全 文 ：林业科学研究　2005, 18 (5) : 641～封三
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2005) 0520641203
一种有效的蚜虫基因组 DNA提取方法
杨子祥 , 冯 　颖 3 , 陈晓鸣
(中国林业科学研究院资源昆虫研究所 ,云南 昆明　650224 )
关键词 :蚜虫 ;基因组 DNA;提取方法
中图分类号 : Q523　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2005203215
基金项目 : 国家科技部基础性资金项目“资源昆虫种质资源收集、整理、保存”(192)的部分内容
作者简介 : 杨子祥 (1968—) ,男 ,贵州安顺人 ,高级工程师 ,在读博士生 13 通讯作者 :冯　颖 ,研究员 , E - mail: yingf@263. com
An Effective M ethod for Extraction Genom ic D NA from Aph ids
YANG Z i2xiang, FENG Ying, CHEN X iao2m ing
( The Research Institute of Resource Insects, CAF, Kunm ing　650224, Yunnan, China)
Abstract:Aphid is a group of small insects in the Homop tera. There are app roximately 4 000 aphid species all over the
world. Many of them attack important agricultural crop s and therefore have econom ic importance. However, some species
such as Chinese gallnut aphids are beneficial for human beings. Most aphids disp lay comp lex life cycles with alternation of
sexual and asexual generations and host p lant alternation. Molecular genetic markers have good stabilities, high variability
and mostly are free from environmental influences. So they were very suitable for aphid research and could tackle some
p roblem s which the traditional taxonom ical methods could not solve. The paper introduced a simp le and effective method
that could extract genom ic DNA from a single aphid individual and could be used for the research of molecular genetic
marker such as RAPD, RFLP and DNA sequence determ ination.
Key words: aphid, genom ic DNA, extraction method
蚜 虫 属 于 同 翅 目 ( Homop tera ) 蚜 总 科
(Aphidoidea)和球蚜总科 (Adelgoidea) ,世界上已知
种类为 4 000多种 [ 1 ] ,我国已报道的种类 1 000余
种 [ 2 ]。蚜虫大多数是害虫 ,它们刺吸植物汁液 ,直接
影响植物生长 ,同时间接传播病毒病害 ,造成农业上
的损失 ,如棉蚜 (Aphis gossypii Glover)、麦长管蚜
(M acrosiphum avenae ( Fabricius) )等 ;少数种类如五
倍子蚜 (Sch lech tenda lia ch inensis (Bell) )是重要的资
源昆虫 ,具有较高的经济价值 [ 3 ]。蚜虫身体微小 ,形
态变异大 ,生活习性复杂 ,并具有多型多态现象 ,研
究它较为困难 ,尤其是在分类和鉴定、近缘种的识别
等方面 ,传统的研究方法往往难以发挥作用。近年
来 ,应用分子遗传标记技术 ,从 DNA水平上研究蚜
虫的分类和生物学特性 ,日益受到蚜虫研究者的重
视 ;与形态学等基因表达型的特征相比 ,分子遗传特
征是更本质的特征 ,其变异只来源于 DNA系列的差
异 ,具有稳定性高、受环境条件影响小 ,信息含量丰
富等优点 ,非常适合于蚜虫的研究 [ 4 ]。要从分子水
平研究蚜虫 ,首先面临的问题就是基因组 DNA的提
取 ,特别是个体微小的单头蚜虫 DNA的提取 ,因此
寻求简便、快速、有效的蚜虫 DNA的提取方法 ,对于
蚜虫分子生物学研究具有重要的意义。
自上世纪 80年代以来 ,研究人员对小型昆虫基
因组 DNA的提取方法进行了不断的探索和改进。
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 18卷
Boyee借鉴植物 DNA的提取方法 ,采用 CTAB法提
取松树皮象 ( P issodes strobi Peck ) 的 DNA; B lack
IV [ 5 ]采用了匀浆法提取蚜虫基因 DNA 并用于
RAPD扩增 ,取得了很好的效果。田英芳 [ 6 ]等参照
Marchant(1988)蝗虫基因组 DNA提取方法 ,综合了
其他方法的优点 ,建立了一种简易的昆虫基因组
DNA的提取方法 ,但该方法以蟋蟀、天牛、蝗虫等为
材料 ,未涉及微小昆虫 ;杨效文 [ 7 ]在烟蚜 (M yzus per2
sicae ( Sulzer) )的研究中采用加入两种提取液的方
法 ,安瑞生等 [ 8 ]对这种方法作了改进 ,以后的蚜虫研
究人员大多采用这种方法。
作者在五倍子蚜虫研究中尝试和比较了 B lack
IV、田英芳和杨效文的提取方法 ,并以田英芳的方法
为基础 ,对部分步骤作了改进 ,改进的方法能快速、
有效地提取单头蚜虫的基因组 DNA ,满足 RAPD分
子标记和 DNA序列测定等研究的需要。本方法也
适用于同翅目其他微小昆虫 (如介壳虫 )基因组
DNA的提取。
1　材料和方法
111　材料
五倍子蚜虫为新鲜或乙醇浸泡标本 ,包括角倍
蚜 (Sch lech tenda lia ch inensis Bell)、倍蛋蚜 ( Sch lech t2
enda lia peitan Tsai et Tang)、倍花蚜 (N urudea sh ira ii
Matsumara)、肚倍蚜 ( Kaburag ia rhusicola Takagi)和
肚倍枣铁亚种 ( Kaburag ia rhusicola ensiga llis Tsai et
Tang)等。2004年 6—11月采于四川峨嵋、陕西西
乡、云南禄丰和昆明等地 ,收集有翅或无翅蚜 ,无水
乙醇浸泡 , - 20 ℃保存。
112　试剂及溶液
(1)匀浆缓冲液 :按 8份 A液、1份 B液和 1份
C液配制 ,现配现用。
A液 : Tris2Base 0. 05 mol·L - 1 , NaCl 0. 1 mol·
L - 1 , EDTA 0. 1 mol·L - 1 ,调节 pH值为 7. 6,高压灭
菌后备用 ;
B液 : 5%的 SDS;
C液 : 2 mg·mL - 1的蛋白酶 K ( 40 U ·mg- 1 ,
Merck产品 ,上海华舜分装 ) , - 20 ℃保存。
(2) Tris2平衡酚 (天津灏洋公司 ) ,氯仿 ∶异戊
醇 (24∶1) ,无水乙醇及 70%乙醇。
113　主要仪器
UVP GDS28000凝胶成像分析系统 ,含 LabWork
4. 0图像分析软件分析 (基因公司 ) , PTC2200智能
PCR仪 (美国 MJ Research) ,台式高速离心机 (德国
Herm le) , ESP 300电泳仪 (上海天能 )。
114　提取步骤
(1)洗涤 　取新鲜或无水乙醇浸泡的单头蚜
虫 ,置于无水乙醇、双蒸水中依次漂洗 ,吸水纸吸干。
(2)研磨 　将蚜虫转至 1. 5μL - 1的离心管中 ,
加入 100μL - 1匀浆液 ,用与离心管配套的组织捣碎
棒充分研磨 ,直至虫体完全破碎 ; 组织捣碎棒用
500μL匀浆液冲洗。
(3)水浴 　45 ℃水浴 1～ 3 h,中途取出混匀 2
～3次 ,直至混合液清亮为止。
(4)酚抽提 　在通风柜中操作 ,在混合液中加
入 600μL的平衡酚 , 7 000转离心 10 m in,用大口径
枪头取上清液至另一干净的离心管中。
(5)氯仿 ∶异戊醇抽提 　在通风柜中操作 ,在
上清液中加入 550μL氯仿 ∶异戊醇 ( 24∶1) ,缓慢
颠倒数 10次 , 8 000转离心 10 m in,用大口径枪头取
上清液至另一干净的离心管中。
(6) 沉淀 DNA　加入 1 000μL冷无水乙醇 (预
先放置于 - 20 ℃冰箱中 )沉淀 DNA, - 20 ℃度冰箱
内放置 30 m in以上 ; 12 000转离心 10 m in,小心倾去
上清液。
(7)洗涤 DNA　在留有 DNA沉淀的离心管中
加入 500μL冷的 70%乙醇 (预先放置于 - 7 ℃冰箱
内 ) , 12 000转离心 10 m in,小心倾去上清液。
(8)干燥和溶解 　将离心管倒扣在干净的餐巾
纸上 ,自然干燥后 , - 20 ℃冰箱内保存。使用时每
管加入 20μL的双蒸水充分溶解。
115　D NA样品检测
采用 1%的琼脂糖 ,点样孔宽 3 mm,上样量 1. 5
μL·孔 - 1 , 88 V ( 4 V·cm - 1 ) ,电泳时间 70 m in;电
泳完毕后 , EB染色 ,在紫外灯下照相、检测和分析。
2　结果与讨论
作者首次将田英芳介绍的方法应用于蚜虫基因
组 DNA的提取 ,并针对蚜虫个体微小、体表常有蜡
质的特点 ,对部分步骤作了改进 :
(1)匀浆缓冲液的 pH值有一个变动范围 ( 7. 0
～ 8. 0) ,不同昆虫适应于不同的 pH值 [ 6 ] ;对蚜虫而
言 , pH值为 7. 6时 ,效果最好。
(2)匀浆缓冲液分两次加入 ,确保研磨的充分 ,
减少 DNA的损失。
(3)将水浴的温度从 37 ℃提高到 45 ℃,增加蛋
246
白酶 K的活性 ,节省了时间 ,减少了 DNA的降解。
(4)减少平衡酚的抽提次数 ,提高了 DNA的得率。
与目前蚜虫研究中采用较多的冰冻 (或液氮冷
冻 )后用牙签捣碎虫体相比 ,本方法采用组织捣碎棒
研磨破碎虫体 ,无需冰冻 ,在常温下即可操作 ,简化
了操作步骤 ,并可使研磨更为充分和彻底。
从图 1可以看出 ,用本方法提取单头蚜虫的
DNA ,谱带整齐 ,无拖尾 ,产量和质量都比较稳定 ,
DNA结构较为完整 ,经与 λDNA的比较分析 ,所提
取的 DNA 片段大小约为 48 kb,每头蚜虫提取的
DNA 约为 1. 5μg,可以满足蚜虫分子生物学研究的
需要。用本方法提取的 DNA进行 RAPD随机引物
PCR扩增 ,也取得了很好的效果 (图 2)。
图 1　4种倍蚜虫基因组 DNA的电泳
1%琼脂糖 , 88 V (4 V·cm - 1 ) , 70 m in ; M:标准分子量
(Marker) ; J1、J2:角倍蚜 ; Z1:肚倍蚜枣铁亚种 ; D1:肚倍
蚜 ; BH:倍花蚜 ; A1:λDNA, 100 ng·μL - 1 ; A2:λDNA,
150 ng·μL - 1
用本法提取的 DNA,在电泳检测时有时会出现
拖尾或 RNA带 ,这是由于少量 DNA或 RNA降解所
致。RNA对 PCR扩增一般没有影响 ,如果想去除
RNA ,可在 DNA溶解液中加入 RNAase,一般每管加
1μL (10 mg·μL - 1 ) ,处理 1 h以上 ,可以有效地去
除 RNA。如果不立即实验 ,也可将 DNA溶液置于 4
℃冰箱内 ,让 RNA自然降解。
真核生物的 DNA提取方法虽然很多 ,但其原理
和步骤基本相同 ,即 :破碎细胞 ,在 EDTA存在的情
况下 ,用蛋白酶 K消化细胞或组织 ,用去垢剂如 SDS
溶解细胞膜并使蛋白质变性 ,再用各种有机溶剂如
酚、氯仿等纯化 DNA。其中破碎细胞是关键步骤 ,
图 2　4种五倍子蚜虫的 RAPD随机引物 PCR扩增
2%琼脂糖 , 88 V (4 V·cm - 1 ) , 80 m in ;引物 : S118, 0. 2
OD,上海生工 ;M:标准分子量 (Marker) ; J1:角倍蚜 ; D1:
肚倍蚜 ; B1: 倍蛋蚜 ; Z1: 肚倍蚜枣铁亚种 ; CK: 对照
( ddH2O)
研磨是否充分将直接影响 DNA 提取的量和纯
度 [ 9, 10 ] ,对于蚜虫而言 ,还需考虑如何破碎其外骨
骼。另外 ,在提取过程中 , DNA 会受到各种因素的
影响而降解 ,因此应预先准备好试剂和材料 ,合理安
排实验步骤 ,及时操作 ,减少停留时间。
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