛋白胨添加量在０．５ｇ／Ｌ时，叶片体胚发生率可达８０％，而添加相应量的谷氨酰胺作用不明显，甚至
添加量达１．０ｇ／Ｌ时的体胚发生率（４０％）比对照处理的发生率（５０％）还低。因此，在文心兰组织培养中添加有
机物应根据需要有选择的添加，而且应对特定添加物的量要进行反复试验后才能确定。
在文心兰组织培养研究中，添加其他物质进行一些相关的研究也有少量的报道，如添加活性炭可减少外植体
褐化等研究。试验证实，文心兰组织培养中的褐化远没有蝴蝶兰及其他洋兰那么严重，在培养基中添加这些物质
的作用并不明显，也没有太大的必要。实际上活性炭不仅吸附有害的褐化物质，也吸附有用的其他有机物质，因
而在实际研究中可能反而降低培养效率。
２２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
１．１．３　植物生长调节剂　培养基中添加一定量的植物生长调节剂（或植物激素）是植物组织培养成功与否的最
关键因素，没有各种植物激素的发现和应用，可以说就没有今天蓬勃发展的植物组织培养技术。植物组织培养中
使用的植物生长调节剂主要分为２大类：生长素和细胞分裂素，２类植物生长调节剂的浓度及其比例直接决定了
外植体的生长和发育方向。文心兰离体培养主要分为３个环节：ＰＬＢ或丛芽诱导、试管苗增殖、试管苗生根（其
中ＰＬＢ的形成过程其本质就是体细胞胚胎的发生发育过程）。细胞分裂素类植物生长调节剂主要用于ＰＬＢ或
丛芽的诱导和增殖，而生长素类植物生长调节剂主要用于愈伤组织诱导和试管苗生根，这与其他植物的离体培养
效应相似，但２类植物生长调节剂间的协同作用机理却十分复杂，而且受外植体的影响较大。Ｃｈｅｎ和Ｃｈａｎｇ［２１］
在开展文心兰离体叶片体细胞胚胎诱导时发现，单独使用ＴＤＺ［１ｐｈｅｎｙｌ３（１，２，３ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ５ｙｌ）ｕｒｅａ］，高效
细胞分裂素类物质时，在０．３～３．０ｍｇ／Ｌ内均能诱导出体胚或ＰＬＢ的形成，诱导频率随ＴＤＺ浓度的增大而逐渐
提高，但因供体叶片的长度不同而诱导效率不同。在 ＴＤＺ浓度为３．０ｍｇ／Ｌ时，２～４ｃｍ长叶片的诱导率为
２５％，而５～７ｃｍ长叶片的诱导率为３５％，但单独使用２，４Ｄ时，则无体胚或ＰＬＢ形成，且离体叶片逐渐褐化死
亡［２１］。他们的试验结果还表明，当不同浓度２，４Ｄ与ＴＤＺ组合使用时，体胚或ＰＬＢ的诱导率逐渐降低，直至为
０，２，４Ｄ表现出对体胚或ＰＬＢ形成的强烈抑制作用，这与蝴蝶兰的研究结果十分类似［２１，４３］。在继代培养中发
现，较低浓度ＴＤＺ（０．３～１．０ｍｇ／Ｌ）有利于ＰＬＢ增殖，而更低浓度ＴＤＺ（０～０．１０ｍｇ／Ｌ）则有利于苗的形成，在
同样基本培养基中改加０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ则适合试管苗的生根和壮苗［２１］。Ｃｈｅｎ等［２２］的研究工作在文心兰组织
培养中具有典型的代表性，对文心兰的组织培养研究具有普遍的借鉴价值和指导意义，也揭开了文心兰离体叶片
体细胞胚胎直接发生研究的序幕。随后他们又系统研究了４种生长素类物质（ＩＡＡ：ｉｎｄｏｌｅ３ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ、ＮＡＡ：
ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ、ＩＢＡ：ｉｎｄｏｌｅ３ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ、２，４Ｄ：２，４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）和５种细胞分裂素物
质（ＴＤＺ、２ｉＰ：２ｌｓｏｐｅｎｔｙｌａｄｅｎｉｎｅ、ＺＴ：ｚｅａｔｉｎ、ＫＴ：ｋｉｎｅｔｉｎ、ＢＡ：ｂｅｂｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ）对离体叶片不同部位体胚直接发生
或ＰＬＢ形成的影响，再次证明生长素类物质的抑制作用和细胞分裂素类物质的促进作用，而且证明叶片的部位
不同，体细胞胚胎直接发生频率也不同［２２］。但是 Ｗｕ等［４４］分别用不同浓度的５种生长素类物质和５种细胞分裂
素类物质进行愈伤组织体胚发生的研究证明，较高浓度（２～５ｍｇ／Ｌ）的ＩＡＡ及较低浓度（０．５～２ｍｇ／Ｌ）的ＩＢＡ、
ＮＡＡ、Ｐｉｃｌｏｒａｍ（４氨基３，５，６三氯吡啶羧酸）等生长素类物质能够在一定程度上促进来源于根的愈伤组织形成
胚性愈伤组织及体胚的发生，但它们的作用远小于细胞分裂素ＫＴ和ＺＴ，２ｍｇ／Ｌ的ＫＴ或０．５ｍｇ／Ｌ的ＺＴ能
使愈伤组织１００％转变为胚性愈伤组织，体胚形成数多。另外，ＮＡＡ与ＴＤＺ的组合使用可有效促进来源于根的
愈伤组织体胚的发生和形成，体胚的发生频率最高可达９３．８％［２１］。可见，培养材料不同，即使是相同的培养目
标，各类植物生长调节剂作用效果也不相同，这在其他植物的组织培养中也得到了验证［４５，４６］。探索和优化培养
基中植物生长调节剂种类、浓度及其组合使用等问题可能是植物组织培养工作的一个长期过程。
从国内报道的有关文献看，用于文心兰组织培养的植物生长调节剂细胞分裂素类物质主要有ＢＡ、ＫＴ、Ａｄ
等，生长素类物质主要有ＮＡＡ、２，４Ｄ、ＩＡＡ等。彭晓明等［７］研究指出，０．５～１．０ｍｇ／Ｌ的ＢＡ不能启动茎尖和花
梗外植体的分化，２．０ｍｇ／ＬＢＡ启动分化芽效果最好，５．０ｍｇ／ＬＢＡ则促进外植体分化ＰＬＢ，且在 ＭＳ和Ｎ６ 基
本培养基中的表现不同，Ｎ６ 培养基中外植体分化速度和出芽率都优于 ＭＳ；继代培养过程中，２．０ｍｇ／ＬＢＡ浓度
有利于ＰＬＢ增殖生长，降低ＢＡ浓度和添加少量的 ＮＡＡ则有利于ＰＬＢ分化芽。崔广荣等［９］研究表明，４．０
ｍｇ／ＬＢＡ与０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ组合使用适合于花原芽诱导丛芽的形成，维持或适当降低ＢＡ浓度适合于苗的继代
增殖。欧阳彤等［４１］在改良培养基基础上研究后认为，０．１～２．０ｍｇ／ＬＢＡ和０．１～１．０ｍｇ／ＬＮＡＡ组合使用可
满足茎尖ＰＬＢ的诱导和增殖需求。
综上所述，基本培养基类型对植物生长调节剂的浓度要求和使用不尽相同。此外，外植体的部位、基因型都
可能影响植物生长调节剂的使用量。表１将近２０年来有关文心兰组织培养主要文献中使用的最佳植物生长调
节剂及其组合的使用进行了简要总结。
１．１．４　培养方式　植物组织培养主要有固体培养和液体培养２种方式，文心兰组织培养以固体培养方式为主，
有关其液体培养方式的报道很少。与固体培养相比，液体培养有其自身的优点：外植体能充分、均匀吸收培养基
的各种营养、均匀接受光照；外植体产生的褐化物能及时扩散至培养基中，避免固体培养基中局部高浓度的褐化
３２２第１９卷第４期 草业学报２０１０年
物对外植体生长的影响等，但其不足之处在于浸在液体中的外植体氧气供应不足及易产生玻璃化等问题［４７４９］。
陈兴贻［６］用液体静置培养基对茎尖进行过度性培养，待茎尖组织转绿后再转移到固体培养基中进行ＰＬＢ诱导和
形成。何松林等［３４］比较了固体培养和液体培养２种培养方式对文心兰ＰＬＢ增殖影响时发现，液体振荡及回旋
培养较固体培养方式好，固体培养方式进行ＰＬＢ增殖过程中幼苗形成率高，因此固体培养方式不适合ＰＬＢ增
殖。这可能与他们所用培养基的成分包括植物生长调节剂等因素有关，在液体培养条件下，培养基成分的变化也
易于导致芽苗的大量形成［３３］。研究发现，文心兰ＰＬＢ在固体培养基中进行增殖时，确实比较容易形成芽苗，尤
其是在培养后期培养基中的植物生长调节剂浓度降低后，幼苗的形成率随着培养时间的延长越来越高（数据未发
表），但这可通过调整培养基中的２种植物生长调节剂的浓度及比值来控制芽／ＰＬＢ的比例［７］。崔广荣等［３３］研究
证明，液体培养基中不同植物生长调节剂配比、蔗糖浓度、椰子汁添加量等对ＰＬＢ的增殖均产生一定的影响，添
加１０％（ｖ／ｖ）椰子汁会促进芽苗的形成；在同样的培养条件下，液体培养的ＰＬＢ在５周内的增殖速率较固体快，
增殖曲线呈倒“Ｖ”字型，第３周达到增殖高峰，随后增殖率迅速下降，但在固体培养基中，ＰＬＢ的增殖生长缓慢，
增殖生长曲线近似直线，这一结果表明，利用液体进行ＰＬＢ增殖培养的周期不宜过长。液体培养增殖的ＰＬＢ最
大问题是易产生玻璃化问题、成苗时间延迟，且在一定的时间内分化苗的状态也较差［３３，４９］。但文心兰ＰＬＢ液体
增殖培养仍具有重要意义，ＰＬＢ在短时间内快速增殖对其转基因研究及化学诱变育种具有一定的价值［２９，５０］。在
蝴蝶兰研究中，人们已经通过液体培养各种参数的优化，成功研制出各种生物反应器，它可从根本上解决植物组
织培养上依然存在的普遍问题，实现植物离体快速繁殖规模化、自动化控制，降低劳动强度和生产成本的目
标［４７，４８］。因此，加强文心兰液体培养研究，探索各种培养参数，对研制文心兰生物反应器及其在生产上应用具有
重要意义。
表１　文心兰组织培养中主要植物生长调节剂浓度及组合
犜犪犫犾犲１　犕犪犼狅狉犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊犪狀犱犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狊狅犳狆犾犪狀狋犵狉狅狑狋犺狉犲犵狌犾犪狋狅狉狊犻狀狆犾犪狀狋狋犻狊狊狌犲犮狌犾狋狌狉犲狅犳犗狀犮犻犱犻狌犿
植物生长调节剂
Ｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｏｒ
外植体
Ｅｘｐｌａｎｔｓ
培养目的
Ｏｂｊｅｃｔｏｆｃｕｌｔｕｒｅ
文献来源
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
３．０ｍｇ／ＬＴＤＺ 叶片Ｌｅａｆｓｅｇｍｅｎｔ 体细胞胚胎发生Ｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ［２１］
０．３～１．０ｍｇ／ＬＴＤＺ ＰＬＢ诱导与增殖Ｐｒｏｔｏｃｏｒｍｌｉｋｅｂｏｄｙｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ
０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ 试管苗生根Ｒｏｏｔｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｌｅｔ
３．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋３．０ｍｇ／ＬＴＤＺ 根尖 Ｒｏｏｔｔｉｐ 愈伤组织诱导Ｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ［５］
０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋３．０ｍｇ／ＬＴＤＺ 愈伤组织Ｃａｌｕｓ 体细胞胚胎发生Ｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ
６．０ｍｇ／ＬＢＡ 花穗、茎尖 ＰＬＢ诱导Ｐｒｏｔｏｃｏｒｍｌｉｋｅｂｏｄｙｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ［６］
０．２ｍｇ／ＬＮＡＡ Ｓｐｉｋｅ，ｓｈｏｏｔｔｉｐ 试管苗生根Ｒｏｏｔｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｌｅｔ
２．０ｍｇ／ＬＢＡ 花梗、茎尖 丛芽诱导Ｃｒｏｗｄｓｈｏｏｔｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ［７］
５．０ｍｇ／ＬＢＡ Ｆｌｏｗｅｒｓｔａｌｋ，ｓｈｏｏｔｔｉｐ ＰＬＢ诱导Ｐｒｏｔｏｃｏｒｍｌｉｋｅｂｏｄｙｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
０．２ｍｇ／ＬＢＡ＋０．２ｍｇ／ＬＮＡＡ 继代增殖、生根壮苗Ｐｌａｎｔｌｅｔｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，ｒｏｏｔｉｎｇａｎｄｓｔｒｏｎｇｓｔｏｃｋ
５．０ｍｇ／ＬＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ 茎尖、花蕾 ＰＬＢ诱导Ｐｒｏｔｏｃｏｒｍｌｉｋｅｂｏｄｙｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ［４０］
２．０ｍｇ／ＬＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ Ｓｈｏｏｔｔｉｐ，ｆｌｏｗｅｒｂｕｄ 不定芽增殖Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ
０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ 试管苗生根Ｒｏｏｔｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｌｅｔ
４．０ｍｇ／ＬＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ 花梗芽Ｆｌｏｗｅｒｂｕｄ 丛芽诱导与增殖 ［９］
２．０～４．０ｍｇ／ＬＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ Ｃｒｏｗｄｓｈｏｏｔｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
０．５ｍｇ／ＬＩＢＡ 试管苗生根Ｒｏｏｔｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｌｅｔ
２．０ｍｇ／ＬＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ 茎尖Ｓｈｏｏｔｔｉｐ 丛芽诱导与增殖Ｃｒｏｗｄｓｈｏｏｔｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ［１６］
０．５ｍｇ／ＬＩＢＡ 试管苗生根Ｒｏｏｔｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｌｅｔ
　注：植物生长调节剂浓度统一换算成“ｍｇ／Ｌ”。
　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｌｙｃｏｎｖｅｒｔｅｄｉｎｔｏｕｎｉｔｅ‘ｍｇ／Ｌ’．
４２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
１．１．５　其他　何松林等［３６３９］系统研究了树脂膜培养容器在文心兰组织培养中的应用，探讨了非无菌条件下接
种、ＣＯ２ 施肥等技术，在简化无菌操作过程、减少仪器设备的投入、提高作业效率、降低试管苗生产成本等方面做
了大量有益的工作。特别是非无菌条件接种及培养技术等可能是未来组织培养应用的一个重要方向。
１．２　试管苗增殖、生根与移栽
文心兰试管苗增殖与其他植物试管苗增殖培养基本相似，影响文心兰试管苗增殖的主要因素是培养基及其
添加物，尤其是培养基中细胞分裂素类物质的种类及浓度［１６，３２］。此外，培养基凝固剂（琼脂）用量、接种苗大
小［１６，３２，５０］、接种单株苗或联体苗［３２］等对试管苗增殖也有重要影响。用于试管苗增殖的常用培养基为 ＭＳ，细胞分
裂素类物质主要为ＢＡ［７，１６，３２］。崔广荣等［５１］在培养基中含有０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ条件下，比较了ＢＡ、ＫＴ、Ａｄ等细胞
分裂素对试管苗增殖的影响，ＢＡ的增殖效果较ＫＴ和Ａｄ均好，培养基中添加２．０～４．０ｍｇ／ＬＢＡ最适合文心
兰试管苗增殖，如ＢＡ浓度继续提高，有部分ＰＬＢ形成，同时试管苗增殖率降低。叶秀仙等［１６］也认为２．０ｍｇ／Ｌ
ＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ最适合文心兰试管苗增殖。接种苗的大小对试管苗增殖率也有不可忽视的作用，接种幼小
芽苗有利于丛芽的形成，提高试管苗的增殖率［１６，３２］；接种联体芽苗不但易于形成丛生苗，还可有效提高增殖率，
表现出一定的“群体效应”［３２］。培养基中琼脂浓度过大，不利于试管苗的增殖，这可能因为硬度增大的固体培养
基不利于试管苗的营养物质吸收而导致试管苗增殖生长受到影响［５０］。一般研究认为兰花组织培养要求ｐＨ值
较低（５．０～５．５），但文心兰试管苗增殖对ｐＨ值要求并不十分严格，在ｐＨ值５．２～６．２内，试管苗的增殖与生长
差异并不明显［５０］。此外，在培养基中添加香蕉泥、苹果汁、黄瓜汁等有利于生根和壮苗［７，１６］。
文心兰试管苗生根基本培养基主要为１／２ＭＳ，植物生长调节剂主要是生长素类物质ＩＢＡ或ＮＡＡ（表１），两
类生长素类物质的使用浓度范围均为０．１～０．５ｍｇ／Ｌ。实际上，在１／２ＭＳ基本培养基中，不添加任何植物生长
调节物质，试管苗也可正常生根，只是生根数量相对较少，生根速度较慢。试管苗移栽前一般经２～３ｄ的练苗后
即可移栽成活［７，２１］，栽培基质可为水苔草［１７，２１］、蕨根加椰壳粉［６］、椰壳颗粒、细碳泥［７］、小树皮加小石子等［４０］，移
栽后注意浇水、控制湿度及遮光，就可得到较高的成活率。
２　体细胞胚胎发生研究主要进展
体细胞胚胎（或胚状体）发生是植物离体培养再生植株的重要途径之一［５２］。越来越多的研究表明，兰花离体
叶片类原球茎发生发育的过程就是典型的体细胞胚胎发生的过程［５３５６］，较大颗粒状的类原球茎是体细胞胚胎或
胚状体较为成熟的后期阶段。由于文心兰体细胞胚胎发生起源于单细胞，这不仅为文心兰组培快速繁殖提供了
一条重要途径，也为文心兰相关生物技术如化学诱变、转基因的研究工作奠定了基础［２１］。
２．１　离体叶片体细胞胚胎直接发生
Ｃｈｅｎ和Ｃｈａｎｇ［２１］首先报道了文心兰离体叶片体细胞胚胎直接发生的研究。结果证明，体胚起源于叶片表
皮细胞或紧挨表皮细胞下组织细胞，为单细胞起源；细胞分裂素类物质ＴＤＺ在叶片体胚发生中起关键作用，０．３
～３．０ｍｇ／Ｌ的ＴＤＺ均能诱导体细胞胚胎的直接发生，但２，４Ｄ却抑制体胚的发生，浓度越大，抑制作用越强；继
代培养时，培养基中０．３～１．０ｍｇ／Ｌ的ＴＤＺ有利于体胚或ＰＬＢ的生长发育；离体叶片的发育程度（长度表示）影
响其发生频率，在同样条件下，５～７ｃｍ长叶片的体胚发生率及每个外植体平均形成体胚数均高于长度为２～４
ｃｍ的叶片［２１］。之后，采用４种生长素类物质（ＩＡＡ，ＩＢＡ，ＮＡＡ，２，４Ｄ）和５种细胞分裂素类物质（２ｉｐ、ＺＴ、ＫＴ、
ＢＡ、ＴＤＺ）研究其对叶片不同部位（近轴、远轴、叶尖、伤口表面）体细胞胚胎发生发育的影响，证明所有生长素类
物质对叶片不同部位体胚发生均产生抑制作用，其中ＩＢＡ和２，４Ｄ的作用最为明显［２３，２４］，但是如果培养基中添
加生长素运输抑制剂三碘苯甲酸（ＴＩＢＡ）则能有效促进体胚的发生［２７］；细胞分裂素类物质则对体胚发生普遍表
现出一定的促进作用，其中ＴＤＺ、２ｉＰ、ＺＴ的作用具有显著的促进作用，但叶片不同部位对不同浓度、不同种类的
细胞分裂素反应并不相同，叶尖和近轴叶片比较适合用于叶片的体胚诱导［２２２５］。需要注意的是，不同品种、不同
部位的文心兰叶片对各种植物生长调节剂的反应并不相同［２３，５７］。培养基中的蔗糖浓度对体胚的发生存在一定
的影响，尽管在１０～６０ｇ／Ｌ内，各处理间差异并不显著，但１０～２０ｇ／Ｌ的蔗糖体胚的发生频率最高［２３］；不过，糖
源种类对体胚发生有较大影响，不同品种对糖的种类、糖浓度的要求均不同［３０］；添加１７０ｍｇ／ＬＮａＨ２ＰＯ４ 和０．５
ｇ／Ｌ蛋白胨则可有效促进体胚的发生和形成［２３］。此外，培养基中添加乙烯合成前体物ＡＣＣ则能促进体胚发生，
５２２第１９卷第４期 草业学报２０１０年
而乙烯合成抑制物ＡｇＮＯ３ 及ＣｏＣｌ２ 则抑制体胚的发生［２５］，可见文心兰叶片体胚的直接发生与乙烯的合成存在
某种关联。其他种类的生长调节物质对文心兰叶片体胚的发生也产生重要作用，赤霉素（ＧＡ３）、矮壮素（ｃｙｃｏｃｅｌ）
抑制体胚发生，而嘧啶醇（ａｎｃｙｍｉｄｏｌ）和多效唑（ｐａｃｌｏｂｕｔｒａｚｏｌ）则能促进体胚的发生、发育，有效提高体胚的发生
频率［２４］。
２．２　愈伤组织体细胞胚胎发生
愈伤组织经体细胞胚胎发生途径实现试管苗再生，是植物离体快速繁殖的重要途径之一，在其他植物已经有
广泛的报道。文心兰愈伤组织诱导比较困难［１３，１９］，实际上兰花愈伤组织继代保持胚性状态更困难，非常容易转
变为ＰＬＢ。因此，有关文心兰通过愈伤组织进行体细胞胚胎发生的研究较少。Ｃｈｅｎ和Ｃｈａｎｇ［２１］用根尖、茎段、
叶片切段进行愈伤组织诱导时发现，根尖较叶片、茎段愈伤组织诱导频率高，来自根尖的愈伤组织较来自叶片、茎
段的愈伤组织具有更高的体细胞胚发生频率；ＮＡＡ与ＴＤＺ的组合使用可有效提高体胚的形成率［２０］。Ｗｕ等［４４］
研究比较了５种生长素类物质和５种细胞分裂素类物质对愈伤组织体胚发生的影响时证明，０．５和２．０ｍｇ／Ｌ
ＫＴ、０．５ｍｇ／ＬＺＴ的处理能更有效的诱导体细胞胚的形成。花梗切段培养通过２类植物生长调节物质的适当配
比既可直接进行体细胞胚胎发生途径，也可通过愈伤组织间接途径形成体胚、ＰＬＢ［２０］。
总体来看，文心兰体细胞胚胎发生的研究尚处于初步阶段，研究水平多处于体胚发生频率、组织形态及其影
响因素的层面上，探索文心兰体细胞胚胎发生的机理及其分子机制尚需深入研究。
３　文心兰转基因研究主要进展
近十几年来，兰花转基因研究取得了较快发展，人们使用基因枪法（ｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）或农杆菌介导法
（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）先后在石斛兰（犇犲狀犱狉狅犫犻狌犿）［５８，５９］、蝴蝶兰［６０６３］、大花蕙
兰（犆狔犿犫犻犱犻狌犿）［６４］等上获得成功，在文心兰转基因研究中，２种转化方法转基因体系也相继建立起来。Ｌｉａｕ
等［６５］首次应用农杆菌介导法将犺狆狋犐犐和犵狌狊犃 基因导入文心兰ＰＬＢｓ受体内，１０００个ＰＬＢ受体材料经潮霉素筛
选后共获得２８个转化植株，经过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交分析，外源基因不仅整合植株基因组，而且获
得了表达。Ｙｏｕ等［６６］用农杆菌介导和基因枪２种转化方法成功将狆犳犾狆（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ，铁氧化还原类
蛋白）基因（从甜椒分离，以前称为犃犘１，可抗犈狉狑犻狀犻犪犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪）导入文心兰植株体内获得成功，该转化体系建
立的重要意义在于证明了狆犳犾狆基因可取代传统上兰花转基因使用的犺狆狋犐犐和犵狌狊基因而作为选择标记基因，从
而用犈狉狑犻狀犻犪犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪作为转化子筛选剂；农杆菌介导转化５００个ＰＬＢ后获得了１８个转化植株，而基因枪转
化５００个ＰＬＢ后获得了１４个转化植株［６６］。用此基因转化文心兰时，还获得了抗软腐病（ｓｏｆｔｒｏｔｄｉｓｅａｓｅ）文心兰
植株［６７］。
影响植物转基因效率的因素有很多，其中转化受体材料及其再生植株体系对转化效率影响较大［６８］。颗粒较
大的文心兰ＰＬＢ已经是一个较为成熟的个体，因此以ＰＬＢ作为转化受体材料很容易获得嵌合体，转化效率普遍
较低，获得较多的单细胞体胚发生再进行转化时，将可提高转化效率。Ｌｉ等［６９］用０．５ｍｏｌ／Ｌ高渗蔗糖溶液对转
化前的ＰＬＢ进行２ｈ的预处理，使得单细胞胚发生比例提高了３～４倍，促进了ＰＬＢ植株再生，大大提高了基因
枪转化ＰＬＢ的效率。Ｒａｆｆｅｉｎｅｒ和Ｓｅｒｅｋ［７０］采用农杆菌转化法，分别以ＰＬＢ和叶尖为转化受体材料，将犲狋狉１１基
因［犲狋狉１１，乙烯受体突变基因，从拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中分离，该基因可减少植株对外界乙烯的敏感
性］导入文心兰植株，试图延长文心兰花期以增加观赏价值，经筛选和分子检测，外源基因已经导入植株基因组
中。遗憾的是该转化体系仅ＰＬＢ受体材料获得了转化植株，叶尖受体材料未能得到转化植株，转化植株的花期
表现尚待进一步观察［７０］。国内也有人报道文心兰遗传转化研究［７１］，但研究依然局限在转化体系的初步研究上，
离文心兰转基因技术在育种上应用还有较大差距。
从国内外相关研究报道看，文心兰转基因研究仍处于初步阶段，转化的外源基因种类、转化受体材料类型有
限，转化效率不高等问题还比较突出。但有理由相信，随着现代生物技术的不断发展及其在文心兰研究及生产上
的应用，一些花色丰富、抗逆、抗病等新种质必将不断涌现。
６２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
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［２６］　ＣｈｅｎＪＴ，ＣｈａｎｇＷＣ．ＴＩＢＡａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｒｅｃｔｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｆｒｏｍｌｅａｆｅｘｐｌａｎｔｓｏｆ犗狀犮犻犱犻狌犿［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
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［２７］　崔广荣，张子学，张从宇，等．文心兰、蝴蝶兰类原球茎薄切片高频诱导ＰＬＢｓ［Ｊ］．安徽科技学院学报，２００９，２３（２）：２１
２７．
７２２第１９卷第４期 草业学报２０１０年
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