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Study on Callus Induction and Brown Stain Prevention Techniques of Some Sympodial Bamboo Species

几种丛生竹愈伤组织诱导与防褐变技术研究



全 文 :林业 科学 研究  巧 , !∀ ! # ∃ %& ∋ % (
)∗ +,− . / ,0 , 1 +2 3
文章编号 ∃ !4# 5一!6 ∀( 4 拓 #4 !7# %&很
几种丛生竹愈伤组织诱导与防褐变技术研究
顾小平 , 苏梦云 , 岳晋军 , 吴晓丽
中国林业科学研究院亚热带林业研究所 , 浙江 富阳 0 85 6 4# #
摘要 ∃利用小佛肚竹 、凤尾竹和孝顺竹幼竹的茎尖和带节茎段研究了愈伤组织诱导和控制褐变的方法 。 试验结果表
明 ∃在 0 种生长调节剂 , 6 一9 、7: 、 ;< = #的组合中 , 以  , 6 一9  ∋ 0 > ? · ≅ 一 ’#效果最好 , 愈伤组织的诱导率最高 , 大
部分外植体都能诱导出愈伤组织 , 生长良好 Α , 6 一9  > ? · ≅ 一 ’ 十 7: ∗ Β & > ? · ≅ 一 ’能使部分茎段诱导出愈伤组织 , 而
茎尖诱导的愈伤组织水渍化 , 易褐变 Α7: 6 >? · ≅ 一’能使个别茎段有愈伤组织产生 , 但易褐化 Α 7 : 6 > ? · ≅ 一 ’ Χ ;< =
4 Β & 毗 · ≅ 一 ’能诱导出愈伤组织 ,但生长缓慢。 添加抗氧化剂控制愈伤组织褐变的效果要优于吸附剂 , 其防褐化能
力 ∃抗坏血酸 & > ? · ≅ 一 ‘# Δ 半胧氨酸!4 > ? · ≅ 一 ’# Δ ΕΦ Ε ! ∀ · ≅ 一 ’# Δ 活性炭! ∀ · ≅ 一 ’# 。 在培养基中加人抗
坏血酸& > ? · ≅ 一 ’ # , 使小佛肚竹 、 凤尾竹、孝顺竹的茎尖和茎段的褐变率分别比对照下降了 &! Β 0 Γ 、 60 Β 0 Γ 、
0Η Β ( Γ 和 Η % Γ 产 Β % Γ 、04 Β ( Γ 。 外植体在无菌水或半胧氨酸5 ∗ >? · ≅ 一 ’#溶液中浸泡  ∋ 6 3 也有利于控制
褐化 。 暗培养有利于愈伤组织生长 , 对控制褐化也有一定作用 。
关键词 ∃丛生竹 Α愈伤组织 Α褐变控制
中图分类号 ∃ &% ∀& 文献标识码 ∃ =
Ι加勿 ∗ ϑ Κ 15 5Λ− ;ϑΜ Λ 2 .Ν ∗ ϑ 1ϑΜ < + ∗ Ο ϑ Ι.1Ν ϑ Ε + , Π,ϑ.Ν ∗ ϑ : , 2 3城Θ Λ , − ∗ 8
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7 ,Ρ Ο∗ + Μ− ∃ −卿Ε∗ Μ Ν15 <1> Σ ∗ ∗ Α , 15 5Λ − Α Σ+∗ Ο ϑ − .1 Νϑ , ∗ ϑ .+∗ 5
收稿日期 ∃
基金项目 ∃
资助项 目内容
作者简介 ∃
佣& 一!  (
国家自然科学基金 4 0一 4 & 年 ,项目编号 ∃ 0 4 %! 4∀ ∀# 和浙江省 自然科学重点基金  4 0一4 & 年 , 项目编号 ∃ Ζ= 4 46 #
顾小平!∀& ∀一# , 男 , 浙江杭州市人 , 博士 , 研究员 Β
% Η 林 业 科 学 研 究 第 !∀ 卷
竹子是热带 、亚热带地区的重要经济植物 , 随着
国民经济的迅猛发展 , 对竹子多方位的全面开发与
持续发展提出了更高 、更新的要求 。 近年来尽管竹
类植物的组培研究受到重视⎯ ’网 」, 但对于竹子遗传
改良方面的研究还相当薄弱 , 尤其是基因工程育种
才刚开始起步 。 组织培养是基因工程育种的基础 ,
愈伤组织诱导和体细胞胚胎再生植株已成为竹子遗
传改 良的技术关键 。 在组织培养过程中 , 外植体尤
其是愈伤组织极易产生褐变 , 若处理不当 , 常导致组
织死亡 组培失败 ⎯’, , ! 。 因此 , 如何防止或减少外植
体特别是愈伤组织产生褐变 , 是竹子组培研究必须
关注的问题之一 。 本文 以几种丛生竹为试验材料 ,
研究愈伤组织诱导及防止褐变的方法 , 以期为后续
研究奠定基础 。
! 材料与方法
! Β ! 供试外植体
外植体选自中国林科院亚热带林业研究所竹类
苗圃中的孝顺竹<1 > ΣΛ− 1 > 以.Ν5江欲 肠Λ+ # / 1, Λ− ⊥
, 3,5 , ] Ι, 3Λ 5.Β 8Β # 、 凤 尾竹 < Β > 嘛加阮 Π 1+ Β ϑ1 ϑ 1
!!∗ ] Σ一 7 , ϑ ? ≅ 召Β ϑ1 ϑ1 / ∗ ] Σ Β ## 和小佛 肚竹
召Β , ϑ , Α乞2∗ −。 Υ, , 5Λ +, #的当年萌生幼竹 。
! Β  外植体消毒
采来的外植体先用自来水冲洗 , 去除表面泥土
和灰尘 , 然后细心地剥去竹捧 , 剪取长约 ! Β & ∋  Β 4
2 > 带节的嫩茎段或茎尖 。 用 甲Κ Ζα , ∴α # β %& Γ 溶
液处理 ! > Νϑ , 再在 ! ∀ · ≅ 一 ’升汞溶液 中处理 !4
吸干沾在茎段上的水分 , 取其茎尖及嫩茎节上方 !
∋  > > 茎截断 , 分别接种于各种培养基中。
! Β 0 培养基
以 Ο ΕΥ 〔Η〕为诱导愈伤组织的基本培养基 , 含水
解酪蛋白 一? · ≅ 一 ’ , 糖  & ∀ · ≅ 一 ’ , 琼脂 % Β & ∀ · ≅ 一 ’ ,
Ψα & Β ( , 温度 & ℃ 士  ℃ , 添加不同生长调节剂后 ,
设定以下 & 种诱导培养基 ∃ !# Ξ ΕΥ Χ  , 6 一9  > ?’
≅ 一 ‘ Α  #Ο ΕΥ Χ  , 6 一9 0 > ? · ≅ 一 ’∃ 0 #Ξ Ψ Υ Χ  , 6 一9
 > ? · ≅ 一 ’ Χ 盯 4 Β & > ? · ≅ 一 ’ Α 6 #Ο ΕΥ Χ 盯 6 > ?
· ≅ 一 ’ Α & #Ξ ΨΥ Χ 7: 6 > ? · ≅ 一’ Χ ;<= 4 Β & > ? ·
≅ 一 ‘ 。 每个处理 !4 瓶 , 每瓶接 6 个外植体 。
! Β 6 防揭变处理
! Β 6 Β ! 外植体预处理 将经过冲洗剪切 ! Β & ∋  Β 4
2 > 带节的嫩茎段或茎尖分别用无菌水 、半耽氨酸溶
液 !4 > ? · ≅ 一 ’#浸泡和流水冲洗 。、 、6 3 处理 。
! Β 6 Β  抗氧化试验 在培养基中分别添加抗坏血
酸 & > ? · ≅ 一’# 、半胧氨酸!4 > ? · ≅ 一 ’# 、ΕΦ Ψ ! ∀
· ≅ 一 ’# 、活性炭! ∀ · ≅ 一’#及不添加任何抗氧化物
质和吸附剂的处理 。
! Β 6 Β 0 不 同光 强度培养试验 设光强 度 (4 、
 创」∗ 3 和暗培养 0 种处理 。
防褐变处理的 0 种试验 , 也都按每处理 !4 瓶 ,
每瓶接 6 个外植体设计 。
 结果与分析
 Β ! 不同生长调节剂对愈伤组织诱导的影响
不同生长调节剂诱导愈伤组织的情况见表 ! 。
> Νϑ ,用无菌水冲洗 6 ∋ & 次 , 漓干水 , 并用无菌滤纸
表 ! 不同生长调节剂对小佛肚竹 、凤尾竹和孝顺竹愈伤组织的诱导
生长调竹剂 小佛肚竹 凤尾竹 孝顺竹
, 6 一9 一. > ? · ≅ 一 5
外植体诱导出白色愈伤组织较快 。 茎段诱
导的愈伤组织光滑 、颖粒状 , 继代后部分愈 部分外植体能诱导出愈伤组织 ,
伤组织块揭化 Α茎尖诱导的愈伤组织柔软 、 乳白色易揭变 , 茎段愈伤组织呈
水渍化 , 易褐变 。 但可 以从少数褐化的愈 颗粒状 , 而茎尖水渍化 。
伤组织块中重新长出乳白色愈伤组织
茎尖开始水溃化 , 很快诱导出愈伤
组织 , 乳白色 , 继代后部分愈伤组织
褐化 , 茎段产生颗粒状愈伤组织 , 生
长缓慢 , 易褐化 。
 , 6 一9 , 叱 · ≅ 一 5 基本同  , 6 一9 Ζ >? · ≅ 一 ‘处理状况 。 大部分茎尖和茎段能诱导 出愈伤组织 , 生长良好 。
与  , 6 一9 Ζ>? · ≅ 一 ‘处理状况相同 。
茎尖愈伤组织继代后易褐化 , 并脆。
 , 6 一9 三> ‘ · ≅ 一 ’ 十 茎尖愈伤组织水渍化 , 易褐化 , 少数茎截段
7’+ 4 Β & 4 ∀ · ; 一 ‘ 易诱导出白色愈伤组织 , 易褐变 。
茎尖愈伤组织水渍化 , 极易褐
化 Α 少数茎截段能诱导愈伤组
织 , 易褐变 。
茎尖愈伤组织水渍化 , 易褐化 ,
个别茎截段有愈伤组织发生 , 生
长缓慢 , 易褐变。
茎尖愈伤组织水渍化 , 易褐化 , 部
分茎截段能诱导出愈伤组织 , 乳
白色 、颗粒状生长缓慢 , 易褐变。
茎尖愈伤组织水渍化 , 易褐化 Α 部分
茎截段能诱导出愈伤组织 , 乳白色
颗粒状 , 但褐变严重 。
7: 6 + 乞杯 · ;Ω 茎尖愈伤组织水渍化
, 易褐化 , 茎截段少数
诱导出白色粒状愈伤组织 , 生长缓慢 。
茎尖愈伤组织水渍化 , 易褐化 , 个别
茎截段能诱导出愈伤组织 , 生长缓

7: 6
;< = ∴ #嘴 ‘‘ 川 ?
; 一 5
≅ 一 5
茎尖水渍化 , 易褐化 , 大部分茎截段能诱导
出愈伤组织 , 易褐化 , 生长缓慢 。
大部分茎尖有愈伤组织产生 , 脆 , 易
揭化 Α个别茎截断有愈伤组织出现 ,
生长缓慢 。
第 ! 期 顾小平等 ∃几种丛生竹愈伤组织诱导与防褐变技术研究
对小佛肚竹 、凤尾竹和孝顺竹来说 ,  , 6 一9 是较
适合诱导愈伤组织的主要生长调节剂 , 出愈率较高 ,
生长良好 , 其茎段诱导的愈伤组织呈白色或乳白色 ,
颗粒状 , 而茎尖诱导的愈伤组织白色 、柔软 、水渍化
图 ! ∋ Η # , 诱导出的愈伤组织极易从上部开始褐
化图 % # ,但少数小佛肚竹茎尖诱导的愈伤组织褐
化后 , 还可以见到从褐变的愈伤组织中重新长出乳
白色的愈伤组织图 ( # Α在  , 6 一9 Χ 7: 和 7: 的培
养基中 , 茎尖基本水渍化 , 茎段愈伤组织诱导率也极
低 , 多褐变 Α7: Χ ;< = 的培养基能诱导 出愈伤组织 ,
但生长缓慢 , 易褐变 。
图 ! ∋ 0 茎尖诱导的愈伤组织 , 水渍化 Α图 6 ∋ Η 分别为风尾竹 、小佛肚竹 、孝顺竹茎段诱导的愈伤组织 Α
图 % 开始褐化的愈伤组织 Α 图 ( 从褐化的愈伤组织中分化出新的愈伤组织
 Β  几种防揭化措施对外植体褐变的影响
外植体的褐化主要是由酚类化合物氧化成相应
的醒类物质引起的 。 在含有  , 6 一9 0>? · ≅ 一 ’的培
养基中 , 添加一些防酚类氧化的物质或对外植体采
取适当的预处理及控制光强度等措施 , 在一定程度
上能阻止或减缓外植体的褐变 。
 Β  Β ! 外植体预处理的防揭 变效果 外植体在剥
去竹等后分别在 !4 倍体积的无菌水或半耽氨酸
5 ∗ >? · ≅ 一 ’#溶液中浸泡或流水冲洗  、6 3 , 然后
按正常操作程序灭菌后接种到添加抗坏血酸& > ?
· ≅ 一 ’#的培养基中 , 也有一定的防褐变效果 。 由于
处理  、6 3 的结果差异不大 , 所以表  中只列了处
理 6 3 的试验结果 。
从表  可以看出 ∃ 0 种处理对降低小佛肚竹 、
凤尾竹 、孝顺竹茎尖外植体的褐变率有一定的作
用 。 以半胧氨酸!4 4 > ? · ≅ 一 ‘#浸泡的效果较明
显 , 褐 变 率 分 别 从 对 照 的 Η Β & Γ 、 &4 Β % Γ 和
 ( Β  Γ 下降到 !Η Β ( Γ 、6  Β ( Γ 和 ! Β Η Γ , 对茎段
外植体也有一定作用 。 无菌水浸 泡 和流水处理
之间无明显差异 。
表  外植体预处理对 0 种丛生竹的防祖化效果比较
褐变率χ Γ
处理 凤尾竹
6 !
小佛肚竹
茎尖 茎段
∀  # ∃ ∃ %
∀& # ∃ # 
∋ # ( ∃ # %
 # % ∀ ∀ # (
孝顺竹
茎段 茎尖 茎段
半耽氨酸 )∗ + ,−. · / 一 ’0浸泡
无菌水浸泡
流水冲洗
12
( ∀ # ! ∀ # 
( # %
击人一345!茎一( %∋
& ( # ∋ ∀ # ∃
! ( # ∋ ∃ #
# # 防酚氧化物质时外植体揭化的缓解作 用
在培养基中 , 分别添加抗坏血酸 )% 6. · / 一 ’0或半
胧氨酸 )∗ ∋ 6 . · / 一’0对外植体有明显的防褐变效
果 。 就小佛肚竹来看 7茎尖和茎段的褐化率分别从
对照的 %( # % 8 和 %∋ # ( 8 下降到  # % 8 、 9% # ∋ 8 和
∀ ∃ #  8 、 ∃ # % 8 。 防褐化效果 7抗坏血酸 : 半胧氨酸
: ;< ; , 活性炭效果不明显 。 对凤尾竹和孝顺竹的
诱导也表现出同样结果 )表 9 0 。
林 业 科 学 研 究 第 !∀ 卷
裹 0 防栩化物质对 0 种丛生竹的效果比较
褐变率χ Γ
处理
抗坏血阶 & >? · ≅ 一 ’#
半胧氮酸χ  5∗ >? · ≅ 一 ’#
ΨΠ脚! ∀ · ≅ 一 5 #
活性炭 χ 5 ‘ · ≅ 一 ’#
Κ7
小佛肚竹 风尾竹 孝顺竹
茎尖 茎段 茎尖 茎段 茎尖 茎段
 Η Β & !( Β Η & ! Β Η 6 (  ( Β ( ∀ Β Η
0 & Β 4  ( Β & && Β ! 6& Β 6 0  Β & 0 4 Β 6
& 4 Β Η 6 & Β & (& Β 0 % 4 Β ( 6 ! Β 6 0 ∀ Β 
&  Β % 6 ( Β  ∀4 Β  % & Β Η 6& Β  6 ! Β Η
&6 Β & &4 Β 6 ∀ ! Β 4 % ( Β  6& Η 6  Β (
 Β  Β 0 光照对外植体揭变的影响 暗培养或在弱
光下培养 , 可以部分降低外植体的褐变率 , 以小佛肚
竹较为明显 。 暗培养和在弱光(加 3 #下培养的茎
尖和茎段的揭变率从强光  以洲# 3 #下培养的
  Β Η Γ 和 ! Β &Γ 分别 下降到 !∀ Β 4 Γ 、 ∀ Β  Γ 和
! Β &Γ 、 !4 Β 6 Γ 。 孝顺竹和凤尾竹的褐变率也有不
同程度的下降表 6 # 。
衰 6 先服对0 种丛生竹外桩体栩变的形响
褐变率χ Γ
处理光照强度χ 玩 小佛肚竹 风尾竹 孝顺竹
茎尖 茎段 茎尖 茎段 茎尖 茎段
 《 旧  Β Η δ  Β & 6Η Β 6 6 6 Β &  6 Β 4  Η Β Η
(  #  ! Β & !4 Β 6 闷6 Β  6 0 Β Η  Β 6 6 Β 6
ε;音 !∀ Β 4 ∀ Β  6 0 Β 4 6 ! Β 6  ! Β &  6 Β 4
一抗坏血酸& 呢 · ≅ 一‘#有明显降低褐变效果 ,这与
木兰科 Υ1?ϑ ∗5Ν 12 , 1, #树种的结果相同.’“·川 , 半胧氨
酸和 ΕΦ Ε 也能降低外植体褐化 , 这与马来甜龙竹
石坛爪如叱。阮∋ 似那 + Ι2 3Λ5. Β 8Β #<12 _, + ,、 α ,邓 , #⎯’φ和龙竹9Β ? 5? 1∋ Υ∋ #闭的研究结果相似 , 但活性炭的防褐变效果不明显 。 外植体在半胧氨酸溶液
5 ∗ >? · ≅ 一 ’#或无菌水中预处理  ∋ 6 3 ,也能减少
外植体褐变 , 这主要是外溢的酚类物质得到及时扩
散 ,从而减轻了危害 。 外植体暗培养或在弱光下培养
也有一定的防褐变效果 , 这是因为在黑暗的条件下 ,
一些光诱导参与酚类合成和氧化的酶活性减弱 , 导致
酚类合成减少 , 其氧化产物醒类也相应减少 , 使褐变
得到一定程度的控制川 。 如果把外植体预处理 、抗氧
化剂和暗培养三种措施结合起来 , 预计会取得更好的
防褐变效果 。
0 讨论
在竹子 组织培养中常用  , 6 一9 Χ 7: 组合和
γ== Χ <= 组合来诱导愈伤组织 , 已有不少成功报
道川 。 本试验中采用  , 6 一9  ∋ 0 > ? · ≅ 一 ‘#能很
好地诱导茎尖和茎段产生愈伤组织 。 茎尖的初代愈
伤组织为白色 、水演化柔软组织 Α茎段初代愈伤组织
为浅黄色 , 颗粒状 , 生长 良好 ∃说明  , 6 一9 是比较适
合丛生竹诱导愈伤组织的生长调节剂 。
外植体褐变主要是在培养过程中酚类化合物溢
出 , 很快在多酚氧化酶的催化下氧化成褐色的醒类物
质和水 ,而酿类物质进而在酪氨酸酶等的作用下 , 与
外植体组织中的蛋白质发生聚合 , 导致组织代谢活动
紊乱 ,最终衰老死亡【% ,(φ 。 有关植物组织培养中的褐
变问题已有很多研究 ⎯’,4φ , 在培养基中添加抗氧化剂
参考文献 ∃
〔5φ 吴益民 Β 当前竹子的组织培养和植株再生研究【Ω5 Β 竹子研究汇
刊 , !∀ ∀ , !( !# ∃ 0  ∋ 0%
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Μ毗∋ ∗+ 5∗ Ο 5, Π日 ∗8 Ν∋ 5Ν1ϑ 2, ⎯ Ωφ Β Ωα ∗ +. Ι2 Ν , !∀ ∀4 , Η & ∃ !40 ∋
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