全 文 ：珍稀泌盐植物长叶红砂两个 犠犚犓犢
转录因子的克隆及表达分析
王佳１，郑琳琳１，顾天培１，王学峰２，王迎春１
（１．内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特０１００２１；２．内蒙古和信园蒙草抗旱绿化股份有限公司，内蒙古 呼和浩特０１００２１）
摘要：根据长叶红砂转录组数据信息，选取在盐胁迫处理后表达上调明显且注释结果为 ＷＲＫＹ转录因子的两个
ｃＤＮＡ片段。通过ｃＤＮＡ末端快速扩增技术（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ），从长叶红砂中克隆获得２
个犠犚犓犢 基因。在ＮＣＢＩ数据库比对与拟南芥犃狋犠犚犓犢３３同源性分别为７９％和８７％，因此命名为犚狋犠犚犓犢３３１
和犚狋犠犚犓犢３３２。其中犚狋犠犚犓犢３３１的ｃＤＮＡ全长２１６３ｂｐ，开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）长度为１６８１
ｂｐ，编码５７３个氨基酸；犚狋犠犚犓犢３３２的ｃＤＮＡ全长２１５５ｂｐ，开放阅读框长度为１７７６ｂｐ，编码５９１个氨基酸。氨
基酸序列分析表明这两个基因均具有两个 ＷＲＫＹ结构域，属于典型的Ｉ类 ＷＲＫＹ转录因子。蛋白结构预测分析
发现，两个蛋白的一级结构和二级结构在 ＷＲＫＹ结构域的氨基酸序列和结构特性的相似性较高，但是在非保守结
构域部分，尤其是Ｎ末端（１～８０ａａ之间）、第１个 ＷＲＫＹ结构域之前（１９０～２４０ａａ之间）和两个 ＷＲＫＹ结构域之
间（４３０～４５０ａａ之间）等位置的差异明显，可能对两个基因功能有一定影响。半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析表明，４种非
生物胁迫均能诱导这两个基因的表达，但是盐、冷和ＡＢＡ对犚狋犠犚犓犢３３２诱导尤为明显，同时犚狋犠犚犓犢３３２对干
旱胁迫的响应更快，因此这两个基因在长叶红砂抵御非生物胁迫的应答反应中发挥的作用可能不同。本研究为深
入探索 ＷＲＫＹ３３转录因子在长叶红砂中的作用机制奠定了基础。
关键词：长叶红砂；ＷＲＫＹ转录因子；克隆；表达分析
中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０４０１２２０８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０４１５
植物在生长发育过程中时刻遭受着各种生物和非生物胁迫，如病虫害、盐碱、干旱、低温等。为了适应复杂多
变的环境，植物自身形成了一套复杂的胁迫应答机制，使其能够在不同环境中正常生长［１３］。基于分子水平的胁
迫应答信号转导在这一过程中起到了至关重要的作用，其中 ＷＲＫＹ蛋白作为植物特有的转录因子超家族，具有
瞬时性、多效性，广泛参与多种生物或非生物胁迫反应［４］，对探索植物的抗逆性具有重要价值［５］。
ＷＲＫＹ蛋白由于其Ｎ端高度保守的 ＷＲＫＹＧＱＫ氨基酸序列及其特殊的锌指结构而命名，根据 ＷＲＫＹ结
构域的数量和锌指结构的不同，可将 ＷＲＫＹ转录因子分为三大类：Ｉ类通常含有２个 ＷＲＫＹ结构域；ＩＩ类含有１
个 ＷＲＫＹ结构域，锌指结构为Ｃｘ４５Ｃｘ２２２３ＨｘＨ型；ＩＩＩ类含有１个 ＷＲＫＹ结构域，锌指结构为Ｃｘ７Ｃｘ２３ＨｘＣ
型［６］。ＷＲＫＹ转录因子首先在甘薯（犐狆狅犿狅犲犪犫犪狋犪狋犪狊）中发现，随后在野生燕麦（犃狏犲狀犪狊犪狋犻狏犪）、皱叶欧芹
（犘犲狋狉狅狊犲犾犻狀狌犿犮狉犻狊狆狌犿）、拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）等植物中得到克隆和鉴定［７１０］。目前犠犚犓犢 转录因子
家族成员在拟南芥、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、毛果杨（犘狅狆狌犾狌狊狋狉犻犮犺狅犮犪狉狆犪）等［１１１３］植物中的成员数分别为７４，１０２，
１０４个。植物体内的 ＷＲＫＹ转录因子在植物生长发育及对外界环境的适应中发挥了重要的调控作用［１４］。Ｄｏｎｇ
等［１５］采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ方法，发现拟南芥４９个 ＷＲＫＹ转录因子的表达与多种环境因素（低温、干旱、植物
激素、机械损伤、病原体）有关。仇玉萍等［１６］从４℃胁迫的水稻植株ｃＤＮＡ文库中获得了１３个犠犚犓犢 基因全
长，其中１０个基因的表达受到ＮａＣｌ、ＰＥＧ（聚乙二醇，ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、低温（４℃）和高温（４２℃）等非生物逆
境因子的胁迫影响。Ｘｉｅ等［１７］用外源激素ＡＢＡ（脱落酸，ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ）和ＧＡ（赤霉素，ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｎ）处理水稻叶片
１２２－１２９
２０１４年８月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２３卷 第４期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
收稿日期：２０１３０８１９；改回日期：２０１３０９１１
基金项目：国家自然科学基金项目（３１３６００６３），内蒙古自然科学基金重大项目（２０１２ＺＤ０５）和内蒙古自治区高等学校创新团队发展计划
（ＮＭＧＩＲＴ１４０１）资助。
作者简介：王佳（１９８５），男，河北衡水人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｗｗｗｍｏｋｃｏｍ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｃｗａｎｇ＠ｉｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
发现犗狊犠犚犓犢７１的表达量显著升高。目前对 ＷＲＫＹ转录因子的相关研究主要集中在拟南芥等模式植物中，而
自然界中许多野生植物在抵抗各种生物和非生物胁迫的表现更为突出，因此加强对野生植物资源的相关研究，获
得优质抗性基因具有非常重要的意义。
长叶红砂（犚犲犪狌犿狌狉犻犪狋狉犻犵狔狀犪），属于柽柳科（Ｔａｍａｒｉｃａｃｅａｅ）琵琶柴属（犚犲犪狌犿狌狉犻犪），又名黄花红砂、黄花琵
琶柴，起源于第三纪，为古地中海孑遗植物，所以被称为“活化石”，被列为内蒙古自治区重点保护植物，是荒漠草
原和干草原地区的重要生态屏障和良好草场［１８］。石蜡切片和扫描电镜观察发现，长叶红砂叶和幼茎上均布有盐
腺，其盐腺结构对于适应盐渍环境具有重要作用［１９］。同时发现其气孔下陷，具有孔下室，体积较盐腺小；其保卫
细胞细胞壁明显加厚，可有效抑制叶片水分的蒸发；表皮内栅栏组织发达，海绵组织退化，中央维管束周围具有大
型储水细胞［２０］，因此长叶红砂对盐碱和干旱等极端环境具有极强的适应性，开展长叶红砂 ＷＲＫＹ３３转录因子作
用机制研究，将为进一步探索该植物抗逆分子调控机制奠定基础。本实验室利用Ｉｌｕｍｉｎａ测序技术对正常生长
和盐胁迫的长叶红砂进行转录组测序［２１］，获得了该植物的大量遗传信息，通过数据分析发现６４６９４条Ｕｎｉｇｅｎｅｓ
在盐胁迫后的表达量发生了变化，其中６７条Ｕｎｉｇｅｎｅ片段属于 ＷＲＫＹ转录因子家族。本研究选取两个注释为
ＷＲＫＹ转录因子且在盐处理后表达上调明显的两个基因片段（Ｕｎｉｇｅｎｅ３０４０８和Ｕｎｉｇｅｎｅ１４０８１），采用ＲＡＣＥ技
术克隆获得了这两个 ＷＲＫＹ转录因子的全长序列，并利用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术研究了其表达特性。
１ 材料与方法
１．１ 材料
本实验所用长叶红砂种子于２００９年９月采自中国内蒙古自治区东阿拉善－西鄂尔多斯地区（１０６°２７′～
１１１°２８′Ｅ，３９°１３′～４０°５２′Ｎ，海拔１５００～２１００ｍ），种子采回后于室外晾干，室温下贮藏备用。
ＲＮＡ提取试剂盒（ＰｌａｎｔＰｌｕｓＲＮＡＲｅｇｅｎｔ）购自北京天根生化科技有限公司；ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＤＮａｓｅＩ、
ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｐＭＤ１９Ｔ载体及ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自ＴａＫａＲａ公司；大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，购自北京全式
金生物技术有限公司；反转录试剂盒为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＭＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＫｉｔ；ｃＤＮＡ全长扩增使
用Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ；ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自Ａｘｙｇｅｎ公司；其他试
剂均为进口分装或国产分析纯。ＰＣＲ引物合成及测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
１．２ 方法
１．２．１ 植物培养和胁迫处理 挑选籽粒饱满的长叶红砂种子，１０％次氯酸钠浸泡１５ｍｉｎ，灭菌水冲洗３～５遍，
播种于装有３０ｍＬＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）培养基的１５０ｍＬ三角瓶中。暗培养３ｄ后，置于２５℃、湿度
７０％、１６ｈ／８ｈ光照／黑暗的条件下培养。待幼苗生长至１０ｃｍ左右，将其转移至约装有３０ｍＬ１／２Ｈｏａｇｌａｎｄ营
养液的大试管中，在相同条件下继续培养，期间每隔３ｄ更换一次营养液。
待幼苗长至２０ｃｍ左右时选取长势一致的幼苗，分别用３０％ＰＥＧ６０００、１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、１０μｍｏｌ／ＬＡＢＡ
及４℃处理０，１，３，６，１２和２４ｈ，植物材料采集后用液氮速冻，存于－８０℃备用。
１．２．２ ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ合成 长叶红砂总ＲＮＡ的提取参照天根ＰｌａｎｔＰｌｕｓＲＮＡＲｅａｇｅｎｔ说明书进行。所
提总ＲＮＡ在３７℃下用ＲＮａｓｅｆｒｅｅＤＮａｓｅＩ处理１ｈ去除残余ＤＮＡ。用Ｎａｎｏｖｕｅｐｌｕｓ微量紫外分光光度计检
测其浓度和质量，１％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
ＲＡＣＥ所用ｃＤＮＡ合成参照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ说明书进行；半定
量ｃＤＮＡ合成参照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的 ＭＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＫｉｔ说明书进行。
１．２．３ 长叶红砂两个 ＷＲＫＹ基因全长ｃＤＮＡ序列的扩增 根据长叶红砂高通量测序结果功能注释为 ＷＲＫＹ
转录因子（Ｕｎｉｇｅｎｅ３０４０８和 Ｕｎｉｇｅｎｅ１４０８１）的ＤＮＡ序列，参照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ试剂盒要求设计ＲＡＣＥ引物（表１）。以长叶红砂ｃＤＮＡ为模板，结合试剂盒内提供的锚定引物进行
目的基因３′和５′末端的扩增。第一轮ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，包含２ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋、１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、锚定
引物１０ｘＵＰＭ（试剂盒提供）２．５μｍｏｌ／Ｌ、特异性引物ＧＳＰ５或ＧＳＰ３０．５μｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．０Ｕ，模板
ｃＤＮＡ２０ｎｇ。ＰＣＲ扩增程序为９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，循环５次；９４℃变性３０ｓ，
３２１第２３卷第４期 草业学报２０１４年
７０℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，循环５次；９４℃变性
３０ｓ，６８℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，循环２５次，
７２℃延伸１０ｍｉｎ。选取第一轮ＰＣＲ产物分别稀释
１０，５０，１００倍，以１μＬ为模板，引物使用巢式引物
ＮＧＳＰ５或ＮＧＳＰ３，进行巢式ＰＣＲ，ＰＣＲ体系和条
件同上。巢式ＰＣＲ产物经切胶回收、连接至ＰＭＤ
１９Ｔ载体，转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，鉴定后
进行测序。测序结果用ｖｅｃｔｏｒＮＴＩ１１．５软件拼接
在一起，得到基因全长ｃＤＮＡ序列。
１．２．４ 犚狋犠犚犓犢３３１和犚狋犠犚犓犢３３２基因的生
物信息学分析 利用ＮＣＢＩ的ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）识别开
放阅读框序列并翻译推测出氨基酸序列；利用Ｅｘ
ＰＡＳｙ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）的Ｐｒｏｔ
Ｐａｒａｍ软件分析蛋白的理论分子量和等电点，利用
ＳＯＰＭＡ软件对蛋白质二级结构进行预测［２２］；蛋白
序列比对用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件执行；系统进化树用
表１ 实验所用的引物列表
犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狑犪狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′－３′）
Ｗ３３１ＧＳＰ５ ＧＣＣＣＧＣＴＣＧＡＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＡＣＣＧ
Ｗ３３１ＧＳＰ３ ＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＡＣ
Ｗ３３１ＮＧＳＰ５ ＣＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣ
Ｗ３３１ＮＧＳＰ３ ＣＴＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧ
Ｗ３３２ＧＳＰ５ ＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＴＴＣＣＡＴＧＴＣ
Ｗ３３２ＧＳＰ３ ＧＧＡＡＡＣＧＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＧ
Ｗ３３２ＮＧＳＰ５ ＣＣＡＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＣ
Ｗ３３２ＮＧＳＰ３ ＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧ
Ｗ３３１Ｆ ＧＧＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＧＴＣＣＡＴＣＣ
Ｗ３３１Ｒ ＴＣＴＧＴＴＡＧＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＧ
Ｗ３３２Ｆ ＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＴＡＣＡＧＧＧＡＧＣ
Ｗ３３２Ｒ ＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡＣＧＧＡＣＴＡＡＡＡＧＧ
ＡｃｔｉｎＦ ＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＧＧＴＡＴＧＡＣ
ＡｃｔｉｎＲ ＧＡＧＡＡＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＴＧＣＡＴＣＧＡ
ＭＥＧＡ５．０５软件，邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＪ法）绘制系统进化树。
１．２．５ 半定量ＲＴ－ＰＣＲ表达分析 根据两个基因的编码序列和长叶红砂β犪犮狋犻狀序列信息设计用于半定量
ＲＴ－ＰＣＲ分析的特异引物及内参基因引物（表１）。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，内含２ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋、２００μｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰｓ、引物各１．０μｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．０Ｕ，２０ｎｇ模板ｃＤＮＡ。ＰＣＲ反应程序为９４℃预变性１ｍｉｎ，
９４℃变性２０ｓ、５５℃退火３０ｓ、７２℃延伸３０ｓ，２８个循环，ＰＣＲ产物用１％琼脂糖凝胶电泳分离观察。重复３次，
通过比较目的条带的亮度以判定基因表达的强弱。
２ 结果与分析
２．１ 基因全长的克隆
根据长叶红砂录组数据中两个功能注释为 ＷＲＫＹ转录因子的基因序列（Ｕｎｉｇｅｎｅ３０４０８和 Ｕｎｉｇｅｎｅ１４０８１）
设计引物，利用ＲＡＣＥ技术分别获得两个基因的３′和５′末端（图１），利用ｖｅｃｔｏｒＮＴＩ１１．５软件将测序结果拼接
图１ 犚犃犆犈－犘犆犚产物凝胶电泳图
犉犻犵．１ 犘狉狅犱狌犮狋狊狅犳犚犃犆犈－犘犆犚
Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；Ｌ１：犚狋犠犚犓犢３３１５′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ结果；Ｌ２：犚狋犠犚犓犢３３１３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ结果；Ｌ３：犚狋犠犚犓犢３３２５′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ结果；Ｌ４：
犚狋犠犚犓犢３３２３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ结果。Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；Ｌ１：Ａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｏｆ犚狋犠犚犓犢３３１５′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ；Ｌ２：Ａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｏｆ犚狋
犠犚犓犢３３１３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ；Ｌ３：Ａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｏｆ犚狋犠犚犓犢３３２５′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ；Ｌ４：Ａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｏｆ犚狋犠犚犓犢３３２３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ．
４２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
获得两个分别为２１６３和２１４５ｂｐ的全长ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号分别为 ＫＦ４２１１５８和 ＫＦ４２１１５９），通过
ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ软件预测开放阅读框分别为１６８１和１７７６ｂｐ，分别编码５７３和５９１个氨基酸，在ＮＣＢＩ数据库中比对
发现这两个基因与拟南芥 犃狋犠犚犓犢３３的同源相似度分别为７９％和８７％，因此将这两个基因命名为犚狋
犠犚犓犢３３１和犚狋犠犚犓犢３３２。
２．２ 犚狋犠犚犓犢３３１和犚狋犠犚犓犢３３２的生物信息学分析
氨基酸序列分析显示，这两个基因均具有两个典型的 ＷＲＫＹＧＱＫ保守结构域，属于Ｉ类 ＷＲＫＹ转录因子
（图２）。其中ＲｔＷＲＫＹ３３１蛋白相对分子量６２．８５ｋＤａ，等电点为５．５１。
图２ １０种植物 犠犚犓犢３３氨基酸比对
犉犻犵．２ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犠犚犓犢３３犻狀狋犲狀狆犾犪狀狋狊
ＡｔＷＲＫＹ３３：拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪（ＡＡＭ３４７３６）；ＡｌＷＲＫＹ３３：琴叶拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊犾狔狉犪狋犪（ＸＰ００２８７９７４８）；ＧｍＷＲＫＹ３３：大豆犌犾狔
犮犻狀犲犿犪狓（ＸＰ００３５４４９０８）；ＦｖＷＲＫＹ３３：野草莓犉狉犪犵犪狉犻犪狏犲狊犮犪（ＸＰ００４２９４７５８）；ＣｓＷＲＫＹ３３：黄瓜犆狌犮狀犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊（ＸＰ００４１３７３６８）；ＢｎＷＲＫＹ３３：欧
洲油菜犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊（ＡＣＩ１４３９７）；ＶｖＷＲＫＹ３３：葡萄犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪（ＸＰ００２２７２０４０）；ＴｕＷＲＫＹ３３：乌拉尔图小麦犜狉犻狋犻犮狌犿狌狉犪狉狋狌 （ＥＭＳ６４２３７）；
ＢｄＷＲＫＹ３３：二穗短柄草犅狉犪犮犺狔狆狅犱狌犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀（ＸＰ００３５７７４７８）。ＷＲＫＹ保守结构域用星号标出。ＷＲＫＹｄｏｍａｉｎｉｓｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄｂｙａｓｔｅｒｉｓｋ．
５２１第２３卷第４期 草业学报２０１４年
氨基酸比对分析表明同源性最高的为大豆（ＸＰ００３５４４９０８）、黄瓜（ＸＰ００４１３７３６８）和野草莓（ＸＰ００４２９４７５８），
同源性均为９７％；其次为拟南芥（ＡＡＭ３４７３６）和琴叶拟南芥（ＸＰ００２８７９７４８），同源性均为７９％，以及葡萄
（ＸＰ００２２７２０４０），同源性为７８％；同源性较低的为二穗短柄草（ＸＰ００３５７７４７８）和乌拉尔图小麦（ＥＭＳ６４２３７），分别
为６８％和５８％。
ＲｔＷＲＫＹ３３２蛋白相对分子量６５．１１ｋＤａ，等电点为６．４８。氨基酸比对分析表明，同源性最高的为欧洲油
菜（ＡＣＩ１４３９７），为９１％；其次为大豆（ＸＰ００３５４４９０８）、拟南芥（ＡＡＭ３４７３６）、野草莓（ＸＰ００４２９４７５８）、黄瓜
（ＸＰ００４１３７３６８）和琴叶拟南芥（ＸＰ００２８７９７４８），分别为８８％，８７％，８６％，８０％和７９％。
蛋白二级结构预测结果表明，ＲｔＷＲＫＹ３３１蛋白（图３Ａ）的５７３个氨基酸中，４７３个为随机卷曲，占７６．２７％；
６６个为α螺旋，占１１．５２％；５７个为延伸链，占９．９５％；１３个为β转角，占２．２７％。ＲｔＷＲＫＹ３３２蛋白（图３Ｂ）的
５９１个氨基酸中，４２９个为随机卷曲，占７２．５９％；７３个为α螺旋，占１２．３５％；６５个为延伸链，占１１％；２４个为β
转角，占４．０６％。
对这两个基因编码蛋白的二级结构比对可以发现其保守结构域随机卷曲、α螺旋、β转角和延伸链的构成差
异不大。然而在Ｎ末端（１～８０ａａ之间）两个蛋白中延伸链的数目相差虽然不大，出现位置却存在很大差异，同
时α螺旋和β转角的数目和位置差异明显；第１个 ＷＲＫＹ结构域之前（１９０～２４０ａａ之间）ＲｔＷＲＫＹ３３１的随机
卷曲中夹杂着７个α螺旋，而 ＲｔＷＲＫＹ３３２ 中没有；在两个 ＷＲＫＹ 结构域之间（４３０～４５０ａａ之间）Ｒｔ
ＷＲＫＹ３３１有３个延伸链，而ＲｔＷＲＫＹ３３２中全部为随机卷曲。
系统进化树分析显示（图４），长叶红砂的两个 ＷＲＫＹ３３转录因子与十字花科的琴叶拟南芥、拟南芥、荠菜和
欧洲油菜亲缘关系较近，与葫芦科的黄瓜、葡萄科的葡萄、蔷薇科的野草莓及豆科的大豆亲缘关系次之，与禾本科
的单子叶植物二穗短柄草、节节麦和乌拉尔图小麦亲缘关系较远。
图３ 犚狋犠犚犓犢３３蛋白质二级结构预测
犉犻犵．３ 犘狉犲犱犻犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲狊犲犮狅狀犱犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犚狋犠犚犓犢３３
紫色表示随机卷曲；蓝色表示α螺旋；红色表示延伸链；绿色表示β转角。Ｔｈｅｒａｎｄｏｍｓｔａｔｅｓ，αｈｅｌｉｘ，ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄａｎｄβｔｕｒｎｗｅｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄ
ｗｉｔｈｐｕｒｐｌｅ，ｂｌｕｅ，ｒｅｄａｎｄｇｒｅｅｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图４ １２种植物 犠犚犓犢３３氨基酸系统进化树
犉犻犵．４ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犫犪狊犲犱狅狀犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犠犚犓犢３３犳狉狅犿狋犲狀狆犾犪狀狋狊
分支上的数值代表自展支持率。Ｎｕｍｅｒｉｃｄａｔａｏｎｔｈｅｂｒａｎｃｈｒｅｐｒｅｓｅｎｔｂｏｏｔｓｔｒａｐｖａｌｕｅ．
６２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
２．３ 犚狋犠犚犓犢３３１和犚狋犠犚犓犢３３２基因的表达特性分析
通过半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术对两个基因进行表达分析发现，这两个基因均受盐（ＮａＣｌ）、冷（４℃）、干旱（ＰＥＧ）
和ＡＢＡ四种非生物胁迫的诱导（图５）。犚狋犠犚犓犢３３１在盐和冷胁迫下的表达趋势基本一致（图５Ａ），处理１ｈ
后开始表达，３和６ｈ基本不表达，在１２和２４ｈ后表达量又升高，但低温处理１２ｈ后对其诱导更明显；在干旱胁
迫下均有上调表达，呈现先升高后降低的趋势，在６ｈ时表达量最高；在添加外源激素ＡＢＡ的情况下均有表达，
其表达呈现出先升高后降低然后又升高的趋势。
犚狋犠犚犓犢３３２在盐、冷胁迫下均有明显上调表达（图５Ｂ），其表达呈现先升高后降低然后又升高的趋势，在６
ｈ表达量最低；干旱胁迫下持续表达，在１ｈ表达最高，其后表达基本不变；施加外源激素ＡＢＡ对其诱导明显，开
始１～１２ｈ阶段表达量均比较高，但在２４ｈ后表达量迅速下降，基本不表达。
通过对比两个基因之间的表达趋势分析发现，在盐和冷胁迫下犚狋犠犚犓犢３３２基因持续表达且上调明显而
犚狋犠犚犓犢３３１在３和６ｈ基本不表达，因此盐和冷对犚狋犠犚犓犢３３２的诱导更明显；在干旱胁迫下两个基因均持
续表达，但犚狋犠犚犓犢３３１在６ｈ表达量最高，而犚狋犠犚犓犢３３２在１ｈ表达量最高；在施加外源激素ＡＢＡ的条件
下表达趋势差异明显，犚狋犠犚犓犢３３２处理２４ｈ后基本不表达，而犚狋犠犚犓犢３３１表达量虽然比较低，但是一直持
续表达。
图５ 犚狋犠犚犓犢３３基因在不同胁迫处理下的表达分析
犉犻犵．５ 犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犚狋犠犚犓犢３３犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狋狉犲狊狊
Ａ：犚狋犠犚犓犢３３１在不同胁迫下的表达情况；Ｂ：犚狋犠犚犓犢３３２在不同胁迫下的表达情况。Ａ：Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ犚狋犠犚犓犢３３１ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｓｔｒｅｓｓ；Ｂ：Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ犚狋犠犚犓犢３３２ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒｅｓｓ．
３ 讨论
植物体内的 ＷＲＫＹ转录因子参与多种生理生化反应，在高盐、低温、干旱等非生物胁迫及ＡＢＡ响应信号转
导通路中有重要作用［２３２４］。付乾堂和余迪求［２５］采用 Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ的方法，发现拟南芥 ＡｔＷＲＫＹ２５、Ａｔ
ＷＲＫＹ２６和ＡｔＷＲＫＹ３３转录因子受多种非生物胁迫因素的影响，其中低温和高盐对这３个转录因子的诱导尤
为明 显。Ｊｉａｎｇ 和 Ｄｅｙｈｏｌｏｓ［２６］对 ＮａＣｌ胁 迫 下 的 拟 南 芥 研 究 发 现 单 突 变 体 犠犚犓犢３３ 和 双 突 变 体
犠犚犓犢２５犠犚犓犢３３能够提高植株对ＮａＣｌ的抗性。Ｌｉ等［２７］对犠犚犓犢２５、犠犚犓犢２６和犠犚犓犢３３的拟南芥突变
体和过表达拟南芥植株在高温胁迫下的研究发现，这３个转录因子在受乙烯激活的和热激蛋白相关的信号通路
中协同调节拟南芥对高温的胁迫应答。因此 ＷＲＫＹ３３转录因子在拟南芥抵御非生物胁迫反应中发挥了重要作
用。本研究中克隆到的长叶红砂两个 ＷＲＫＹ３３转录因子在４种非生物胁迫下均被诱导表达，但是盐、冷和ＡＢＡ
对犚狋犠犚犓犢３３２诱导尤为明显，同时犚狋犠犚犓犢３３２对干旱胁迫的响应更快，因此这两个基因在长叶红砂抵御非
生物胁迫的应答反应中发挥的作用可能不同。
蛋白质的一级结构中氨基酸的序列决定了高级结构，高级结构决定了蛋白质的功能，而其中的随机卷曲经常
构成蛋白质活性部位和特异功能部位［２８］。植物中的谷胱甘肽转移酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）是一类具
有多种生理功能的蛋白质超家族，三维结构比较显示，虽然所有植物的ＧＳＴ比较保守［２９］，但是在主要负责结合
特异性底物的Ｃ末端结构域有较大变异，不同的ＧＳＴ能结合特定底物而发挥不同的生理功能［３０］。通过生物信
７２１第２３卷第４期 草业学报２０１４年
息学分析我们发现犚狋犠犚犓犢３３１与犚狋犠犚犓犢３３２的一级结构和二级结构在 ＷＲＫＹ结构域的氨基酸序列和结
构特性的相似性较高，但是在非保守结构域部分，尤其是 Ｎ末端（１～８０ａａ之间）、第１个 ＷＲＫＹ结构域之前
（１９０～２４０ａａ之间）和两个ＷＲＫＹ结构域之间（４３０～４５０ａａ之间）等位置的差异明显，可能对两个基因功能有一
定影响。这种差异是否会引起蛋白活性部位的空间结构发生变化，从而使结合底物的特异性发生改变，还需要进
一步的理论分析和实验验证。
本研究克隆了长叶红砂中两个 ＷＲＫＹ３３转录因子，并对其进行了生物信息学分析与逆境胁迫下表达模式
的初步探索，为长叶红砂中研究 ＷＲＫＹ３３转录因子的功能和响应逆境应答的调控机制奠定了基础。后续我们
将对这两个基因的拷贝数进行研究，并构建植物表达载体，导入模式植物拟南芥，探索其在转基因植株中的功能
差异，为将来应用泌盐植物长叶红砂的 ＷＲＫＹ３３基因提高作物及牧草抗性提供参考。
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犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋狑狅犠犚犓犢狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀犳犪犮狋狅狉狊
犳狉狅犿狋犺犲狉犪狉犲狉犲犮狉犲狋狅犺犪犾狅狆犺狔狋犲犚犲犪狌犿狌狉犻犪狋狉犻犵狔狀犪
ＷＡＮＧＪｉａ１，ＺＨＥＮＧＬｉｎｌｉｎ１，ＧＵＴｉａｎｐｅｉ１，ＷＡＮＧＸｕｅｆｅｎｇ２，ＷＡＮＧＹｉｎｇｃｈｕｎ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａａｎｄ
ＭｏｎｓｏｄＤｒｏｕｇｈｔＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＧｒｅｅｎｉｎｇＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＬｉｍｉｔｅｄ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：犚犲犪狌犿狌狉犻犪狋狉犻犵狔狀犪ｉｓａｎｅｎｄａｎｇｅｒｅｄｓｍａｌｓｈｒｕｂｔｈｒｉｖｉｎｇｉｎｖａｓｔａｒｉｄａｒｅａｓｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ．Ｔｈｉｓ
ｓｐｅｃｉｅｓｈａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｄｉｓｔｉｎｃｔｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｔｏａｄａｐｔｔｏｔｈｅｓｅｍｉｄｅｓｅｒｔｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｔｈｅ
ＷＲＫＹｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｒｅｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｗｈｉｃｈｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄｄｉｖｅｒｓｅｂｉｏｔｉｃａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｂａｓｅｄｏｎ犚．狋狉犻犵狔狀犪ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｄａｔａ，
ｔｗｏｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ａｎｎｏｔａｔｅｄａｓＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ）ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄａｆｔｅｒ
ｓａｌｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ．ＵｓｉｎｇｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ），ｔｈｅｓｅｔｗｏＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍ犚．狋狉犻犵狔狀犪．ＢｌａｓｔｅｄｉｎｔｈｅＮＣＢＩｄａｔａｂａｓｅ，ｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｔｏ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊犃狋犠犚犓犢３３
ｗｅｒｅ７９％ ａｎｄ８７％，ｓｏｔｈｅｙｗｅｒｅｎａｍｅｄ犚狋犠犚犓犢３３１ａｎｄ犚狋犠犚犓犢３３２ （ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ
ＫＦ４２１１５８ａｎｄＫＦ４２１１５９），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅ犚狋犠犚犓犢３３１ｗａｓ２１６３ｂｐａｎｄｉｎｃｌｕｄｅｄａ１６８１
ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｄ５７３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｏｆ犚狋犠犚犓犢３３２ｗａｓ２１５５ｂｐ
ａｎｄｉｎｃｌｕｄｅｄａ１７７６ｂｐＯＲＦｅｎｃｏｄｉｎｇ５９１ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｙｗｅｒｅ
ｔｙｐｉｃａｌｏｆｃｌａｓｓＩＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｉｍａｒｙ
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９２１第２３卷第４期 草业学报２０１４年