全 文 ：书霸王的原生质体培养及植株再生研究
王瑛华１，２，陈刚２，贾敬芬１，郝建国１
（１．西北大学生物技术省级重点实验室，陕西 西安７１００６９；２．肇庆学院生命科学学院，广东 肇庆５２６０６１）
摘要：本研究建立了霸王原生质体再生植株的试验体系。以子叶切块诱导的松软愈伤组织为材料，通过酶法分离
出大量有活力的原生质体，原生质体经培养持续分裂形成了愈伤组织，并分化出再生苗。比较了不同培养基和培
养密度对原生质体分裂和再生的影响。结果表明，原生质体以２×１０５ 个／ｍＬ的植板密度，采用液体浅层法培养在
附加１．０ｍｇ／Ｌ２，４二氯苯氧乙酸（２，４Ｄ）、０．２ｍｇ／Ｌ６苄氨基嘌呤（６ＢＡ）、０．２ｍｇ／Ｌ激动素（ＫＴ）、５００ｍｇ／Ｌ水
解酪蛋白（ＣＨ）、２％蔗糖和０．５ｍｏｌ／Ｌ甘露醇的ＤＰＤ培养基中，可获得最佳效果，其细胞分裂频率达２８．４％左右。
转移到附加１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、０．５ｍｇ／Ｌ萘乙酸（ＮＡＡ）的 ＭＳ分化培养基上，获得大量的再生苗。
关键词：霸王；原生质体培养；植株再生
中图分类号：Ｑ９４５．３９；Ｑ９４９．７５２．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０３０１１００７
霸王（犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿）又称霸王柴、木霸王，为蒺藜科霸王属植物［１］，分布于我国西北和内蒙古
荒漠地区，多生长于干旱的沙地、覆沙地上，是强旱生的小灌木。骆驼和羊喜食其幼嫩枝叶，是天然草场的优良牧
草。霸王的根入药，可行气散淤［２］。目前对霸王的研究主要集中在生理生态［３～５］、组织培养［６］和分子生物学［７～９］
等方面。迄今为止，国内外未见到霸王原生质体培养再生植株的报道。
采用传统的杂交技术改良牧草的品质性状需要的时间长、见效慢，而生物技术将为牧草品质改良带来新的革
命。在我国，利用生物技术进行牧草植物的改良具有极其宝贵的机遇［１０］。基因工程在提高牧草品质上具有较高
的潜力［１１，１２］。植物原生质体培养是进行遗传操作和细胞工程手段改造植物的基础，也是研究基因表达与体外细
胞分化的优良试验体系，因此受到国内学者的广泛重视［１３～１５］。利用基因工程的方法向霸王导入有用的外源目的
基因具有十分重要的意义。原生质体培养是基因工程的基础，因此有必要建立由愈伤组织分离的原生质体培养
体系，对霸王进行了叶片组织培养，并建立了高频率再生体系［１６］。本试验首次以霸王的愈伤组织为材料分离出
高得率、高成活率的原生质体，进行液体浅层培养，以期获得再生植株，为利用原生质体转化方法开发沙漠植物种
质资源提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料及愈伤组织诱导
供试材料为霸王，种子采自中国科学院新疆吐鲁番沙漠植物园。将萌发的无菌实生苗子叶切成０．３ｃｍ×
０．３ｃｍ的小块，诱导形成愈伤组织。诱导培养基为 ＭＳ［１７］＋２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．２ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋３％蔗糖＋
０．６５％琼脂，ｐＨ值５．８～６．２。然后将愈伤组织转移至含１．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ、０．２ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、５００ｍｇ／ＬＣＨ的相
同培养基上继代培养，每３周继代１次。选择淡黄绿色、生长旺盛、易分散的愈伤组织用于原生质体分离。
１．２ 原生质体的分离、收集及纯化
分别取转代６，８，１０，１２，１４，１６和１８ｄ的松软愈伤组织１～２ｇ，置于盛有１０ｍＬ酶液的三角瓶中，在（２５±
２）℃、黑暗下静置１２ｈ，在恒温摇床上５０ｒ／ｍｉｎ振荡１ｈ，分离原生质体。所用酶类包括纤维素酶（ｃｅｌｕｌａｓｅｏｎｏ
ｚｕｋａＲ１０，Ｙａｋｕｌｔ，Ｊａｐａｎ）、半纤维素酶（ｈｅｍｉｃｅｌｕｌａｓｅ，Ｓｉｇｍａ）、果胶酶（ｐｅｃｔｉｎａｓｅ，Ｓｅｒｖａ）。酶液均添加不同浓
度的甘露醇、０．１％ ＭＥＳ［２，（Ｎ吗啉）乙烷磺酸］、０．０５ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，ｐＨ值５．８。
酶解液用３００目不锈钢筛过滤，于８００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收集原生质体。原生质体悬浮于洗液中（０．１６
１１０－１１６
２００９年６月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第３期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
收稿日期：２００８０７１５；改回日期：２００８０９２８
基金项目：国家自然科学基金项目（３０６７１０８２）资助。
作者简介：王瑛华（１９７９），女，陕西商洛人，讲师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｙｉｎｇｈｕａ＿１１８＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｊｆ３８＠ｎｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，０．１％ ＭＥＳ，ｐＨ值５．８），用１８％蔗糖溶液离心（５０ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ）漂浮纯化原生质体，将漂浮
的原生质体吸至新管，用洗液洗涤１次，再用原生质体培养液洗涤１次，随后计数原生质体产率和活力。用０．１％
酚藏花红溶液（溶于０．５ｍｏｌ／Ｌ甘露醇）染色鉴别原生质体活力，并以存活原生质体占原生质体总数的百分数表
示结果。每次分离的原生质体随机检查２０个视野，每个处理至少３次重复。
１．３ 原生质体培养
纯化后的原生质体重新悬浮于培养液中，并调整原生质体至合适的密度，置于直径６ｃｍ的玻璃培养皿中，每
皿２ｍＬ。此过程在（２５±２）℃暗条件下进行。试用的原生质体培养液包括 ＭＳ、ＤＰＤ［１８］、Ｂ５［１９］的基本成分，同时
都附加２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ、０．２ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、５００ｍｇ／ＬＣＨ、２％蔗糖、０．５ｍｏｌ／Ｌ甘露醇，ｐＨ值５．８。选定ＤＰＤ基
本培养基后，比较２，４Ｄ、６ＢＡ、ＫＴ和ＮＡＡ四种激素的不同组合（表１）对原生质体形成细胞分裂频率的影响，
相对分裂频率以培养７ｄ时发生分裂的原生质体数占植板的存活原生质体总数的百分数表示。每次分离的原生
质体随机检查２０个视野，每个处理３次重复。
１．４ 愈伤组织形成及植株分化
大约培养２周后，原生质体分裂形成小细胞团，此
时向培养皿添加０．５ｍＬ甘露醇浓度减半的培养基，
以后每７ｄ加入渗透压逐渐降低的新鲜培养基。将生
长至２ｍｍ左右的小愈伤组织转入 ＭＳ固体培养基
（同１．１继代培养基）进行增殖。待愈伤组织形成后转
入分化培养基，在（２５±２）℃、２５００ｌｘ下诱导分化。
分化培养基为附加１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ
的 ＭＳ固体培养基。待再生苗长到１～２ｃｍ时切下，
转入 ＭＳ＋１．０ｍｇ／ＬＫＴ＋３％蔗糖＋７％琼脂的培养
基上（ｐＨ值５．８～６．２）诱导生根。
２ 结果与分析
２．１ 霸王原生质体的分离和纯化
２．１．１ 甘露醇浓度对霸王原生质体分离的影响 酶
液中的甘露醇浓度对霸王原生质体分离有一定影响
（图１），在０．３～０．５ｍｏｌ／Ｌ内，随着甘露醇浓度的提
高，原生质体产量明显上升，游离的原生质体球形，胞
质浓郁，内含物丰富（图２Ａ），但浓度进一步升高，其产
量呈逐渐下降趋势。当酶液满足组合（３）的条件时，以
愈伤组织分离原生质体的最适甘露醇浓度为０．５
ｍｏｌ／Ｌ，其原生质体最高得率为２．３６×１０６ 个／ｇ鲜重
（表２）。
表１ 原生质体培养基中不同激素组合对
原生质体细胞分裂的影响
犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆犺狔狋狅犺狅狉犿狅狀犲狅狀犮犲犾犱犻狏犻狊犻狅狀
犪狀犱犮狅犾狅狀犻犲狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狊
犳狉狅犿犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿
植物激素
Ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ（ｍｇ／Ｌ）
２，４Ｄ ６ＢＡ ＫＴ ＮＡＡ
分裂时间
Ｔｉｍｅｏｆｄｉｖｉｓｉｏｎ
（ｄ）
分裂频率
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｄｉｖｉｓｉｏｎ
（％）
０．５ ０．１ ０．５ ５ １２．８
１．０ ０．２ ３～４ ２１．３
１．０ ０．２ ０．２ ３～４ ２８．４
２．０ ０．５ ０．２ ４～５ １７．５
０．２ ０．５ １．０ ５～６ ７．２
０．５ ０．５ ２．０ ５ １０．１
１．０ ７ ５．８
２．０ ＞７ ３．２
基本培养基：ＤＰＤ＋２％蔗糖＋５００ｍｇ／ＬＣＨ＋０．５ｍｏｌ／Ｌ甘露醇，
ｐＨ值５．８～６．２。
Ｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ：ＤＰＤ＋２％ｓｕｃｒｏｓｅ＋５００ｍｇ／ＬＣＨ＋０．５ｍｏｌ／Ｌｍａｎ
ｎｉｔｏｌ，ｐＨ５．８～６．２．
图１ 甘露醇浓度对原生质体分离的影响
犉犻犵．１ 犈犳犳犲犮狋狅犳犿犪狀狀犻狋狅犾犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狔犻犲犾犱
２．１．２ 不同取材时间对分离原生质体的影响 在附
加１．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ和０．２ｍｇ／Ｌ６ＢＡ的 ＭＳ培养基
上继代培养的霸王愈伤组织呈淡黄绿色且质地疏松，
是进行原生质体分离的适宜材料。愈伤组织转入新鲜
培养基，取材时间不同，游离原生质体的产量也表现差
异（图３）。转代后生长１４ｄ左右的愈伤组织处于旺盛
分裂状态，原生质体的产量相对较高，每克愈伤组织可
分离出２．３６×１０６ 个原生质体，酚藏花红染色结果显
１１１第１８卷第３期 草业学报２００９年
图２ 原生质体的早期分裂
犉犻犵．２ 犘狉犻犿犪狉狔犱犻狏犻狊犻狅狀狊犳狉狅犿狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狊
Ａ：新分离的霸王原生质体（×３５０）Ｆｒｅｓｈｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆ犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿 （×３５０）；Ｂ：原生质体再生细胞的第１次分裂（×７５０）
Ｆｉｒｓｔｄｉｖｉｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ（×７５０）；Ｃ：原生质体形成细胞的多次分裂（×２００）Ａｃｌｕｓｔｅｒｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌ（×４０）；Ｄ：原生质体形成的肉
眼可见的细胞团（×４０）Ｃｌｕｓｔｅｒｓｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌ （×４０）
表２ 酶液组成对霸王原生质体产量和活力的影响
犜犪犫犾犲２ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犲狀狕狔犿犲犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狅狀狔犻犲犾犱犪狀犱狏犻犪犫犻犾犻狋狔狅犳狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狊犳狉狅犿犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿
不同组合的酶液Ｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆｅｎｚｙｍｅｓｏｌｕｔｉｏｎ 原生质体产量Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｙｉｅｌｄ（×１０６个／ｇ）原生质体活力Ｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ（％）
（１）１％纤维素酶、１％果胶酶１％Ｃｅｌｕｌａｓｅ，１％Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ １．４４ ８７
（２）１％纤维素酶、１％果胶酶、１％半纤维素酶１％
Ｃｅｌｕｌａｓｅ，１％Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ，１％Ｈｅｍｉｃｅｌｕｌａｓｅ
１．８９ ９１
（３）２％纤维素酶、１％果胶酶、１％半纤维素酶２％
Ｃｅｌｕｌａｓｅ，１％Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ，１％Ｈｅｍｉｃｅｌｕｌａｓｅ
２．３６ ８５
注：表２所示酶液中，均添加０．１％ ＭＥＳ［２，（Ｎ吗啉）乙烷磺酸］，０．０５ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．５ｍｏｌ／Ｌ甘露醇，ｐＨ值５．８。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｅｎｚｙｍｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｔａｂｌｅ２ｗｅｒｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ０．１％ （ｗ／ｖ）ＭＥＳａｎｄ０．０５ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．５ｍｏｌ／Ｌｍａｎｎｉｔｏｌ，ｐＨｗａｓ
ａｄｊｕｓｔｅｄｔｏ５．８．
图３ 愈伤组织相对生长率与原生质体产量的关系
犉犻犵．３ 犚犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀狉犲犾犪狋犻狏犲犵狉狅狑狋犺狉犪狋犲犪狀犱狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狔犻犲犾犱
示原生质体活力在８５％以上。本试验表明，处于旺盛增殖期的愈伤组织细胞，即转代后１４ｄ的霸王细胞最适合
分离原生质体。
２．１．３ 酶的种类和浓度对原生质体产量和活力的影响 将转代１４ｄ的松软愈伤组织置于３种不同组合的酶液
中，收集的原生质体的活力均在８５％以上（表２）。组合（１）和组合（２）相比，半纤维素酶的加入，更有利于原生质
体的分离。组合（２）与组合（３）比较，尽管组合（３）中得到的原生质体活力只有８５％，低于组合（２）中的９１％，但所
获得的原生质体产量（２．３６×１０６ 个／ｇ）最高。故下面研究均采用组合（３），即２％纤维素酶、１％半纤维素酶和
１％果胶酶的组合来游离原生质体。
２．２ 原生质体的早期分裂及其影响因素
２．２．１ 基本培养基对原生质体分裂的影响 在均附加２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ、０．２ｍｇ／Ｌ６ＢＡ、２％蔗糖、０．５ｍｏｌ／Ｌ
２１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
甘露醇、５００ｍｇ／ＬＣＨ的情况下，比较了ＭＳ、Ｂ５、ＤＰＤ
３种培养基对霸王原生质体培养的影响。结果如表３
所示，在用液体浅层培养到７ｄ时，ＭＳ培养基中少量
原生质体发生１次分裂，大部分细胞破碎死亡。Ｂ５ 培
养基中原生质体相对分裂频率较低，仅为１１．３％，且
有部分细胞开始褐化。而在ＤＰＤ培养基中效果最佳，
相对分裂频率达到了２８．０％左右。故采用ＤＰＤ为基
本培养基进行以下研究。
２．２．２ 原生质体培养密度对其分裂频率的影响 为
了研究霸王原生质体的起始密度对其分裂频率的影
响，本试验将分离的原生质体以不同密度在ＤＰＤ培养
基中进行液体浅层培养。再生细胞的早期分裂受到原
生质体起始培养密度的显著影响（表４）。原生质体处
于低密度时（１×１０５个／ｍＬ），再生细胞的分裂频率较
表３ 基本培养基成分对霸王原生质体再生细胞分裂频率的影响
犜犪犫犾犲３ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犫犪狊犪犾犿犲犱犻犪狅狀犱犻狏犻狊犻狅狀
犳狉犲狇狌犲狀犮狔狅犳狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狊犳狉狅犿犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿 ％
试验次数
Ｔｅｓｔｔｉｍｅｓ
原生质体分裂频率Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｉｖｉｓｉｏｎ
ＭＳ培养基
ＭＳｍｅｄｉｕｍ
Ｂ５培养基
Ｂ５ｍｅｄｉｕｍ
ＤＰＤ培养基
ＤＰＤｍｅｄｉｕｍ
１ ３．６ １０．６ ２５．６
２ ３．７ １２．４ ２８．８
３ ４．４ １０．９ ３０．８
平均Ａｖｅｒａｇｅ ３．９ １１．３ ２８．４
注：培养７ｄ后在倒置显微镜下直接计数，每一培养皿随意取２０个视
野，统计分裂的原生质体个数占总数百分比。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄａｆｔｅｒ７ｄｗｉｔｈｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏ
ｓｃｏｐｅ（２０ｒａｎｄｏｍｆｉｅｌｄｓｐｅｒｐｅｔｒｉｄｉｓｈ），ａｎｄｔｈｅｄｉｖｉｓｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｗａｓｅｓｔｉｍａｔｅｄ．
表４ 不同的原生质体密度对原生质体细胞分裂和克隆的影响
犜犪犫犾犲４ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犱犲狀狊犻狋狔狅犳狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狅狀狋犺犲犮犲犾犱犻狏犻狊犻狅狀犪狀犱犮狅犾狅狀犻犲狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳狆狉狅狋狅狆犾犪狊狋狊犳狉狅犿犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿
项目Ｉｔｅｍ
培养密度Ｄｅｎｓｉｔｙｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ（×１０５个Ｎｕｍｂｅｒ／ｍＬ）
１ ２ ４ ８ １６
分裂时间Ｔｉｍｅｏｆｄｉｖｉｓｉｏｎ（ｄ） ４ ３～４ ３～４ ４～５ ４～５
分裂频率Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｄｉｖｉｓｉｏｎ（％） ９．７ ２８．４ ２３．５ ５．６ ３．２
褐化情况Ｂｒｏｗｎｉｎｇ 未见Ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ 未见Ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ 未见Ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ 明显Ｏｂｖｉｏｕｓ 明显Ｏｂｖｉｏｕｓ
低（仅达到９．７％）；而过高的原生质体密度（＞８×１０５ 个／ｍＬ）会导致原生质体再生细胞的褐化，从而降低细胞分
裂频率。只有处于适当密度时，原生质体才易于分裂。霸王原生质体的最佳培养密度为２×１０５ 个／ｍＬ，此时其
分裂频率可达２８．４％。
２．２．３ 不同激素组合对原生质体分裂的影响 培养基中的激素组合对原生质体再生细胞的生长状态和分裂以
及克隆形成影响较大，本试验比较了６ＢＡ（０．１～０．５ｍｇ／Ｌ）、ＮＡＡ（０．５～２．０ｍｇ／Ｌ）、２，４Ｄ（０．５～２．０ｍｇ／Ｌ）
和ＫＴ（０．２～１．０ｍｇ／Ｌ）等不同激素在原生质体培养中的影响。结果表明，２，４Ｄ对原生质体的分裂频率影响较
大，当２，４Ｄ的浓度从０．５增至１．０ｍｇ／Ｌ时，原生质体的分裂频率由１２．８％提高到２８．４％，而当２，４Ｄ过高
（２．０ｍｇ／Ｌ）时反而会抑制细胞生长导致分裂频率降低。６ＢＡ、ＮＡＡ以及ＫＴ等对原生质体的分裂也均有较为
明显的影响，例如ＫＴ的加入有助于提高分裂频率（表１）。
在所试条件下以１．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ、０．２ｍｇ／Ｌ６ＢＡ 和０．２ｍｇ／ＬＫＴ组合中，分裂频率最高，平均达到
２８．４％。原生质体在培养２４ｈ后，体积增大并变成椭圆形。表明细胞壁已经合成，３～４ｄ出现第１次细胞分裂
（图２Ｂ），之后持续分裂。
２．３ 愈伤组织的形成及植株再生
原生质体培养２周左右即可形成小细胞团（图２Ｃ），小细胞团继续增殖，大约４周后形成直径２ｍｍ的肉眼
可见的小愈伤组织（图２Ｄ）。移至弱光下继续培养，愈伤组织能进一步形成淡黄色质地疏松的愈伤组织（图４Ａ）。
将愈伤组织置于 ＭＳ固体继代培养基上扩增，并移至光照条件下培养，愈伤组织可转变成淡黄绿色（图４Ｂ）。大
约经３周后将愈伤组织转到分化培养基上。在２５００ｌｘ光照下，培养２周后出现绿色芽点，继而有丛生芽形成
（图４Ｃ）。丛生芽继续长大到１～２ｃｍ高时，移入生根培养基，约１５ｄ有不定根出现，３周后形成完整植株（图
４Ｄ）。
３１１第１８卷第３期 草业学报２００９年
图４ 愈伤组织的形成和植株再生
犉犻犵．４ 犆犪犾狌狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犪狀犱狆犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀
Ａ：霸王原生质体来源的小愈伤组织 Ｍｉｃｒｏｃａｌｉｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆ犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿；Ｂ：霸王原生质体来源的绿色愈伤组织Ｃａｌｉｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆ犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿；Ｃ：霸王原生质体来源的愈伤组织的分化Ｓｈｏｏｔｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｅｒｉｖｅｄｃａｌｉｏｆ犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿；Ｄ：
霸王原生质体来源的再生小植株Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆ犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿
３ 讨论
原生质体分离是植物原生质体培养的第１步，直接影响着原生质体的成功与否。影响原生质体分离时的质
量和数量的因素主要包括取材、酶的种类及其组合、酶液的渗透压、原生质膜的稳定性、酶解时间与温度、分离与
纯化的方法等［２０］。
本试验以霸王愈伤组织为分离原生质体的试验材料，愈伤组织取材方便，不受时间、季节的限制，可常年供
应。酶的种类和浓度与霸王原生质体分离至关重要，为此选用了活性较强的纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶。这
是因为酶的组成与植物材料细胞壁的成分关系密切，对愈伤组织常用活性较强的酶，而且酶的浓度也大些［２１］。
组合（１）和（２）比较，半纤维素酶的加入，有利于霸王原生质体的分离（表２）；组合（２）与（３）比较，组合（３）中所获
得的原生质体产量最高达到２．３６×１０６ 个／ｇ鲜重，说明酶浓度过低时，会造成酶解不完全，降低原生质体得率，
较高的酶浓度能获得高产率的原生质体。组合（３）中得到的原生质体活力为８５％，略低于组合（２）中的９１％，这
是由于高的酶浓度，会对植物细胞的质膜产生一定的影响，降低原生质体的生理活性。综合考虑，组合（３）是以霸
王愈伤组织分离原生质体最佳的酶组合，获得的原生质体质量较高、数量最大。
除了酶外，在酶液中的渗透压稳定剂也是很重要的原生质体分离物质，它可以起到对原生质体的保护作用，
最常用的渗透压稳定剂是甘露醇和山梨醇［２２］。另外，加入ＣａＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４ 和ＭＥＳ可以提高原生质膜的稳定性，
增加完整原生质体的数目和活力［２０］。对于霸王的原生质体分离来说，甘露醇浓度过高或过低，原生质体产量均
较低，只有当浓度适当时，才能获得高质量、高产量的原生质体。
原生质体的起始培养密度对原生质体培养成功与否影响很大，原生质体无论是处于低密度还是高密度下，均
不易获得较高的分裂频率。只有处于适当密度的原生质体，才易于分裂。在本试验中霸王原生质体在所采用条
件下的最佳培养密度为２×１０５ 个／ｍＬ，此时其分裂频率可达２８．４％。细胞在分离、脱壁以前是一个统一的有机
体，彼此之间相互影响和协调。过低的培养密度使原生质体内涵物外渗而引起褐变，或仅分裂１次后即死亡；但
如果原生质体密度过高，大量聚集，彼此之间相互竞争营养，亦不能获得较高的分裂频率。大量的研究表明，物种
４１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
不同，原生质体的最适培养密度也不相同［１４，２３］。
高产优质原生质体的获得是原生质体培养成功的前提，但适合的培养基以及合适的植物生长调节物质是试
验获得成功的重要因素［２４］。本试验在同样的附加成分条件下比较了 ＭＳ、ＤＰＤ、Ｂ５３种基本培养基对霸王原生质
体培养的影响。结果表明，ＤＰＤ培养基中效果最佳，分裂频率达到了２８．４％。有报道表明播娘蒿（犇犲狊犮狌狉犪犻狀犻犪
狊狅狆犺犻犪）愈伤组织分离原生质体培养中，比较Ｋｍ８ｐ、ＭＳ、Ｂ５３种培养基培养效果，发现Ｂ５ 培养基比Ｋｍ８ｐ和 ＭＳ
培养基培养的原生质体分裂时间早，褐化程度轻，且愈伤组织的产量也相对较高，ＭＳ培养基的培养效果最差［２５］。
表明不同植物原生质体培养的最适培养基不同。
植物原生质体由于没有细胞壁的障碍，可以进行诱导融合，绕过有性不亲合障碍，实现远缘种间体细胞杂交。
原生质体可以摄取外源遗传物质，因而也是遗传工程比较理想的受体。霸王具有很强的耐旱性，是有待于开发的
抗旱基因资源。本试验对霸王进行原生质体游离和培养，并再生了植株。对影响其分离及培养的一系列因素进
行了探究。所提供的试验体系不仅为通过体细胞杂交基因转移等手段对其进行品质改良提供可行途径，也对其
他牧草植物的原生质体培养有一定的参考价值。
参考文献：
［１］ 中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志（第４３卷，第一分册）［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９８．１４０１４２．
［２］ 吴彩霞，周志宇，庄光辉，等．强旱生植物霸王和红砂地上部营养物质含量及其季节动态［Ｊ］．草业科学，２００４，２１（３）：３０
３４．
［３］ 杨鑫光，傅华，张洪荣，等．水分胁迫对霸王苗期叶水势和生物量的影响［Ｊ］．草业学报，２００６，１５（２）：３７４１．
［４］ 曾彦军，王彦荣，保平，等．几种生态因子对红砂和霸王种子萌发与幼苗生长的影响［Ｊ］．草业学报，２００５，１４（５）：２４３１．
［５］ 周向睿，周志宇，吴彩霞．霸王繁殖特性的研究［Ｊ］．草业科学，２００６，２３（６）：３８４１．
［６］ 张志勇，胡相伟．霸王的组织培养和植株再生［Ｊ］．植物生理学通讯，２００７，４３（３）：４９５．
［７］ 伍国强，席杰军，周向睿，等．一种改进的多浆旱生植物霸王叶和根总ＲＮＡ提取方法［Ｊ］．分子植物育种，２００８，６（１）：１９７
２００．
［８］ 宛涛，燕玲，史雪松，等．内蒙古驼蹄瓣属植物与其近缘种霸王遗传多样性的比较研究［Ｊ］．干旱区资源与环境，２００６，
２０（４）：２００２０３．
［９］ 郝瑞文，景建洲，李振勇，等．霸王基因组ＲＡＰＤ优化条件的建立［Ｊ］．中国沙漠，２００６，２６（２）：２８６２９０．
［１０］ 吴金霞，陈彦龙，何近刚，等．生物技术在牧草品质改良中的应用［Ｊ］．草业学报，２００７，１６（２）：１９．
［１１］ 谷俊涛，赵红梅，刘祝玲，等．农杆菌介导白三叶草高效遗传转化和转基因植株再生［Ｊ］．草业学报，２００７，１６（２）：８４８９．
［１２］ 舒庆艳，徐夙侠，金治平，等．ｍＲＮＡ差异显示技术分离羊草基因体外培养过程中特定基因及特性分析［Ｊ］．草业学报，
２００７，１６（５）：１１３１２０．
［１３］ 张改娜，王瑛华，王学仁，等．鹰嘴紫云英甲硫氨酸抗性系原生质体培养及植株再生［Ｊ］．分子细胞生物学报，２００６，３９（３）：
１９１１９８．
［１４］ 金红，贾敬芬，郝建国．草木樨状黄芪甲硫氨酸抗性系的原生质体培养及植株再生［Ｊ］．生物工程学报，２００４，２０（２）：２２１
２２６．
［１５］ 赵宏波，陈发棣．植物体细胞原生质体遗传转化研究［Ｊ］．西北植物学报，２００４，２４（７）：１３２９１３４１．
［１６］ 郝瑞文．农杆菌介导番茄和牛膝的遗传转化及霸王组培再生［Ｄ］．西安：西北大学硕士学位论文，２００５．
［１７］ ＭｕｒａｓｈｉｇｅＴ，ＳｋｏｏｇＦ．Ａｒｅｖｉｓｅｄｍｅｄｉｕｍｆｏｒｒａｐｉｄｇｒｏｗｔｈａｎｄｂｉｏａｓｓａｙｓｗｉｔｈｔｏｂａｃｃｏｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａ
ｒｕｍ，１９６２，１５：４７３４９７．
［１８］ ＤｕｒａｎｄＪ，ＰｏｔｒｙｋｕｓＩ，ＤｏｎｎＧ．Ｐｌａｎｔｅｓｒｉｓｓｕｅｄｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｄｅｐｅｔｕｎｉａ［Ｊ］．Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ，１９７３，６９：２６３４．
［１９］ ＧａｍｂｏｒｇＯＬ，ＭｉｌｅｒＲＡ，ＯｊｉｍａＫ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒｇｒｏｗｔｈｏｆｖｉｃｉａｈａｊａｓｔａｎａｃｅｌｓａｎｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｔｖｅｒｙｌｏｗ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｅｎｓｉｔｙｉｎｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，１９７５，１２６：１０５１１０．
［２０］ 许智宏，卫志明．植物原生质体培养和遗传操作［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９９７．１１１３．
［２１］ 孙勇如，安锡培．植物原生质体培养［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９１．５３５５．
［２２］ 孙敬三，朱至清．植物细胞工程［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００６．３８．
５１１第１８卷第３期 草业学报２００９年
［２３］ ＷｉｔｊａｋｓｏｎｏＲＥＬ，ＧｒｏｓｓｅｒＪＷ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆａｖｏｃａｄｏ（犘犲狉狊犲犪犪犿犲狉犻犮犪狀犪 Ｍｉｌ．）ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］．
ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，１９９８，１８：２３５２４２．
［２４］ ＮａｖｒａｔｉｌｏｖａＢ．ＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｃｕｌｔｕｒｅｓａｎｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｕｓｉｏｎｆｏｃｕｓｅｄｏｎＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ———ａｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，
２００４，３１（４）：１４０１５７．
［２５］ 姜淑慧，管荣展，董海滨，等．播娘蒿愈伤组织原生质体培养体系的研究［Ｊ］．草业学报，２００６，１５（４）：９４９８．
犘狉狅狋狅狆犾犪狊狋犮狌犾狋狌狉犲犪狀犱狆犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿
ＷＡＮＧＹｉｎｇｈｕａ１，２，ＣＨＥＮＧａｎｇ２，ＪＩＡＪｉｎｇｆｅｎ１，ＨＡＯＪｉａｎｇｕｏ１
（１．ＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ７１００６９，Ｃｈｉｎａ；
２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＺｈａｏｑｉｎｇＵｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｏｑｉｎｇ５２６０６１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆ犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿 ｗａｓ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｆｒｉａｂｌｅｃａｌｉｉｎｄｕｃｅｄｆｒｏｍｓｅｇｍｅｎｔｓｏｆｃｏｔｙｌｅｄｏｎｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｉｓｏｌａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈ
ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉａａｎｄｐｌａｔｉｎｇｄｅｎｓｉｔｉｅｓｏｎｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｄｉｖｉｓｉｏｎｓａｎｄｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒ
ａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄｃｅｌｄｉｖｉｓｉｏｎｓａｎｄｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｍｔｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆ犣．狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿ｗｅｒｅ
ｏｂｔａｉｎｅｄｂｙａＤＰＤｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１．０ｍｇ／Ｌ２，４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（２，４Ｄ），０．２ｍｇ／Ｌ６ｂｅｎｚｙｌ
ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ（６ＢＡ），０．２ｍｇ／Ｌｋｉｎｅｔｉｎ（ＫＴ），０．５ｍｏｌ／Ｌｍａｎｎｉｔｏｌ，５００ｍｇ／Ｌｃａｓｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ａｎｄ２％
（Ｗ／Ｖ）ｓｕｃｒｏｓｅａｔａｐｌａｔｉｎｇｄｅｎｓｉｔｙｏｆ２×１０５／ｍＬ．Ｔｈｅｄｉｖｉｓｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙｗａｓ２８．４％．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓ
ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｈｅｎｔｈｅｓｅｃａｌｉｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏＭＳｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡａｎｄ０．５ｍｇ／Ｌ
（ＮＡＡ）．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犣狔犵狅狆犺狔犾犾狌犿狓犪狀狋犺狅狓狔犾狌犿；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｃｕｌｔｕｒｅ；ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
６１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３