全 文 ：书花苜蓿内生放线菌多样性及群落结构
张波１，李小林１，２，江华明１，３，张小平１
（１．四川农业大学资源环境学院，四川 成都６１１１３０；２．四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都６１００６６；
３．四川职业技术学院建筑与环境工程系，四川 遂宁６２９０００）
摘要：为了了解药用植物花苜蓿内生放线菌的多样性和群落结构，将采自四川省甘孜地区的药用植物花苜蓿进行
严格的表面消毒灭菌后，运用变性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术对其根茎叶
花等样品的内生放线菌进行分析。结果表明，花苜蓿不同组织中内生放线菌多样性和群落结构存在明显差异。其
内生放线菌的多样性指数（犎）和丰富度（犛）均是花＞根＞茎＞叶，而均匀度（犈犎）则是叶＞根＞茎＞花。不同组织
样品之间的放线菌群落结构相似性差异明显，其中茎与叶的相似性最高，根与叶之间相似性最低，其他组织之间相
似性均很低。ＤＧＧＥ条带回收测序结果显示，大部分克隆条带属于链霉菌属（犛狋狉犲狆狋狅犿狔犮犲狊），但仍有超过４３％的
条带属于稀有放线菌，且主条带Ａ２３和共有条带Ａ１２属于稀有放线菌，说明部分稀有放线菌在花苜蓿样品内是优
势放线菌。该研究表明了花苜蓿根茎叶花组织的内生放线菌存在丰富的多样性，且不同组织内生放线菌多样性存
在明显差异，其中花组织多样性最丰富。说明甘孜地区的药用植物花苜蓿可作为一种较理想的分离内生放线菌的
植物资源。
关键词：花苜蓿；放线菌；多样性；群落结构；ＤＧＧＥ
中图分类号：Ｓ５５１＋．７；Ｓ４３２．４＋３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０５０１１３０７
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０５１３　　
　　花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狉狌狋犺犲狀犻犮犪）不仅是蛋白质丰富的豆科牧草［１，２］，且有一定的药用价值，内服其煎汤能治肺
热咳嗽、赤痢，而外用熬膏涂则能消炎止血。四川省甘孜地区地域辽阔，以其独特的地理环境而存在明显的资源
优势。该地区具有丰富的药材资源，且质地优良，花苜蓿就是其中分布较普遍的一种。尽管花苜蓿已被广泛应用
于医药，但方式单一，并没普遍通过深入研究花苜蓿药用机理对其进行应用，这就在一定程度上阻碍了其长远发
展。随着人们探索微生物步伐的逐渐前行，从微观视角研究并解决一些问题变得行之有效［３］。
放线菌能产生许多重要的抗生素，因此目前对于内生放线菌的研究很多［４］。通过可培养的方法研究内生放
线菌的多样性，简单直接，还可获取一些放线菌资源。但由于环境中绝大部分放线菌难以通过传统的培养方式获
得，这样就很难准确评估这一微生物类群的多样性，所以越来越多的研究者将分子生物学技术应用于不同生境下
放线菌多样性的研究［５］，其中变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术就是一种有力的手段。医学领域最早应用这种技
术［６］，随后 Ｍｕｙｚｅｒ等［７］在群落结构分析方面也开始运用ＤＧＧＥ技术。宋亚娜等［８］利用ＤＧＧＥ技术研究了不同
间作和轮作种植体系对作物根际细菌和真菌群落结构的影响表明，不同的种植体系对微生物群落有明显的影响，
并且存在差异。王海英等［９］采用该技术对水井坊窖底泥微生物群落结构进行了分析，揭示了不同部位的窖底泥
的微生物群落结构具有一定的差异性。目前采用ＤＧＧＥ技术研究的领域很多，但对于植物内生放线菌多样性的
研究仍主要采用传统的培养技术，运用ＤＧＧＥ技术研究植物不同组织内生放线菌群落多样性鲜见报道。本研究
拟通过ＰＣＲＤＧＧＥ技术对花苜蓿不同组织内生放线菌群落结构和多样性进行研究，以期了解花苜蓿内生放线
菌多样性情况。
１　材料与方法
１．１　实验材料
２０１１年７月初从四川省甘孜地区采集花苜蓿植物样品，随机采集５株健康植株，采集样品海拔为３５７０ｍ，
第２２卷　第５期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１１３－１１９
２０１３年１０月
收稿日期：２０１３０３１１；改回日期：２０１３０４０８
基金项目：国家８６３计划（２０１３ＡＡ１０２８０２０５）资助。
作者简介：张波（１９８７），男，四川成都人，硕士。Ｅｍａｉｌ：６９０４９２９６７＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｘｉａｏｐｉｎｇｐｈｄ＠１２６．ｃｏｍ
具体地理位置Ｎ２９°５４′２９．６″，Ｅ１０１°５９′４９．２″。同时采集适量根际土，根际土采集按Ｓｍａｌａ等［１０］的方法进行。
将样品与土样装入无菌塑料袋，立即带回四川农业大学微生物实验室。通过对风干后土样进行理化性质测
定［１１］，花苜蓿根际土养分为：水分含量５３％，ｐＨ＝６．８６，有机质５９．０１ｇ／ｋｇ，速效钾３２８．４ｍｇ／ｋｇ，碱解氮１０２
ｇ／ｋｇ，有效磷４５．６ｍｇ／ｋｇ，全氮５．２ｇ／ｋｇ。除碱解氮含量属于中等，其他养分含量皆为丰富，可见该环境能够给
花苜蓿的生长提供很好的条件。
１．２　植物组织ＤＮＡ的提取
采集的样品先用自来水冲洗掉植物表面的泥土，然后按照Ｑｉｎ等［１２］的方法进行植物表面消毒灭菌。将所有
采集植株的相同组织进行混合提取植物总ＤＮＡ，并作３次重复。植物组织总ＤＮＡ的提取采用ＰｌａｎｔＧｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡＫｉｔ试剂盒方法进行。提取ＤＮＡ后，置于－２０℃保存备用。
１．３　１６ＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增
ＰＣＲ扩增采用巢式ＰＣＲ对目标片段进行扩增。第１轮ＰＣＲ采用引物为Ｆ２４３和１３７８［１３］。反应体系（２０
μＬ）：Ｍｉｘ缓冲液１０μＬ，引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各０．５μＬ，模板ＤＮＡ１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足２０μＬ。第２轮ＰＣＲ所用引
物为９８４ＧＣ和１３７８。反应体系（５０μＬ）：Ｍｉｘ缓冲液２５μＬ，引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各０．５μＬ，模板为第１轮ＰＣＲ产
物１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足５０μＬ。两轮反应程序皆采用ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ程序，程序参照李小林等
［１４］。最后将ＰＣＲ
产物用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。
１．４　变性凝胶电泳
ＤＧＧＥ凝胶电泳采用ＢｉｏＲａｄＤｃｏｄｅ。取第２次ＰＣＲ产物１８μＬ，同时加入５μＬ溴酚蓝进行ＤＧＧＥ分析。
ＤＧＧＥ变性剂梯度范围为１０％～４０％，其变性方向与电泳方向一致。采用１×ＴＡＥ缓冲液，５０Ｖ３０ｍｉｎ进胶，
接着１６０Ｖ６０℃电泳５．５ｈ。电泳完毕后采用银染法（ＡｇＮＯ３）染色［１５］，最后用相机拍照保存。
１．５　ＰＣＲＤＧＧＥ图谱分析
对花苜蓿各组织样品ＤＧＧＥ图谱电泳条带采用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件（ＢｉｏＲａｄ）进行多样性分析。其中多样性
指数（犎）、丰度（犛）和均匀度（犈犎）等指标用来描述与比较花苜蓿各个组织样品的内生放线菌多样性［１６］。
犎＝－∑犘犻·ｌｎ犘犻
犈犎＝犎／犎ｍａｘ＝犎／ｌｎ犛
式中，犘犻是花苜蓿某个组织样品中单一条带的强度在该样品中所有条带强度的比率，犛是花苜蓿某个组织样品
中所有条带数目的总和。
１．６　ＤＧＧＥ条带测序与系统发育树构建
将ＤＧＧＥ条带中较特异的条带Ａ２、Ａ３、Ａ１２、Ａ１６、Ａ１８、Ａ２２和Ａ２３切割下后，用灭菌去离子水清洗３次，挑
取大小约１ｍｍ３ 的胶块作ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增［１７，１８］。ＰＣＲ扩增采用之前第２次ＰＣＲ用的引物，体系和程
序一样。ＰＣＲ产物需进行纯化，纯化采用ＵＮＩＱ１０ＤＮＡ纯化试剂盒（上海生工），然后将纯化的样品进行克隆，
该过程采用ｐＭＤＴＭ１９ＴＶｅｃｔｏｒ试剂盒（大连宝生物公司）。最后挑选克隆生长出的白色菌落进一步测序，由北
京六合华大基因科技股份有限公司完成。将所测序列通过ＢＬＡＳＴ程序在ＧｅｎＢａｎｋ找寻相似度较高的其他序
列，然后把２种来源的序列进行全序列比对，采用Ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ方法在 Ｍｅｇａ５．０中构建系统发育树［１９］。将
测序得到的序列提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库，登录号为ＫＣ２０６０４２ＫＣ２０６０４８。
１．７　数据处理
实验数据采用Ｅｘｃｅｌ２００３与ＳＰＳＳ１３．０统计软件处理。
２　结果与分析
２．１　放线菌ＤＧＧＥ图谱分析
通过变性梯度凝胶电泳之后，花苜蓿的根茎叶花样品都分离出一定数量的电泳条带（图１）。但明显可以看
出，各个泳道条带数量有所不同，并且各条带的强度和迁移率也存在差异，这在一定程度上体现了其内生放线菌
的多样性。对根茎叶花ＤＧＧＥ条带进行比较可以发现，花组织的条带最为复杂；叶部的条带最为单一；而根部的
条带亮度最大，且数量也较多。表明同一种植物不同的部位其内生放线菌多样性存在明显的差异，且不同部位内
４１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
生放线菌的丰富度也有一定的区别。
图１　花苜蓿内生放线菌犇犌犌犈图谱
犉犻犵．１　犃犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犪犮狋犻狀狅犫犪犮狋犲狉犻犪犾
犘犆犚犇犌犌犈犳狅狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犪犿狆犾犲狊
　　　花苜蓿根茎叶花各有３个平行处理；其中Ａ２，Ａ３，Ａ１２，Ａ１６，Ａ１８，
Ａ２２，Ａ２３为克隆条带。３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｆｏｒｅａｃｈｏｆｒｏｏｔ，ｓｔｅｍ，
ｌｅａｆａｎｄｆｌｏｗｅｒｏｆ犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪；Ａ２，Ａ３，Ａ１２，Ａ１６，Ａ１８，Ａ２２ａｎｄ
Ａ２３ｗｅｒｅｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｅｘｃｉｓｅｄｂａｎｄｓ．
２．２　ＤＧＧＥ条带多样性指数、丰度和均匀度分析
微生物群落的遗传多样性在一定程度上可以通过
ＤＧＧＥ条带的多少反映出来［２０］。根据ＤＧＧＥ图谱对
花苜蓿内生放线菌多样性指数（犎）、丰度（犛）和均匀度
（犈犎）进行了比较分析（表１），花苜蓿不同部位的内生
放线菌多样性指数、丰度以及均匀度在一定程度上都
存在差异。其中花苜蓿花组织内生放线菌多样性指数
与丰度皆为最高，达到了２．７４和１６，而多样性指数与
丰度最低的是花苜蓿的叶部，分别为２．３９和１１。值
得注意的是，均匀度最高的却是花苜蓿的叶部，而均匀
度最低的为花苜蓿花部，分别为０．９９８与０．９９４，刚好
出现与前两者指标相反的情况。综上可见，花苜蓿内
生放线菌多样性指数：花部＞根部＞茎部＞叶部。
２．３　克隆条带分析
由系统发育树显示（图２），大致可以将所有的序
列分为３个簇，其中Ａ２、Ａ３、Ａ１６和Ａ１８聚在第１个
簇，Ａ２２单独与其参比菌株成第２簇，而 Ａ１２与 Ａ２３
聚在第３个簇里。整个系统发育树的构成也表明花苜
蓿内生放线菌的序列存在一定的多样性。在第１个簇
里所聚集的全部为链霉菌属放线菌，其中除了目标序
列Ａ２、Ａ３、Ａ１６和 Ａ１８外，还存在一个不可培养的。
可见所有的目标序列中有超过５０％都为链霉菌属，这
也在一定程度上反映出链霉菌在整个放线菌中的普遍
分布。而在第２和第３簇里，放线菌种类就比较多样
化，包括诺卡尔菌、拟无枝酸菌等种属，还有５个不可
培养的菌株序列，相比第１簇菌种，第２、３簇几乎都为
稀有放线菌，所以可以断定 Ａ１２、Ａ２２与 Ａ２３也为潜
在的稀有放线菌。
从比对序列的同源性可以发现，Ａ１２与苛求拟无
枝酸菌（犃犿狔犮狅犾犪狋狅狆狊犻狊犳犪狊狋犻犱犻狅狊犪）菌株 ＮＲＲＬＢ
１６６９７（ＧＱ２００６０１）、黑暗异壁链霉菌（犛狋狉犲狆狋狅犪犾犾狅狋犲犻
犮犺狌狊狋犲狀犲犫狉犪狉犻狌狊）菌株 ＮＢＲＣ１６１７７（ＮＲ＿０４１１９９）同
源性仅为９５％，其他目标序列与其最近序列的同源性
分别都达到了９９％。值得提出的是，Ａ３与Ａ１６聚在
表１　植物组织中犇犌犌犈条带多样性指数、丰度和均匀度
犜犪犫犾犲１　犛犺犪狀狀狅狀狑犲犪狏犲狉犻狀犱犲狓（犎），犚犻犮犺狀犲狊狊（犛）犪狀犱
犈狏犲狀狀犲狊狊（犈犎）狅犳狋犲狊狋犲犱狆犾犪狀狋狊犪犿狆犾犲狊
样品
Ｓａｍｐｌｅｓ
多样性指数
Ｓｈａｎｎｏｎｗｅａｖｅｒｉｎｄｅｘ
丰度
Ｒｉｃｈｎｅｓｓ
均匀度
Ｅｖｅｎｎｅｓｓ
根Ｒｏｏｔ ２．６３±０．１２ａ １４±２ａｂ ０．９９７±０．０００ａ
茎Ｓｔｅｍ ２．５６±０．００ａｂ １３±０ａｂ ０．９９７±０．００１ａ
叶Ｌｅａｆ ２．３９±０．０９ｂ １１±１ｂ ０．９９８±０．０００ａ
花Ｆｌｏｗｅｒ ２．７４±０．２０ａ １６±３ａ ０．９９４±０．００２ｂ
了一起，可见２株菌的亲缘关系很近。结合ＤＧＧＥ图谱可以发现，Ａ３和Ａ１６的迁移率差别很大，但属于较近的
种属，所以菌种的亲缘关系与其在ＤＧＧＥ图谱中表现的迁移率并没有必然联系。
将所测序列的条带与条带迁移位置进行对应后（表２），可以发现，Ａ１２与Ａ２３分别在位置６与位置４，相隔
较近，并且２种菌在根茎叶花中都有分布。Ａ１６与Ａ２３分别在位置３、４，仅相差一个距离单位，但是从系统发育
分析中可以发现，２种菌属于不同的属，并且Ａ１６仅仅在叶部和花部有分布，可见ＤＧＧＥ图谱中条带的迁移位置
相近并不能代表相对应的菌株存在相似性。同样，Ａ１８与Ａ２２分别处于位置２４与位置２２，但Ａ１８属于链霉菌
属，而Ａ２２则不是，并且Ａ１８仅仅在花部有分布，Ａ２２同时分布于花部与根部。
５１１第２２卷第５期 草业学报２０１３年
图２　部分花苜蓿内生放线菌犇犌犌犈条带系统发育分析
犉犻犵．２　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳１６犛狉犚犖犃犵犲狀犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犪犮狋犻狀狅犿狔犮犲狋犲狊犻狀犕．狉狌狋犺犲狀犻犮犪犳狉狅犿犇犌犌犈犫犪狀犱狊
　
３　讨论
通过ＤＧＧＥ图谱分析发现，无论是多样性指数还
是丰度，花部都是最大的。也就是说花苜蓿的花组织
中内生放线菌的多样性是最丰富的，其数量与种类都
存在绝对的优势。有报告显示，植物地上部内生放线
菌多于地下部分［２１２４］，而赵珂等［２２］的研究却发现野生
药用植物根部的内生放线菌多于其他部位。结果的不
同往往是由于分离方法与培养条件等的差异。花苜蓿
为一种药用植物，蕴含着一些特殊的活性物质，其根茎
叶花各器官的内生环境也存在一定的差异［２５］。花苜
蓿的花器官能提供给放线菌最适宜的生长条件可能是
表２　基于犙狌犪狀狋犻狋狔犗狀犲的犇犌犌犈数字图谱
犜犪犫犾犲２　犖狌犿犲狉犻犮犪犾犫犪狀犱狅犳犇犌犌犈犫犪狊犲犱狅狀犙狌犪狀狋犻狋狔犗狀犲
条带类型
Ｂａｎｄｔｙｐｅ
克隆条带
Ｃｌｏｎｅｂａｎｄ
根
Ｒｏｏｔ
茎
Ｓｔｅｍ
叶
Ｌｅａｆ
花
Ｆｌｏｗｅｒ
条带类型３Ｂａｎｄｔｙｐｅ３ Ａ１６ ０ ０ １ １
条带类型４Ｂａｎｄｔｙｐｅ４ Ａ２３ １ １ １ １
条带类型６Ｂａｎｄｔｙｐｅ６ Ａ１２ １ １ １ １
条带类型１０Ｂａｎｄｔｙｐｅ１０ Ａ２ １ １ １ ０
条带类型１４Ｂａｎｄｔｙｐｅ１４ Ａ３ １ １ ０ １
条带类型２２Ｂａｎｄｔｙｐｅ２２ Ａ２２ １ ０ ０ １
条带类型２４Ｂａｎｄｔｙｐｅ２４ Ａ１８ ０ ０ ０ １
６１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
该部位内生放线菌最丰富的主要原因。从生理构造来看，花组织比根茎叶细胞壁薄，更容易被破坏，以致外界的
微生物易于浸入到其内部［２６］。
ＤＧＧＥ图谱中，花苜蓿茎叶花的泳道有相同的长度，明显大于根部泳道的长度。泳道的长短也能反映出微
生物种类结构的情况，花苜蓿根部ＤＧＧＥ泳道较短，必然在缺失的泳道少出茎叶花所存在的一些微生物。从植
物生理结构来看，根茎叶花是一个整体，它们之间存在着物质交流，这种交流可能是根茎叶花自下而上的传导，或
者是花叶茎根从上到下的流动。关于物质传递的报告很多［２５］，花苜蓿２种传递方式都可以通过一定的模型进行
解释［２６］。某些微生物在花苜蓿体内自上而下传导时，由于茎到根传导过程中出现了某种障碍，此类微生物滞留
于茎部，所以根部就不存在这类微生物。又或许，某种微生物同时存在于花苜蓿的根茎叶花中，但根部的此类微
生物由于嗜好根际或者根际以外的生长环境，游离出根部，导致根部不存在这种微生物。
由克隆结果表明，尽管大部分的代表克隆为链霉菌属，但仍有超过４３％的克隆属于稀有放线菌。Ａ１２与
Ａ２３属于稀有放线菌，并且同时存在于花苜蓿根茎叶花，可见花苜蓿植株中存在着大量的稀有放线菌资源。从条
带迁移位置与菌株亲缘关系来看，Ａ１６与Ａ２３分别在条带位置３与４，仅相差一个单位，但从系统发育树可以看
出，２种菌属于不同的属。所以２种菌的亲缘关系并不能以ＤＧＧＥ条带上其距离的多少进行判定，而要根据测序
的结果，并构建系统发育树，观察其在系统发育树上的位置来进行判定。
４　结论
综上所述，本研究就采自四川省甘孜州的药用植物花苜蓿，分别提取根茎叶花的总ＤＮＡ，进行变性梯度凝胶
电泳。分析结果发现花苜蓿各器官内生放线菌的群落结构和多样性存在一定的差异，其中花部的多样性指数与
丰度均是最高的，这与花器官特殊的内生环境及生理构造密切相关。回收的ＤＧＧＥ条带通过测序比对可见，目
标序列虽然大部分属于链霉菌属，但仍有超过４３％的为稀有放线菌，且主条带Ａ１２与Ａ２３皆属于稀有放线菌。
花苜蓿作为甘孜一种普遍的药用植物，其内部的放线菌存在明显的多样性，同时存在可观的稀有放线菌资源，所
以可将其作为一种较理想的分离内生放线菌的植物资源。
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８１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５
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ｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狉狌狋犺犲狀犻犮犪；ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ；ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ；ＤＧＧＥ
９１１第２２卷第５期 草业学报２０１３年