全 文 ：书金荞麦查尔酮合成酶基因犆犎犛的
克隆及序列分析
蒙华，李成磊，吴琦，邵继荣，陈惠
（四川农业大学生命科学与理学院，四川 雅安６２５０１４）
摘要：采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因（犆犎犛）的保守片段５５４ｂｐ，进一步采用染色体步移法
（ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ）和ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆到犆犎犛基因的全长ＤＮＡ序列和ｃＤＮＡ开放阅读框（ＯＲＦ）序列。序列分
析结果表明，金荞麦犆犎犛基因ＤＮＡ全长１６５０ｂｐ，含一个４６２ｂｐ的内含子；其ｃＤＮＡ编码区全长１１８８ｂｐ，编码
３９５个氨基酸，命名为犉犱犆犎犛，ＮＣＢＩ登录号为ＧＵ１６９４７０。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖犆犎犛的氨
基酸序列同源率分别达到９４％和９３％，且含有犆犎犛活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。
关键词：金荞麦；查尔酮合成酶基因；克隆；序列分析
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５１７．０３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１０）０３０１６２０８
金荞麦（犉犪犵狅狆狔狉狌犿犱犻犫狅狋狉狔狊），又称野荞麦、天荞麦，属双子叶蓼科荞麦属的多年生草本植物［１］。它是我国
民间传统的一种中草药，其块根能入药，具清热解毒，排脓消肿，祛风化湿的功效。现代医学研究发现，金荞麦块
根含有的一类原花色素苷的缩合性单宁混合物如表儿茶素，原矢车菊素Ｂ２等不仅能够抑制某些肿瘤细胞生
长［２］，还能祛痰抗炎、抑制血小板聚集，降低还原反应和增强巨噬细胞的吞噬［３］。
金荞麦作为栽培荞麦的野生近缘种，其子粒营养成分含量丰富，具有很高的营养价值。张政和林汝法［４］的研
究表明，金荞麦子粒高达１２．６％的蛋白质含量，已达到优质禾谷类粮食的标准，且微量元素、维生素的含量也很
高，生物类黄酮含量也在１．６％以上。金荞麦子粒中生物类黄酮主要为槲皮素、芦丁、莰菲、桑色素等，这些成分
对冠心病、心脑血管病、糖尿病均有良好治疗作用，所以金荞麦在保健食品开发方面也具有一定潜力。
查尔酮合成酶（ｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＨＳ）是植物次生代谢途径中黄酮类物质合成的关键酶［５］，它催化４香豆
酸ＣｏＡ和丙二酰ＣｏＡ反应，将３个丙二酰ＣｏＡ中的３个乙酸单位合成１个新的芳环，生成柚皮素查尔酮，为花
青甙类色素和植物黄酮类物质的合成提供了最基本的碳架结构［６］。而这些化合物不但为自然界提供了颜色，还
参与了植物的多种生理生化过程，如防ＵＶ辐射、抗胁迫、调节生长素运输、抗菌等。所以犆犎犛在植物黄酮类物
质合成途径中担当了重要的作用。目前，已在多种植物中克隆出犆犎犛，如非洲菊（犌犲狉犫犲狉犪犺狔犫狉犻犱犪）［７］、百合
（犔犻犾犻狌犿犫狉狅狑狀犻犻）［８］、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）［９］、甜橙（犆犻狋狉狌狊狊犻狀犲狀狊犻狊）［１０］、何首乌（犘狅犾狔犵狅狀狌犿犿狌犾狋犻犳犾狅狉狌犿）［１１］等。
由于金荞麦具有较高的药用与营养价值，是一种经济附加值很高的资源植物，克隆其黄酮类生物合成途径关键酶
基因，对其代谢工程研究具有重要作用。本研究以雅安金荞麦为材料，采用ＰＣＲ技术和染色体步移技术克隆其
犆犎犛基因的ＤＮＡ和ｃＤＮＡ开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）序列，为逐步揭示其次生代谢途径奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料及菌种
金荞麦２００９年７月采自四川雅安老板山，大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α由本实验室保存。
１．２ 试剂
质粒ＤＮＡ小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自 Ｏｍｅｇａ公司；狉犜犪狇ＤＮＡ 聚合酶、克隆载体ｐＭＤ１８Ｔ、
１６２－１６９
２０１０年６月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１９卷 第３期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．３
收稿日期：２００９１２０１；改回日期：２００９１２３１
基金项目：四川省科技厅科技攻关项目（０４ＮＧ００１０１５，２００６Ｚ０８０１２）资助。
作者简介：蒙华（１９８５），女，四川绵阳人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｓａｍｈ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗｕｑｉｗｑ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｉｎｇ试剂盒购自Ｔａｋａｒａ公司；ＲＮＡ提取试剂植物ＲＮＡｏｕｔ试剂盒购自天泽基因工程有限公司；逆转
录试剂盒ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；其他化学试剂均为国产或进口分
析纯。
１．３ 金荞麦犆犎犛基因保守片段的克隆
根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的植物犆犎犛活性中心的保守核苷酸序列，设计如下一对简并引物，ＣＨＳｆ：５′ＡＴＧ（Ａ／
Ｃ）Ｔ（Ｃ／Ｇ）ＴＡ（Ｃ／Ｔ）ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＣＡＧＧＧ３′；ＣＨＳｒ：５′ＣＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＣ（Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ａ（Ｔ／Ｃ）ＣＣＡ
ＧＡＡ３′。以叶片为材料参照吴琦等［１２］ＳＤＳ微量法快速提取总ＤＮＡ进行ＰＣＲ，反应参数为：９４℃５ｍｉｎ；９４℃１
ｍｉｎ，５２℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃８ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化后连接
ｐＭＤ１８Ｔ克隆载体，挑选阳性克隆送北京诺赛基因组
研究中心有限公司进行测序。
１．４ 染色体步移（ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ）扩增金荞麦犆犎犛
基因ＤＮＡ序列
根据１．３获得的金荞麦犆犎犛保守片段核苷酸序
列设计９条特异引物（表１），引物设计位置见图１。按
Ｔａｋａｒａ公司 Ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ试剂盒说明书进行操
作，以总ＤＮＡ为模板，特异引物分别与试剂盒提供的
４条简并引物ＡＰ１～ＡＰ４通过套式ＰＣＲ进行未知序
列的染色体步移。
表１ 犆犎犛染色体步移所用引物
犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉狊犳狅狉犆犎犛犵犲狀狅犿犲狑犪犾犽犻狀犵
引物编号Ｐｒｉｍｅｒｃｏｄｅ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′３′）
３ＪＣ１ ５′ＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡ３′
３ＪＣ２ ５′ＴＣＴＣＡＡＣＡＴＣＧＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＣ３′
３ＪＣ３ ５′ＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＡＴＧＡ３′
５ＪＣ１ ５′ＴＣＡＴＴＣＡＡＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＧＣ３′
５ＪＣ２ ５′ＧＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＧＡＧ３′
５ＪＣ３ ５′ＴＧＧＴＣＴＧＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＡＣＧＡＧ３′
５ＪＣ４ ５′ＴＧＧＴＡＧＧＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＴＧＡ３′
５ＪＣ５ ５′ＧＣＣＡＡＡＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣ３′
５ＪＣ６ ５′ＴＣＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴ３′
图１ 金荞麦犆犎犛基因染色体步移扩增示意图
犉犻犵．１ 犌犲狀狅犿犲狑犪犾犽犻狀犵狆狉狅犮犲犱狌狉犲犳狅狉犆犎犛犵犲狀犲狅犳犉．犱犻犫狅狋狉狔狊
１．４．１ 金荞麦犆犎犛基因３′端未知序列的染色体步移 第１轮：以叶片总ＤＮＡ为模板，３′端特异引物３ＪＣ１分
别与简并引物ＡＰ１～ＡＰ４进行ＰＣＲ。反应参数：９４℃１ｍｉｎ；９８℃１ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６０℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，５个
循环；９４℃３０ｓ，２５℃３ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，１个循环；９４℃３０ｓ，６０℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，６０℃１ｍｉｎ，
７２℃２ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，４４℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，１５个循环；７２℃１０ｍｉｎ，结束。
第２轮：以第１轮ＰＣＲ产物为模板，３′端特异引物３ＪＣ２分别与简并引物ＡＰ１～ＡＰ４进行套式ＰＣＲ。反应参
数：９４℃３０ｓ，６０℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，６０℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，４４℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，１５
个循环；７２℃１０ｍｉｎ，结束。
第３轮：以第２轮ＰＣＲ产物为模板，３′端特异引物３ＪＣ３分别与简并引物ＡＰ１～ＡＰ４进行套式ＰＣＲ，反应参
数同第２轮。３轮ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收后，第３轮产物进行Ｔ载体克隆和测序。
１．４．２ 金荞麦犆犎犛基因５′端未知序列的染色体步移 ５′端特异引物５ＪＣ１、５ＪＣ２和５ＪＣ３分别与４条简并引物
ＡＰ１～ＡＰ４进行５′未知序列的第１次染色体步移，ＰＣＲ产物回收经Ｔ载体克隆测序。拼接测序结果后，再设计
３条５′端特异引物５ＪＣ４、５ＪＣ５和５ＪＣ６进行第２次染色体步移，继续扩增５′端未知序列，２次步移反应参数均同
１．４．１。ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收后第３轮产物进行Ｔ载体克隆和测序。
３６１第１９卷第３期 草业学报２０１０年
１．４．３ 金荞麦犆犎犛基因全长ＤＮＡ序列的克隆 根据测序结果拼接得到犆犎犛全长基因序列后，设计如下１对
特异引物ＪＣｈｓｆ：５′ＡＡＡＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＴＣＣ３′；ＪＣｈｓｒ：５′ＧＣＧＣＣＴＡＧＧＧＡＴＡＡＴＣＡＧＴＴ３′扩增金荞麦
犆犎犛基因全长ＤＮＡ序列，反应条件为：９４℃５ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃９０ｓ，共３０个循环；７２℃８
ｍｉｎ。ＰＣＲ产物纯化后经Ｔ载体克隆和序列测定，获得金荞麦犆犎犛全长ＤＮＡ序列。
１．５ 总ＲＮＡ提取及犆犎犛基因ｃＤＮＡ开放阅读框（ＯＲＦ）序列的克隆
采用植物ＲＮＡｏｕｔ试剂盒提取金荞麦新鲜花蕾总ＲＮＡ。以其为模板，ＯｌｉｇｏｄＴ为引物通过ＲＴ－ＰＣＲ来制
备ｃＤＮＡ第１链。具体操作为：将４μＬ花蕾总ＲＮＡ、１μＬＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μＬ）和７μＬ无ＲＮＡ酶灭菌
水混匀，于７０℃变性５ｍｉｎ后，立即置于冰上２ｍｉｎ；再加入４μＬ５×反应缓冲液、１μＬＲＮＡ酶抑制剂（２０
Ｕ／μＬ）和２μＬ１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ混合物，混匀后于３７℃反应５ｍｉｎ，最后加入１μＬ 逆转录酶 ＭＭＬＶ
（ＲＮａｓｅＨ－）（２００Ｕ／μＬ），反应总体积２０μＬ，４２℃反应１ｈ，７０℃下１０ｍｉｎ灭活反转录酶后于－８０℃保存。以反
转录得到的ｃＤＮＡ为模板，特异引物ＪＣｈｓｆ和ＪＣｈｓｒ扩增其ｃＤＮＡＯＲＦ序列。反应条件为：９４℃５ｍｉｎ；９４℃１
ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃８ｍｉｎ。ＰＣＲ产物纯化后经Ｔ载体克隆和序列测定，获得金荞麦
犆犎犛基因ｃＤＮＡＯＲＦ序列。
１．６ 金荞麦犆犎犛序列分析
采用ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）Ｂｌａｓｔ工具和ＤＮＡＭＡＮ软件（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．２ＬｙｎｎｏｎＢｉｏｓｏｆｔ，
ＵＳＡ）将金荞麦犆犎犛与数据库中其他植物犆犎犛进行核酸和氨基酸的同源序列比对，并用 ＭＥＧＡ４．０软件经邻
接法构建系统发育树。
２ 结果与分析
图２ 金荞麦犆犎犛基因的保守片段犘犆犚
犉犻犵．２ 犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳犮狅狀狊犲狉狏犪狋犻狏犲犳狉犪犵犿犲狀狋
狅犳犆犎犛犵犲狀犲狅犳犉．犱犻犫狅狋狉狔狊
２．１ 犆犎犛基因保守片段的克隆
简并引物ＣＨＳｆ和ＣＨＳｒ扩增出１条约６００ｂｐ的
特异带（图２）。克隆后的测序结果表明，该片段长５５４
ｂｐ。Ｂｌａｓｔ核酸序列比对分析显示，该序列与苦荞麦
（犉．狋犪狋犪狉犻犮狌犿）ＥＵ１５１７２１．１、甜荞麦（犉．犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）
ＥＵ１５１７２２、掌叶大黄（犚犺犲狌犿狆犪犾犿犪狋狌犿）ＤＱ２０５３５２
的同源性分别为１００％，９４％和８６％，表明克隆到了金
荞麦犆犎犛基因的保守片段。
２．２ 染色体步移扩增金荞麦犆犎犛基因ＤＮＡ序列
２．２．１ 金荞麦犆犎犛基因５′端未知序列的染色体步
移 以５′端特异引物５ＪＣ１、５ＪＣ２、５ＪＣ３和简并引物
ＡＰ３经第１次染色体步移获得１条约１１００ｂｐ的特
异带（图３Ａ）；５ＪＣ４、５ＪＣ５、５ＪＣ６和简并引物ＡＰ１、ＡＰ２
经第２次染色体步移分别得到约８００和１０００ｂｐ的特
异带（图３Ａ）。将５′端２次步移测序结果拼接后得到
长１２２５ｂｐ的片段，再与已知保守片段拼接，经Ｂｌａｓｔ比对分析表明，获得了犆犎犛基因包括起始密码子ＡＴＧ在
内的５′端序列。
２．２．２ 金荞麦犆犎犛基因３′端未知序列的染色体步移 以３′端特异引物３ＪＣ１、３ＪＣ２、３ＪＣ３与简并引物ＡＰ３经
染色体步移获得１条约１０００ｂｐ的特异带（图３Ｂ）。其中３ＪＣ３与ＡＰ３的扩增产物测序结果表明，片段长９４７
ｂｐ，与已知保守片段拼接，经Ｂｌａｓｔ比对分析表明，获得了犆犎犛基因包括终止密码子ＴＧＡ在内的３′端序列。
２．２．３ 金荞麦犆犎犛基因全长ＤＮＡ序列的克隆 将扩增得到的保守片段与５′端，３′端序列拼接，拼接后的序列
经Ｂｌａｓｔ比对后找到完整的开放阅读框，以此为模板设计的特异引物ＪＣｈｓｆ和ＪＣｈｓｒ扩增金荞麦犆犎犛基因全长
ＤＮＡ序列，得到１条约１６００ｂｐ的特异带（图４Ａ）。
４６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．３
图３ 染色体步移法扩增金荞麦犆犎犛基因
犉犻犵．３ 犌犲狀狅犿犲狑犪犾犽犻狀犵犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犎犛犵犲狀犲狅犳犉．犱犻犫狅狋狉狔狊
Ａ：犆犎犛基因ＤＮＡ５′端未知序列的染色体步移；１～３：第１次染色体步移，引物ＡＰ３和５ＪＣ１、５ＪＣ２、５ＪＣ３三轮ＰＣＲ产物；４～６：第２次染色体步移，
引物ＡＰ１和５ＪＣ４、５ＪＣ５、５ＪＣ６三轮ＰＣＲ产物；７～９第２次染色体步移，引物ＡＰ２和５ＪＣ４、５ＪＣ５、５ＪＣ６三轮ＰＣＲ产物；Ｂ：犆犎犛基因ＤＮＡ３′端未知
序列的染色体步移；１～３：引物ＡＰ３和３ＪＣ１、３ＪＣ２、３ＪＣ３三轮ＰＣＲ产物 Ａ：Ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｏｆ犆犎犛ｇｅｎｅＤＮＡ５′ｅｎｄｕｎｋｎｏｗｎｓｅｑｕｅｎｃｅ；１－３：ＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｏｆｐｒｉｍｅｒｓＡＰ３ｗｉｔｈ５ＪＣ１、５ＪＣ２、５ＪＣ３；４－６：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｔｉｍｅｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｏｆｐｒｉｍｅｒｓ
ＡＰ１ｗｉｔｈ５ＪＣ４、５ＪＣ５、５ＪＣ６；７－９：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｔｉｍｅｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｏｆｐｒｉｍｅｒｓＡＰ２ｗｉｔｈ５ＪＣ４、５ＪＣ５、５ＪＣ６；Ｂ：Ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｏｆ
犆犎犛ｇｅｎｅＤＮＡ３′ｅｎｄｕｎｋｎｏｗｎｓｅｑｕｅｎｃｅ；１－３：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｏｆｐｒｉｍｅｒｓＡＰ３ｗｉｔｈ３ＪＣ１、３ＪＣ２、３ＪＣ３
２．３ 金荞麦犆犎犛基因ｃＤＮＡＯＲＦ序列的克隆
图４ 金荞麦犆犎犛基因全长犇犖犃及犮犇犖犃犗犚犉的犘犆犚
犉犻犵．４ 犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犇犖犃犪狀犱犮犇犖犃犗犚犉
犳狌犾犾犲狀犵狋犺狅犳犆犎犛犵犲狀犲
Ａ：犆犎犛基因全长ＤＮＡ的ＰＣＲＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＤＮＡｆｕｌ
ｌｅｎｇｔｈｏｆ犆犎犛；Ｂ：犆犎犛基因ｃＤＮＡＯＲＦ的ＰＣＲ
ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｃＤＮＡＯＲＦｏｆ犆犎犛
金荞麦新鲜花蕾总ＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ获得第１
链ｃＤＮＡ后，利用特异引物ＪＣｈｓｆ、ＪＣｈｓｒ扩增犆犎犛基
因ｃＤＮＡＯＲＦ序列，获得１条约１２００ｂｐ的特异带
（图４Ｂ）。
２．４ 金荞麦犆犎犛基因核苷酸序列分析
金荞麦犆犎犛基因ＤＮＡ和ｃＤＮＡ扩增产物经Ｔ
载体克隆后，拼接测序结果，分别得到了长为１６５０和
１１８８ｂｐ的核苷酸序列。将金荞麦犆犎犛 基因全长
ＤＮＡ序列提交ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．
ｈｔｍｌ网站进行内含子预测，并结合ｃＤＮＡ序列的比对
分析表明，该ＤＮＡ序列在位于第６１位半胱氨酸密码
子内第１和第２位碱基之间含有１个４６２ｂｐ大小的
内含子（１８２～６４３ｂｐ），该内含子核苷酸序列符合典型
ＧＴ－ＡＧ内含子的特征（图５）。金荞麦犆犎犛 基因
ｃＤＮＡ序列包含一个完整的开放阅读框，编码３９５个
氨基酸，将该序列命名为犉犱犆犎犛。上述序列已提交
ＮＣＢＩ的ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为ＧＵ１６９４７０。
犉犱犆犎犛序列经Ｂｌａｓｔ分析表明，其核苷酸序列与已报道的苦荞麦犆犎犛基因部分片段（ＥＵ１５１７２１．１）和甜荞
麦犆犎犛基因部分片段（ＥＵ１５１７２２．１）的相似率达到９７％和９４％，与掌叶大黄、虎杖（犘狅犾狔犵狅狀犻犮狌狊狆犻犱犪狋狌犿）、银
白杨（犘狅狆狌犾狌狊犪犾犫犪）等其他植物犆犎犛基因核苷酸序列同源性达７５％以上。
２．５ 金荞麦犆犎犛氨基酸序列分析
将犉犱犆犎犛推导的氨基酸序列进行ＢＬＡＳＴＰ分析，结果表明，其与同为蓼科植物的掌叶大黄、虎杖的同源性
５６１第１９卷第３期 草业学报２０１０年
图５ 犉犱犆犎犛的犇犖犃序列及推导的氨基酸序列
犉犻犵．５ 犇犖犃犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犉犱犆犎犛
内含子以小写字母表示Ｔｈｅｌｏｗｅｒｃａｓｅｐｒｅｓｅｎｔｓｉｎｔｒｏｎ
均在９０％以上，与不同科植物如甜橙、葡萄（犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉）、大豆等也具有较高的同源性。利用ＤＮＡＭＡＮ软件
将犉犱犆犎犛基因推导的氨基酸序列与其他几种植物犆犎犛基因的氨基酸序列进行多序列比对（图６）。分析表明，
编码多种功能位点的外显子２区同源性较高。犉犱犆犎犛编码的氨基酸序列包含了犆犎犛 高度保守的活性位点
Ｃｙｓ１６５、Ｐｈｅ２１６、Ｈｉｓ３０４和 Ａｓｎ３３７，底物结合口袋位点Ｓｅｒ１３４、Ｇｌｕ１９３、Ｔｈｒ１９５、Ｃｙｓ１９８和Ｓｅｒ３３９，环化反应口袋位点
Ｔｈｒ１３３、Ｍｅｔ１３８、Ｐｈｅ２１６、Ｉｌｅ２５５、Ｇｌｙ２５７、Ｐｈｅ２６６和Ｐｒｏ３７６以及犆犎犛的标签序列ＧＦＧＰＧ。其活性位点Ｃｙｓ１６５、Ａｓｎ３３７附
近的保守区域：ＭＭＹＱＱＧＣＦＡＧＧＴＶ，ＹＧＮＭＳＳＡＣＶＬＦＩ也是本研究设计简并引物的依据。
６６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．３
图６ 犉犱犆犎犛与其他植物犆犎犛的氨基酸序列比对
犉犻犵．６ 犃犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳犉犱犆犎犛狑犻狋犺狅狋犺犲狉犆犎犛犳狉狅犿犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆犾犪狀狋狊
＆：高度保守活性位点Ｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｃｔｉｖｅｓｉｔｅ；＃：底物结合口袋位点Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｂｉｎｄｉｎｇｐｏｃｋｅｔｓｉｔｅ；＠：环化反应口袋位点Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎｐｏｃｋｅｔ
ｓｉｔｅ；划线部分为犆犎犛标签序列ＧＦＧＰＧＴｈｅｐａｒｔｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｉｓ犆犎犛ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅＧＦＧＰＧ；Ｆｄ：犉．犱犻犫狅狋狉狔狊；Ｐｃ：犘．犮狌狊狆犻犱犪狋狌犿；Ｒｐ：犚．
狆犪犾犿犪狋狌犿；Ｖｖ：犞．狏犻狀犻犳犲狉；Ｉｎ：犐狆狅犿狅犲犪狀犻犾；Ｐａ：犘．犪犾犫犪；Ｇｍ：犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓；Ａｔ：犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪
利用ＭＥＧＡ４．０软件通过邻接法构建基于犉犱犆犎犛氨基酸序列的系统发育树（图７）。序列中加入了本试验
克隆得到但未发表的苦荞麦和甜荞麦犆犎犛基因。可以看出金荞麦与苦荞麦的同源关系最近，与同为蓼科的甜
荞麦、掌叶大黄和虎杖构成一个分支，表明与它们的同源关系较近，而与其他植物的同源关系较远。
３ 讨论
犆犎犛基因属于多基因家族，在结构上非常保守，除金鱼草（犃狀狋犻狉狉犺犻狀狌犿犿犪犼狌狊）的犆犎犛基因含有２个内含
子外［１３］，其余的犆犎犛均只包含１个内含子和２个外显子，且编码许多功能位点的外显子２区较保守。本试验得
到的金荞麦犆犎犛含有１个内含子，氨基酸序列比对结果也表明编码多种功能位点的外显子２区同源性较高。
此外，氨基酸序列比对发现，金荞麦犆犎犛第１９８位底物结合口袋位点由其他植物中的苏氨酸（Ｔｈｒ）变成了半胱
氨酸（Ｃｙｓ），与同为蓼科植物的虎杖和掌叶大黄一致。在构建系统发育树时，加入了本实验室克隆得到的苦荞麦
７６１第１９卷第３期 草业学报２０１０年
图７ 基于犆犎犛全长氨基酸序列构建的系统发育树
犉犻犵．７ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犫犪狊犲犱狅狀犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犆犎犛
：未发表Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ
和甜荞麦的全长犆犎犛，结果显示，金荞麦和苦荞麦的亲缘关系比和甜荞麦的亲缘关系近。因此，本研究结果从功
能基因序列同源性这个角度，支持Ｓｈａｒｍａ［１４］和罗定泽等［１５］的观点。
黄酮类化合物是一类天然次生代谢物，广泛存在于各种陆生植物当中。它在植物器官花色素积累、抗胁迫、
抗菌和细胞的发育与分化等过程中有着重要的作用，同时还对人体健康有明显的改善作用，如治疗和预防心血管
疾病、抗肿瘤等［１６］。查尔酮合成酶作为黄酮类物质合成途径中的关键酶，其基因的突变，沉默或过表达，往往会
直接或间接的影响多种黄酮类物质的生物合成，从而对植物的花色、抗胁迫能力和黄酮含量等产生一定影响。
Ｈｅｍｌｅｂｅｎ等［１７］对紫罗兰（犕犪狋狋犺犻狅犾犪犻狀犮犪狀犪）白花突变体的研究发现，由于单核苷酸的替代使一个编码精氨酸的
ＡＧＧ变成了编码丝氨酸的ＡＧＴ，突变后的ＣＨＳ失去生理活性，从而影响了花色素的形成导致白花出现；Ｆｕｋｕ
ｓａｋｉ等［１８］利用ＲＮＡｉ技术将犆犎犛ｍＲＮＡ导入夏堇（犜狅狉犲狀犻犪犺狔犫狉犻犱犪）中，发现花色由蓝色变成白色；Ｃｕｉ等［１９］
用玉米小斑病（犅犻狆狅犾犪狉犻狊犿犪狔犱犻狊）病菌侵染高粱（犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉）的幼苗，结果发现其犆犎犛的表达量显著增
加，且抗性高的品种与抗性低的品种相比表达量更大，表达持续的时间更长；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等［２０］将犆犎犛基因和黄
酮醇合酶基因（ｆｌａｖｏｎｏｌｓｙｎｔｈａｓｅ，犉犔犛）共同转化至番茄后，增加了番茄中黄酮醇的含量，从而提高了其抗氧化水
平。
随着转基因技术的发展，许多功能基因被转入资源植物中进行遗传改良以提升它们的品质［２１，２２］。金荞麦是
一种药用与饲用兼备的资源植物，除其块根能入药，子粒具有独特的营养价值和保健功能外，其茎叶也是高产优
质的牧草资源［２３］。随着人们对金荞麦价值认识的加深，需求量大大增加，过度的采挖已使野生金荞麦资源急剧
减少，我国已将其列为国家二级保护植物。鉴于犆犎犛在黄酮类活性物质合成途径中的关键作用，在首次克隆了
金荞麦全长犆犎犛基因的基础上，将继续克隆该途径其他关键酶基因和转录调控因子基因，为其代谢调控机制的
深入研究奠定基础。
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犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犮犺犪犾犮狅狀犲狊狔狀狋犺犪狊犲犵犲狀犲（犆犎犛）犳狉狅犿犉犪犵狅狆狔狉狌犿犱犻犫狅狋狉狔狊
ＭＥＮＧＨｕａ，ＬＩＣｈｅｎｇｌｅｉ，ＷＵＱｉ，ＳＨＡＯＪｉｒｏｎｇ，ＣＨＥＮＨｕｉ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ’ａｎ６２５０１４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍ犉犪犵狅狆狔狉狌犿犱犻犫狅狋狉狔狊５４４ｂｐｗａｓｉｓｏｌａ
ｔｅｄｂｙｈｏｍｏｌｏｇｙｃｌｏｎｉｎｇ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈＤＮＡａｎｄｃＤＮＡＯＲＦ（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅ
ｃｌｏｎｅｄｂｙｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇａｎｄＲＴ－ＰＣＲ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ犆犎犛ＤＮＡｏｆ犉．
犱犻犫狅狋狉狔狊ｗａｓ１６５０ｂｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｏｎｅ４６２ｂｐｉｎｔｒｏｎ．ＴｈｅｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｃＤＮＡｗａｓ１１８８ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ３９５ａ
ｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ犉犱犆犎犛ａｎｄｉｎｃｌｕｄｅｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｉｔｅｓｏｆＣＨＳｓｕｃｈａｓａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｓａｎｄｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ｂｉｎｄｉｎｇｐｏｃｋｅｔｓｉｔｅｓ．Ｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆ犉犱犆犎犛ｗｉｔｈｔｈａｔｏｆｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｔｗａｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅ
ｌａｔｅｄｔｏ犚犺犲狌犿狆犪犾犿犪狋狌犿ａｎｄＰｏｌｙｇｏｎｕｍｃｕｓｐｉｄａｔｕｍｗｉｔｈ９４％ａｎｄ９３％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｅ
ｑｕｅｎｃｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｉｓＧＵ１６９４７０ｉｎＧｅｎＢａｎｋ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犉犪犵狅狆狔狉狌犿犱犻犫狅狋狉狔狊；ｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ
９６１第１９卷第３期 草业学报２０１０年