全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０２１６ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
裴瑞芳，刘英，刘柏林，张宁，司怀军，王蒂．马铃薯犃犚犉基因ＲＮＡｉ载体的遗传转化及对其试管薯生理特性的影响．草业学报，２０１５，２４（２）：
１４２１４７．
ＰｅｉＲＦ，ＬｉｕＹ，ＬｉｕＢＬ，ＺｈａｎｇＮ，ＳｉＨＪ，ＷａｎｇＤ．ＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｕｓｉｎｇａｎＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎ犃犚犉ｇｅｎｅｉｎｐｏｔａｔｏａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｎ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（２）：１４２１４７．
马铃薯犃犚犉基因犚犖犃犻载体的遗传转化
及对其试管薯生理特性的影响
裴瑞芳１，２，刘英１，２，刘柏林１，张宁２，司怀军１，２，王蒂１
（１．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室培育基地，
甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：用含有ＡＤＰ核糖基化因子（犃犚犉）基因的干扰载体的农杆菌转化马铃薯栽培品种“甘农薯２号”，获得转化植
株４８株，经卡那霉素抗性筛选和ＰＣＲ检测证明犃犚犉基因已成功整合到马铃薯基因组中。用实时荧光定量ＰＣＲ
检测表明，转化植株中犃犚犉基因的表达较对照均有不同程度的下降，在转基因株系Ｚ１１和Ｚ１２中，犃犚犉基因表
达的干扰程度分别高达９２．５３％和９３．２２％。对转基因植株诱导的试管薯的淀粉、可溶性糖、蛋白质、蔗糖和葡萄
糖含量测定结果表明，与未转基因的对照相比，转基因植株的淀粉含量提高了４．２９％～３４．２７％，蛋白质含量提高
了１．４７％～７．３５％，可溶性糖含量提高了１．４４％～１７．３９％；蔗糖含量提高了１１．５３％～５３．８４％，而葡萄糖含量降
低了６．０６％～２１．２１％。
关键词：马铃薯；犃犚犉基因；干扰载体；转基因植株；生理指标
犌犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狌狊犻狀犵犪狀犚犖犃犻狏犲犮狋狅狉犮狅狀狋犪犻狀犻狀犵犪狀犃犚犉犵犲狀犲犻狀狆狅狋犪狋狅犪狀犱
犲犳犳犲犮狋狊狅狀狆犺狔狊犻狅犾狅犵犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犿犻犮狉狅狋狌犫犲狉
ＰＥＩＲｕｉｆａｎｇ１，２，ＬＩＵＹｉｎｇ１，２，ＬＩＵＢａｉｌｉｎ１，ＺＨＡＮＧＮｉｎｇ２，ＳＩＨｕａｉｊｕｎ１，２，ＷＡＮＧＤｉ１
１．犌犪狀狊狌犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犆狉狅狆犌犲狀犲狋犻犮犪狀犱犌犲狉犿狆犾犪狊犿犈狀犺犪狀犮犲犿犲狀狋，犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犻犪犾犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犃狉犻犱犾犪狀犱犆狉狅狆犛犮犻
犲狀犮犲，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪；２．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犌犪狀狊狌犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犔犪狀狕犺狅狌７３００７０，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｕｓｉｎｇｐｏｔａｔｏ（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）ｃｕｌｔｉｖａｒ‘Ｇａｎｎｏｎｇｓｈｕ２’ａｓｄｏｎｏｒ，４８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂ
ｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｎ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇａｎＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎＡＤＰｒｉ
ｂｏｓｙｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ（犃犚犉）ｇｅｎｅ．Ｔｅｓｔｉｎｇｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓｏｎａｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｋａｎｍｙｃｉｎａｎｄ
ＰＣＲａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ犃犉犚ｇｅｎｅｈａｄｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｏｔａｔｏｇｅｎｏｍｅ．Ｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ
ｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）ｄａｔａｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ犃犚犉ｇｅｎｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｄｅｃｌｉｎｅｄｔｏｖａｒｙｉｎｇｄｅｇｒｅｅｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓ，ａｎｄｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｄｅ
ｇｒｅｅｒｅａｃｈｅｄ９２．５３％ａｎｄ９３．２２％ｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓＺ１１ａｎｄＺ１２，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｔａｒｃｈｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ４．２９％－３４．２７％，ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｂｙ１．４７％－７．３５％，ｔｈｅｓｏｌｕｂｌｅｓｕｇａｒ
ｃｏｎｔｅｎｔｂｙ１．４４％－１７．３９％，ａｎｄｔｈｅｓｕｃｒｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔｂｙ１１．５３％－５３．８４％ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｐｌａｎｔｓ；
ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｇｌｕｃｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙ６．０６％－２１．２１％ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ
ｐｌａｎｔｓ．
第２４卷 第２期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．２
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年２月
Ｆｅｂ，２０１５
收稿日期：２０１４０２２５；改回日期：２０１４０３２５
基金项目：甘肃省杰出青年基金项目（１３０８ＲＪＤＡ０１１）和国家自然科学基金项目（３１１６０２９８）资助。
作者简介：裴瑞芳（１９９０），女，甘肃天水人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｐｅｉｒｆｓｍｉｌｅ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｈｊｓｉ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｐｏｔａｔｏ；犃犚犉ｇｅｎｅ；ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｖｅｃｔｏｒ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ＡＤＰ核糖基化因子（ＡＤＰｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ＡＲＦ）是犚犪狊基因超家族的成员，它们是大小约２０ｋＤａ的鸟
嘌呤核苷酸结合蛋白，属于小Ｇ蛋白超家族中的ＡＲＦ亚家族［１２］。ＡＲＦ作为霍乱毒素催化ＧＳ 蛋白ＡＤＰ核糖
基化反应的辅助因子，于１９８２年被Ｋａｈｎ和Ｇｉｌｍａｎ［３］最早发现并纯化出该类细胞因子，将其命名为ＡＲＦ。人们
对ＡＲＦ结构和功能的研究大部分是通过研究突变体实现的，通过突变体和天然蛋白质之间的比较可以精确了
解ＡＲＦ结构和功能的关系，其中最著名的是对酵母双突变体的研究［４］。近来人们发现ＡＲＦ作为磷脂酶Ｄ的激
活剂［５６］以及在酵母和哺乳动物中发现 ＡＲＦ是构成高尔基体转运体系的组分，认为它参与了囊泡转运过程，
ＡＲＦ还对蛋白质合成后的运输发挥作用并调控细胞的信号转导［７］。ＡＲＦ普遍且大量存在于真核生物细胞中，
如啤酒酵母（犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲）、拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪犾犪）、果蝇（犇狉狅狊狅狆犺犻犾犪犿犲犾犪狀狅犵犪狊狋犲狉）、蓝氏
贾第虫（犌犻犪狉犱犻犪犾犪犿犫犾犻犪）等低等生物以及鼠、牛等哺乳动物和人，其结构和功能在动植物演化发展中高度保
守［８］。目前已在哺乳动物、高等植物和真菌中克隆了多种形式的犃犚犉基因，并对其基因结构、生理作用、表达调
控作用机制进行了详细研究，随着分子生物学的发展，ＡＲＦ各种基因和基因产物陆续被发现。马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿
狋狌犫犲狉狅狊狌犿）具有产量高、营养丰富、适应性强等优良特性以及随着马铃薯产业的不断壮大和人们消费结构的变
化，马铃薯品质育种工作正在受到重视［９］。
本研究通过农杆菌介导法将组成型表达启动子ＣａＭＶ３５Ｓ驱动的犃犚犉基因的ＲＮＡ干扰表达载体导入到
马铃薯栽培品种中以获得干扰植株，并对其试管薯的淀粉、蛋白质、可溶性糖、蔗糖和葡萄糖含量进行测定，以期
研究犃犚犉基因对马铃薯生理特性的影响，从而为进一步研究犃犚犉基因在马铃薯块茎中的作用提供一定的理论
基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料及试管薯的诱导 ２０１２年３月培养马铃薯栽培品种“甘农薯２号”的试管苗，在无菌条件下
剪成带有２个腋芽的茎段，转接到 ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ，ＭＳ培养基）＋３％蔗糖＋０．４５％琼脂的固体培养
基上。用１５０ｍＬ三角瓶培养，每瓶装５０ｍＬ固体培养基，接种５个茎段，２０００ｌｘ光照下培养，大约在３周后每
个茎段生长成一株带有５～６个节的健壮试管苗，把这些健壮试管苗作为诱导试管薯的母株。试管薯的诱导采用
固体诱导法，即将培养健壮的植株接入诱导培养基上，诱导培养基由 ＭＳ附加８％蔗糖组成。待其培养２０ｄ左
右，将其置于黑暗、温度（２３±１）℃的条件下进行马铃薯试管薯的诱导。
１．１．２ 菌株和质粒 根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）菌株ＬＢＡ４４０４由甘肃省作物遗传改良与种质
创新重点实验室提供，抗性标记为利福平（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ，Ｒｉｆ）；ＲＮＡ干扰表达载体ｐＨｅｌｓｇａｔｅａｒｆ１（含组成型表达启
动子ＣａＭＶ３５Ｓ）由刘柏林博士构建，抗性标记为卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）和壮观霉素（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ，Ｓｐｅ）。
１．１．３ 工具酶和主要试剂 犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自ＴａＫａＲａ公司，引物由上海生物工程公司合
成，ＲＮＡ提取试剂为天根公司生产的ＲＮＡｓｉｍｐｌｅＴｏｔａｌＲＮＡＫｉｔＤＰ４１５，ｃＤＮＡ合成试剂为Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的
ＳＭＡＲＴｅｒＰＣＲｃＤＮＡＳｙｓｔｈｅｓｅＫｉｔ，ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ试剂购自ＴａＫａＲａ公司的ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ? ＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ和
ＳＹＢＲ?ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＩＩ。其余生化药品分别为Ｓｉｇｍａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品及国产分析纯。溶液配方及常用
抗生素与激素的配置详见文献［１０］。
１．２ 方法
１．２．１ 农杆菌工程菌液的制备 挑取培养皿平板上含质粒ｐＨｅｌｓｇａｔｅａｒｆ１的根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４的单菌
落，接种于３０ｍＬＬＢ（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ）培养基，含５０ｍｇ／Ｌ壮观霉素（Ｓｐｅ）＋５０ｍｇ／Ｌ利福平（Ｒｉｆ）中，在２８℃、
２４０ｒ／ｍｉｎ下振荡培养过夜，取１ｍＬ菌液转移到３０ｍＬＬＢ培养基（含有５０ｍｇ／ＬＳｐｅ＋５０ｍｇ／ＬＲｉｆ）中，２８℃、
２４０ｒ／ｍｉｎ下振荡培养至ＯＤ６００约为０．５，于５０００ｒ／ｍｉｎ离心６ｍｉｎ，收集沉淀用相同体积液体ＭＳ培养基重新悬
浮备用。
３４１第２期 裴瑞芳 等：马铃薯犃犚犉基因ＲＮＡｉ载体的遗传转化及对其试管薯生理特性的影响
１．２．２ 马铃薯的遗传转化 采用农杆菌介导的马铃薯试管薯薄片遗传转化方法［１１］。
１．２．３ 转化再生植株的ＰＣＲ检测 用ＣＴＡＢ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，十六烷基三甲基溴化
铵）法提取转化植株和对照植株的叶片总ＤＮＡ。参照Ｓａｍｂｒｏｏｋ和Ｒｕｓｓｅｌ［１０］的方法对抗性植株进行 ＰＣＲ检
测。用检测引物 Ｇ２Ａ１Ｆ（５′ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＡＴＣＴＴＣＧＡＴＴＡＡＣＧＧ
３′）和 Ｇ２Ａ２Ｒ（５′ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡ ＧＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＣＧＡＴＧＴ３′）进行 ＰＣＲ
扩增，预期片段大小为７６８ｂｐ。用１％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ结果。
１．２．４ 转基因植株实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测 分别提取ＤＮＡ检测呈阳性植株的总ＲＮＡ，用
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ反转录试剂进行反转录，具体操作按产品说明书进行。以马铃薯
犲犳１犪基因为内参（扩增引物为ｅｆ１ａＦ：５′ＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＡＧ３′和ｅｆ１ａＲ：５′ＴＴＣＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡ
ＣＧＣＣＴＧＴ３′），以犃犚犉基因序列设计一对特异性较高的引物ＡＲＦＦ：５′ＧＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴ３′
和ＡＲＦＲ：５′ＣＣＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡＣ３′。利用ＳＹＢＲ荧光染料法进行转基因植株的ｑＲＴ－ＰＣＲ检测
与分析，根据２－△△Ｃｔ方法计算出犃犚犉基因的相对表达量［１２］。
１．２．５ 转基因植株试管薯生理指标的测定 于２０１３年７月、８月、９月依次诱导转基因试管薯，并在２０１３年
１０月、１１月、１２月分别收获诱导成功的试管薯３份，贮藏在４℃冰箱中并用于各项生理指标的测定。蔗糖和可溶
性糖含量的测定用蒽酮硫酸法［１３］。葡萄糖含量的测定用酶比色法［１３］。淀粉含量的测定参照张永成和田丰［１４］的
比重法。可溶性蛋白含量的测定参照李合生［１５］的考马斯亮蓝Ｇ２５０染色法。
试验均重复３次后收集数据，采用 ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２００３和ＳＰＳＳ１７．０专业版软件进行数据处理与分析。
２ 结果与分析
２．１ 马铃薯遗传转化与生根筛选
图１ 转基因外植体在犓犪狀选择培养基上芽分化和植株再生
犉犻犵．１ 犛犺狅狅狋犪狀犱狆犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀犳狉狅犿狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犲狓狆犾犪狀狋狊
狅狀狋犺犲狊犲犾犲犮狋犻狏犲犿犲犱犻狌犿犮狅狀狋犪犻狀犻狀犵犽犪狀犪犿狔犮犻狀
１：非转基因植株 Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；２：转基因植株 Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔ．
图２ 部分转基因植株的犘犆犚检测
犉犻犵．２ 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狊狅犿犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犫狔犘犆犚
Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：质粒阳性对照 Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｌａｓｍｉｄ；２：
阴性对照，非转基因植株 Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ，ｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ；３：
Ｈ２Ｏ对照 Ｈ２Ｏｃｏｎｔｒｏｌ；４～１３：转化植株 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ．
试管薯薄片在分化培养基上培养１０ｄ后即开始
膨大并逐渐变绿，２０ｄ后薯片中央有绿色凸起，３０ｄ
后凸起处直接分化出绿色芽点，４０ｄ后在薯片凸起处
或周边有绿色单芽或丛生芽发出（图１Ａ），待抗性芽长
至２ｃｍ左右时剪下接入附加有５０ｍｇ／ＬＫａｎ和２５０
ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ，Ｃａｒｂ）的 ＭＳ生根培
养基上培养，８ｄ后植株茎段切口处生根（图１Ｂ），植株
能正常生长，对照组外植体基本不能分化出芽，表明再
生植株具有 Ｋａｎ抗性，再生植株每２０ｄ在５０ｍｇ／Ｌ
Ｋａｎ的 ＭＳ培养基上继代培养１次，继代３次以上均
能正常生根及生长的转基因植株为抗性植株，经过
Ｋａｎ３次筛选共筛选出４８株抗性植株。
２．２ 转基因植株检测与分析
２．２．１ 转基因植株的ＰＣＲ检测 用经过 Ｋａｎ筛
选获得的４８株转化植株的 ＤＮＡ 为模板，用引物
Ｇ２Ａ１ 和Ｇ２Ａ２ 进行ＰＣＲ扩增检测，结果有３８株扩增
出特异性目的片段，与从载体质粒中扩增出片段大小
７６８ｂｐ相符，而非转化植株未扩增出相应条带（图２），
初步证明犃犚犉基因已整合到马铃薯的基因组中。
２．２．２ 转基因植株的ｑＲＴ－ＰＣＲ检测分析 以马
铃薯犲犳１犪基因为内参，采用ｑＲＴ－ＰＣＲ法对马铃薯
块茎中犃犚犉基因的表达量进行了检测。结果表明，
４４１ 草 业 学 报 第２４卷
犃犚犉基因在转基因植株（Ｚ１～Ｚ１２）中的表达量较对
图３ 转基因植株犃犚犉基因表达的狇犚犜－犘犆犚检测结果
犉犻犵．３ 犚犲狊狌犾狋狅犳犃犚犉犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀狋犺犲
狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犫狔狇犚犜－犘犆犚犪狊狊犪狔
Ｇ：对照，非转基因植株Ｃｏｎｔｒｏｌ，ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；Ｚ１～Ｚ１２：７个
不同的转基因株系７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｌｉｎｅｓ．不同字母表示差异
显著（犘＜０．０５）Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜
０．０５．
照（Ｇ）达到了显著的差异（其中Ｚ１０植株除外），转基
因植株中犃犚犉基因的表达都受到一定程度的干扰。
从相对表达量来看Ｚ１１、Ｚ１２的干扰程度比Ｚ１、Ｚ７
的干扰程度更大，其干扰程度分别高达９２．５３％和
９３．２２％。而转基因株系Ｚ１０中犃犚犉基因的表达量
较对照没有明显差异（图３）。
２．３ 转基因植株生理指标的测定
对转基因植株诱导的试管薯的生理指标的测定结
果表明，转犃犚犉基因株系Ｚ１、Ｚ２、Ｚ５、Ｚ７、Ｚ１１、Ｚ
１２的淀粉含量与对照相比，提高了４．２９％～３４．２７％；
而 蛋 白 质 含 量 仅 有 株 系 Ｚ２、Ｚ７、Ｚ１１ 提 高 了
１．４７％～７．３５％，其余株系的蛋白质含量均有所下降，
可溶性糖含量与对照相比提高了１．４４％～１７．３９％；
而转基因植株的蔗糖含量较对照发生了较大的变化，
比对照提高了１１．５３％～５３．８４％；葡萄糖含量比对照
降低了６．０６％～２１．２１％（表１）。
表１ 转犃犚犉基因马铃薯试管薯生理指标的测定结果
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犪狊狊犪狔狉犲狊狌犾狋狅犳狆犺狔狊犻狅犾狅犵犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆狅狋犪狋狅狋狌犫犲狉狊狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狑犻狋犺犃犚犉犵犲狀犲 ％
株系
Ｐｌａｎｔｌｉｎｅｓ
淀粉含量
Ｓｔａｒｃｈｃｏｎｔｅｎｔ
蛋白质含量
Ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔ
可溶性糖含量
Ｓｏｌｕｂｌｅｓａｃｃｈａｒｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔ
蔗糖含量
Ｓｕｃｒｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔ
葡萄糖含量
Ｇｌｕｃｏｓｅｃｏｎｔｅｎｔ
Ｇ ９．５４ｇＧ ０．６８ａｂＡ ０．６９ｄＥ ０．２６ｆＤ ０．３３ａＡ
Ｚ１ １０．４３ｅＥ ０．６９ａＡ ０．７２ｃＣＤ ０．３０ｄｅＣ ０．３０ｂＢ
Ｚ２ ９．９５ｆＦ ０．６４ｃＢ ０．７０ｄＤＥ ０．２９ｅＣ ０．２８ｃｄＢＣＤ
Ｚ５ １１．０６ｃＣ ０．６７ｂＡ ０．７７ｂＢ ０．３１ｄＣ ０．３０ｂＢ
Ｚ７ １０．８４ｄＤ ０．６１ｄＣ ０．７３ｃＣ ０．３５ｃＢ ０．２９ｂｃＢＣ
Ｚ１１ １１．９７ｂＢ ０．６９ａＡ ０．８０ａＡ ０．３７ｂＢ ０．２７ｄｅＣＤ
Ｚ１２ １２．８１ａＡ ０．６２ｄＢＣ ０．８１ａＡ ０．４０ａＡ ０．２６ｅＤ
Ｇ：对照，非转基因植株Ｃｏｎｔｒｏｌ，ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ；Ｚ１～Ｚ１２：６个不同的转基因株系６ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｌｉｎｅｓ．邓肯氏新复极差法显著
性检测。同列不同小写字母表示０．０５差异显著水平，大写字母表示０．０１差异显著水平。ＴｈｅａｓｓａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂａｓｅｄｏｎＤｕｎｃａｎ’ｓｎｅｗｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｒａｎｇｅｔｅｓｔ．Ｔｈｅｌｏｗｅｒｃａｓｅｓｆｏｌｏｗｉｎｇｔｈｅｄａｔｕｍｉｎｅａｃｈｃｏｌｕｍｎｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅｃａｐｉｔａｌｓｆｏｌｏｗｉｎｇ
ｔｈｅｄａｔｕｍｉｎｅａｃｈｃｏｌｕｍｎｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ０．０１ｌｅｖｅｌ．
３ 讨论
转基因技术是研究基因功能的基本手段，本研究利用根癌农杆菌介导的遗传转化法将犃犚犉基因干扰载体
转入马铃薯中，对犃犚犉基因的功能进行探索和研究。已有研究表明，ＡＲＦ是一类在真核生物进化早期出现的高
度保守的ＧＴＰ激酶，它对于分泌性囊泡的形成是必需的，其在内吞途径、生物合成、类脂的代谢、胚胎发育及物
质运输中起重要的调控作用，主要在内质网和高尔基体之间囊泡运输中起作用［１６］。Ｎａｒａｍｏｔｏ等［１７］研究了依赖
于ＡＲＦＧＴＰａｓｅ活性的植物细胞的内同作用调控机制，发现ＡＲＦ－ＧＥＦＧＮＯＭ 和 ＡＲＦ－ＧＡＰｖａｓｃｕｌａｒｎｅｔ
ｗｏｒｋｄｅｆｅｃｔｉｖｅ３（ＶＡＮ３）参与了植物激素极性运输介导的胚胎发生，并将其定位在质膜及细胞内部结构上。Ｚｕｋ
等［１８］证实，抑制马铃薯犃犉犚基因的表达会导致１４３３蛋白基因的激活，导致植物的表型以及碳水化合物的含量
５４１第２期 裴瑞芳 等：马铃薯犃犚犉基因ＲＮＡｉ载体的遗传转化及对其试管薯生理特性的影响
都会发生改变，在获得的转基因马铃薯块茎中出现了亚油酸水平的含量显著增加，同时具有抗氧化能力的酚类物
质含量也升高。近几年，随着分子生物学的发展，ＡＲＦ各种基因和基因产物陆续被发现，以及对其功能的研究也
相应展开。
本研究通过经Ｋａｎ抗性筛选和ＰＣＲ初步检测得到４８株转犃犚犉基因干扰植株。Ｌｉｕ等［１９］研究分析表明
犃犚犉基因在马铃薯的块茎中优势表达，其中在马铃薯块茎中表达量最高。本研究通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测分析
犃犚犉基因在转基因马铃薯试管薯中的表达，结果显示转化植株中犃犚犉 基因的干扰程度可达到３５．２３％～
９３．２２％，尤其在株系Ｚ１１和Ｚ１２中，犃犚犉基因表达的干扰程度分别高达９２．５３％和９３．２２％。通过测定其试管
薯中的淀粉、蛋白质、可溶性糖、蔗糖以及葡萄糖含量，发现转基因株系试管薯的生理指标较对照都有所变化，淀
粉含量与对照相比，提高了４．２９％～３４．２７％，其中犃犚犉基因干扰较大的株系Ｚ１１和Ｚ１２的淀粉含量较对照分
别提高了２５．４７％和３４．２７％，干扰较小的株系Ｚ２和Ｚ７的淀粉含量较对照分别提高了４．２９％和１３．６２％，此结
果表明犃犚犉基因的干扰表达程度与淀粉含量的增加幅度呈正相关，说明犃犚犉基因在马铃薯淀粉合成途径中起
着重要的调节作用。转基因株系蛋白质含量与对照相比，仅有株系Ｚ２、Ｚ７、Ｚ１１提高了１．４７％～７．３５％，其余
株系的蛋白质含量均有所下降，说明犃犚犉基因在马铃薯蛋白质合成中没有作为主要的调控因子。转基因植株
可溶性糖含量与对照相比提高了１．４４％～１７．３９％，说明犃犚犉基因的抑制表达对可溶性糖的合成具有正向调控
作用。转基因植株葡萄糖含量比对照降低了６．０６％～２１．２１％，方差分析其较对照均达到极显著的水平。而转
基因植株的蔗糖含量较对照发生了较大的变化，比对照提高了１１．５３％～５３．８４％，该结果表明，犃犚犉基因可能
作为蔗糖合成过程中的一个负调控因子，对蔗糖的合成具有较大的影响。Ｚｕｋ等［１８］推测犃犚犉基因的抑制表达
导致１４３３蛋白基因的激活，其中１４３３蛋白基因对硝酸还原酶和蔗糖转化酶的活性有一定的影响，而蔗糖转
化酶不可逆的催化蔗糖的水解反应并生成葡萄糖和果糖，是植物体糖代谢途径中重要的酶类之一。马铃薯块茎
成熟后碳水化合物的可利用性是维持植株旺盛代谢所必需的［２０］。其中淀粉、蔗糖以及葡萄糖作为重要的能量物
质，为各器官的生命活动提供养分保障，在不同的生理状态中都具有重要的作用，而犃犚犉基因的干扰表达会在
一定程度上使淀粉含量，蔗糖有所增加，葡萄糖含量降低。犃犚犉基因在马铃薯试管薯形成过程中具体的生理功
能还有待进一步深入研究。
４ 结论
采用农杆菌介导法，获得了ＡＤＰ核糖基化因子（ＡＲＦ）干扰基因的转基因马铃薯植株。用ｑＲＴ－ＰＣＲ检测
表明，转化植株中犃犚犉基因表达的干扰程度可高达９３．２２％。ＲＮＡ干扰基因的导入导致转基因植株试管薯的
淀粉、可溶性糖、蛋白质、蔗糖和葡萄糖含量发生了一定程度的变化。研究结果为进一步研究犃犚犉基因在马铃
薯块茎中的作用奠定了一定的基础。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲：
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