全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
林业科学研究　2008, 21 (3) : 391～396
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2008) 0320391206
川西南 13种报春花属植物亲缘关系的 RAPD分析
潘远智 1, 2 ,庞　博 2 ,孙振元 13 ,陈　强 2
(1. 中国林业科学研究院林业研究所 ,国家林业局林木培育重点实验室 ,北京　100091;
2. 四川农业大学林学园艺学院 ,四川 雅安　625014)
摘要 :利用 RAPD标记对采自四川西南的龙池、康定、木格措和理塘等地的 13种报春花属植物亲缘关系进行了分
析。结果表明 : 28个引物从 85份材料中共扩增出 250条 DNA带 ,大小约为 130～1 800 bp,每个引物可扩增 4～15
条 ,平均扩增 9条 ,其中多态性带为 209条 (8316% ) ;材料间平均遗传距离为 01660 2;采用 UPGMA法可将供试材料
聚为 4类 ,除中甸海水仙、雅砻粉报春、卵叶报春和高穗花报春各自聚在一起外 ,其余种均不能完全区分开。研究结
果更支持将偏花报春归为灯台报春组 ,而粉报春组和脆蒴报春组均与其它报春组间差异较明显。聚类可以区分龙
池居群与康定、木格措和理塘居群 ,但不能区分后三者 ,可见不同生态地理类型对报春花遗传多样性影响较大。
关键词 :报春花属 ;遗传距离 ; RAPD;亲缘关系 ;遗传多样性
中图分类号 : S682. 1 + 5　　　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2007212204
基金项目 : 四川省教育厅基金项目 (2005A002)
作者简介 : 潘远智 (1969—) ,男 ,四川达县人 ,副教授 ,主要从事园林植物栽培与育种研究.3 通讯作者 Author for correspondence, E2mail: sunzy@ caf. ac. cn
Phylogenetic Rela tion sh ip Ana lysis am ong 13 Spec ies of P rim u la L.
in South2west S ichuan Using RAPD M arker
PAN Yuan2zhi1, 2 , PANG B o2 , SUN Zhen2yuan13 , CHEN Q iang2
(1. Research Institute of Forestry, CAF; Key Laboratory of Tree B reeding Cultivation, State Forestry Adm inistration,
Beijing　100091, China; 2. College of Forestry, Sichuan Agricultural University, Yapian　625014, Sichuan, China)
Abstract:U sing RAPD , the phylogenetic relationship of P rim ula L. from Longchi, Kangding, Mugecuo and L itang
populations was studied. The results indicated that 250 DNA fragments, which ranged from 130 bp to 1 800 bp,
were amp lified based on 28 RAPD p rimers, 209 polymorphic fragments (8316% ) were detected, and the average
number of DNA fragments per p rimer was 9. The mean of genetic distance was 01660 2. The dendrogram generated
by UPGMA clustered all the 85 materials into 4 group s. Excep t P. via lii, P. pra ttii, P. m onticola and P. ova lifolia ,
the other species were not separated each other by the cluster. The result showed that P. secund if lora belonged to
Sect. P roliferae was also sustained, and there were distinct difference between Sect. Petiolares and Sect. A leuritia
with other sections. The dendrogram indicated that Longchi population was separated for Kangding, Mugecho and
L itang populations, but the latter three populations were not distinguished each other. This suggested the eco2geo2
graphic characteristcs significantly influenced the genetic diversity of P rim ula L.
Key words: P rim ula L; genetic distance; RAPD; phylogenetic relationship; genetic diversity
报春花被誉为三大高山花卉之一。报春花属植
物约有 500多种 ,多为二年或多年生草本 ,主要分布
于北半球温带高山地区 ,我国有 293种 ,主产于川滇
藏 ,陕西、贵州次之。前人对报春花属植物的遗传多
样性及资源保护等方面进行了一些研究 [ 1 - 4 ] ,但仅
局限于少数的种类。四川省境内有报春花属植物
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
121种 9亚种和 3变种 ,许多是四川特有种。因此 ,
加大对本属植物的相关研究显得十分重要和迫切。
在集中调查都江堰龙池、康定 ———哲多山 ———
新都桥、木格措及塔公草原、理塘等地的报春花资源
基础上 ,采用 RAPD分子标记技术 ,对分布于其中的
13种报春花共 85份材料的遗传多样性进行分析 ,
以期揭示其亲缘关系 ,为开展报春花新品种选育、资
源保护和鉴定提供依据。
1　材料与方法
1. 1　材料的采集及保存
13种 85份报春花于 2006年 3—7月分别采自
四川省都江堰龙池国家森林公园、康定及理塘
(表 1)。活体植株采集后移植于四川农业大学科研
农场 ,常规管理 ,取嫩叶片置于 - 70 ℃冰箱冻存
备用。
表 1 试验所用报春花种类及其来源
组别 种名 编号 来源 海拔 /m 生境
粉报春组 雅江报春 ( P. yargongensis W. W. Sm ith) 124 康定 3 540 ±10 阳坡 ,河滩草甸
(A leuritia) 527 木格措 3 800 ±12 阳坡 ,透光性好的林下及沟边
8217 理塘 4 360 ±8 阳坡 ,沟边、灌丛下
雅砻粉报春 ( P . prattii Hem sl. ) 43244 木格措 3 800 ±17 阴坡 ,杜鹃林下 ,湖泊边
球花报春组 球花报春 ( P. denticu la te Sm ith) 18224 康定 3 340 ±11 阴坡 ,农田边缘
(D enticu la ta) 中甸海水仙 ( P. m onticola Chen et C. M. Hu) 75277 龙池 1 828 ±15 阳坡 ,荫庇林下
钟花报春组 杂色钟花报春 ( P. alpicola) 25242 木格措 3 821 ±9 阳坡 ,小乔木、低矮灌丛下
( S ikkim ensis) 钟花报春 ( P. sikkim ensis Hook. ) 79280 理塘 4 330 ±9 阳坡 ,溪流边、小叶杜鹃丛下
灯台报春组 桔红灯台报春 ( P. bulleyana Foor. ) 45249 木格措 3 450 ±17 阳坡 ,疏林草地、苔藓、腐质层
( P roliferae) 偏花报春 ( P. secundiflora Franch. ) 81285 理塘 4 460 ±9 阳坡 ,溪流边、矮灌丛下
粉被灯台报春 ( P. pulverulenta Duthie) 57260 龙池 1 828 ±15 阳坡 ,疏林下
脆蒴报春组 宝兴报春 ( P. m oupinensisi Franch. ) 51256 龙池 1 868 ±10 阳坡 ,疏林下、岩石的苔藓层上
( Petiolares) 青城报春 ( P. chien ii Fang) 61274 龙池 1 430 ±8 阴坡 ,乔木林下
卵叶报春 ( P. ovalifolia Franch. ) 78 龙池 1 828 ±15 阴坡 ,矮灌丛下
穗花报春组 高穗花报春 ( P. via lii Delavay ex Franch. ) 50 木格措 3 810 ±13 阳坡 ,松树林下、水沟边
(M uscarioides)
1. 2　D NA提取和 PCR扩增
DNA的提取参照 Lain等 [ 5 ]的方法。扩增体系
采用 20 μL 反应体系 ,模板 DNA 2. 0 μL ( 30 ～
40 ng) , 10 ×PCR Buffer (含 M g2 + 1. 5 mmol )
2. 0μL , Taq 酶 ( 2. 5个 单 位 ) 0. 4 μL , Primer
(50 mmol) 0. 4 μL , dNTP ( 10 mmol) 1. 8 μL , 加
ddH2 O补充至 20μL。
扩增程序参照张小平和陈明林 [ 6 ]的方法 : 95 ℃
预变性 5 m in, 94 ℃变性 30 s, 35 ℃退火 50 s, 72 ℃
延伸 90 s,共进行 40个循环 ,最后一个循环在 72 ℃
保持 5 m in。扩增产物在 1. 5%琼脂糖凝胶中电泳 ,
经溴乙锭 ( EB )染色 ,最后在凝胶成像系统中观察
拍照。
1. 3　数据处理
根据扩增电泳条带的有无构建 021矩阵 ,有则
赋值为“1”,无则赋值为“0”,并计算多态性位点百
分率 : p = k / n ×100% ( k是多态位点数目 ; n 为统
计的测量位点总数 )。利用 0 - 1矩阵 ,采用 Jaccard
法计算供试材料的遗传距离 ( GD ) ,按 UPGMA方法
进行聚类分析。数据分析采用 Excel和 NTSYS2PC
软件。
2　结果与分析
2. 1　RAPD扩增
利用 28个 RAPD引物对供试材料进行分析 (图
1)。结果表明 ,从 85份材料中共扩增出 250条大小
为 130～1 800 bp DNA片段 (表 2) ,其中多态性带
209条 ,占总数的 8316%。每个引物可扩增出 4～15
条带 ,平均扩增出 9条带。引物 R4扩增条带数最
多 ,共扩增出 15条带 ,引物 X15扩增产物最少 ,仅扩
增出 4条带。引物 AC20、E4、T7、T8所扩增的多态
性带比率最高 ,达 100% ;而引物 Q5多态性比率最
低 ,仅为 60% ;这表明报春花属中不同种间存在很
大的遗传分化 ,遗传多样性丰富。
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第 3期 潘远智等 :川西南 13种报春花属植物亲缘关系的 RAPD分析
表 2 28个 RAPD引物及其扩增产物分析
引物编号 序列 扩增位点总数(多态性位点数 )
多态性带
比率 /% 引物编号 序列
扩增位点总数
(多态性位点数 )
多态性带
比率 /%
AC20 ACGGAAGTGG 9 (9) 100. 0 T1 GGGCCACTCA 9 (7) 77. 8
E4 GTGACATGCC 6 (6) 100. 0 T7 GGCAGGCTGT 10 (10) 100. 0
H6 ACGCATCGCA 10 (8) 80. 0 T8 AACGGCGACA 8 (8) 100. 0
H7 CTGCATCGTG 8 (7) 87. 5 T18 GATGCCAGAC 7 (6) 85. 7
H8 GAAACACCCC 9 (7) 77. 8 U8 GGCGAAGGTT 7 (6) 85. 7
H11 CTTCCGCAGT 11 (7) 63. 6 U11 AGACCCAGAG 10 (9) 90. 0
H15 AATGGCGCAG 6 (5) 83. 3 U15 ACGGGCCAGT 12 (10) 83. 3
H20 GGGAGACATC 8 (6) 75. 0 U20 ACAGCCCCCA 6 (5) 83. 3
M6 CTGGGCAACT 10 (9) 90. 0 X1 CTGGGCACGA 10 (8) 80. 0
M13 GGTGGTCAAG 9 (7) 77. 8 X13 ACGGGAGCAA 9 (7) 77. 8
Q5 CCGCGTCTTG 10 (6) 60. 0 X15 CAGACAAGCC 4 (3) 75. 0
Q6 GAGCGCCTTG 9 (8) 88. 9 X16 CTCTGTTCGG 8 (6) 75. 0
R4 CCCGTAGCAC 15 (13) 89. 7 X17 GACACGGACC 11 (9) 81. 8
S1 CTACTGCGCT 11 (10) 90. 9 S13 GTCGTTCCTG 8 (7) 87. 5
共计 28 250 (209) 83. 6
图 1　引物 H11的 RAPD扩增图谱 (材料编号见表 1)
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图 2　RAPD 聚类图
2. 2 种间聚类分析
85份报春花材料间的平均遗传距离为 01660 2, 其变幅为 01034 5～11718 6,其中来自理塘的雅江报春材料 10和来自木格措的桔红灯台报春材料 49
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第 3期 潘远智等 :川西南 13种报春花属植物亲缘关系的 RAPD分析
的遗传距离最大 ,而同来自理塘的雅江报春材料 10
和材料 14的遗传距离最小。以平均遗传距离 01660
2为阈值 ,供试材料可聚为 4类 :类 I有 16份材料 ,
包括雅江报春的 14份材料和雅砻粉报春的 2份材
料 ;类 Ⅱ有 5份材料 ,分别为雅江报春的 3份和杂色
钟花报春的 2份 ;类 Ⅲ共 43份材料 ,包括球花报春
的 7份、高穗报春的 1份、杂色钟花报春的 15份、偏
花报春的 5份、桔红灯台报春的 5份、粉被灯台报春
的 1份、宝兴报春的 1份、卵叶报春的 1份、雅砻粉
报春的 1份、中甸海水仙的 3份、钟花报春的 2份和
青城报春的 1份 ;类 Ⅳ有 21份材料 ,分别为宝兴报
春 5份、粉被灯台报春 3份和青城报春 13份。
从聚类结果图 2也可以看出 ,类 Ⅰ材料是属于
粉报春组的雅江报春和雅砻粉报春 ;类 Ⅱ材料分属
粉报春组和钟花报春组 ;而属于球花报春组、钟花报
春组和穗花报春组的材料全部聚在类 Ⅲ;类 IV中除
3份材料属灯台报春组外 ,其余材料均属脆蒴报
春组。
2. 3　不同生态地理区域报春花遗传多样性
对 85份材料按照其各自的地理来源进行遗传
距离的分析 (表 3) ,甘孜州的报春花分属 5个组的
8种 ,含康定、理塘和木格措 3个采样点 ;采自龙池
的报春花分属 3个组的 5种 (表 1)。以采样点划
分的较小地理范围来看 ,木格措采样点的材料间遗
传距离变幅和平均遗传距离最大 ;康定采样点的材
料间遗传距离变幅和平均遗传距离最小 ;龙池和理
塘采样点居中 ,说明木格措采样点的材料间遗传分
化最大 ,康定采样点的材料间遗传分化最小 ;以四
川盆地低山丘陵 (龙池 )和高原地区 (甘孜州 )划分
的大区域来看 ,甘孜州的报春花具有更明显的遗传
差异 ,不同种的报春花材料间存在着较高的遗传分
化 ,说明该地区的报春花具有较高的遗传多样性。
表 3　不同地理区域报春花的遗传距离
地理种群 材料间遗传距离变幅 平均遗传距离
龙池　 0. 070 6～1. 241 6 0. 534 7
康定　 0. 034 5～0. 876 3 0. 427 3
木格措 0. 034 5～1. 614 9 0. 548 2
理塘　 0. 058 4～1. 369 5 0. 534 7
甘孜州 (康定、
理塘、木格措 )
0. 034 5～1. 718 6 0. 638 1
3　结论与讨论
本研究所用的 85份材料均采自天然居群 ,分属
于川西南的龙池、木格措、康定和理塘 15个居群共
采集到 13 种报春花属植物 ,分属 6 个组。28 个
RAPD引物共扩增出 250 条带 ,其中多态性带占
8316% ,表明川西南报春花属植物在 DNA水平上具
有丰富的遗传多样性 ,同时也表明该标记技术可以
有效地运用于报春花属植物的遗传多样性研究。
报春花是典型的异花授粉植物 ,具有“两型花 ”
现象。W eller等 [ 7 ]认为 ,异型花植物的遗传多样性
显著高于自花授粉植物 ,说明异型花植物种间和种
内发生遗传变异的机率较大。聚类结果显示 , 85份
供试材料中存在同种报春花不同的材料不能聚在一
起的现象 ,如 :雅江报春有 2个材料聚在了类 Ⅱ,青
城报春 1个材料聚在类 Ⅲ,类似的情况在球花报春、
杂色钟花报春等材料中也存在。出现这种情况的原
因 ,除了异型花特殊的繁殖体系导致遗传分化较大
而外 ,可能与其生境有着密切的联系。由于此类报
春花均生长在物种相对丰富、植被完好的区域 ,而发
育成熟的生境类型有利于提高报春花的遗传多样
性 [ 8 ]。刘小莉等 [ 4 ]利用 ISSR标记对云南 10种报春
花亲缘关系进行分析中 ,也发现与本研究类似的
现象。
同时雅江报春和雅砻粉报春均为粉报春组 ,
RAPD标记聚类结果与形态学分类的结果一致。但
是灯台报春组的偏花报春与桔红灯台报春聚在类
Ⅲ,而同属灯台报春组的粉被灯台报春却与脆蒴报
春组的宝兴报春和青城报春聚在类 IV ,这可能是高
水平、稳定的基因流防止了居群间的遗传分化 ,使居
群趋于一致 [ 9 ]。从材料来源上分析 ,粉被灯台报春、
宝兴报春、青城报春均采自于龙池国家森林公园 ,偏
花报春、桔红灯台报春采自甘孜州。不同的生境使
得物种在长期的进化演变中产生了适应各自生境的
生态型 ,加之龙池国家森林公园保存完好 ,物种多样
性高 ,使得种间基因流频繁。因此 ,这一地区的粉被
灯台报春表现出了与宝兴报春、青城报春更近的亲
缘关系。
由聚类图可以看出 ,不同地理来源的材料间差
异明显。大部分采自龙池的材料单独聚为一类 ,而
来自康定、理塘和木格措的材料间聚类结果并未区
分地理来源。这可能是因为后三个采样点同属甘孜
州 ,地理环境比较接近 ,与龙池的地理位置、气候类
型存在着明显的差异 ,因此导致上述两个地域的报
春花材料间存在明显的变异 ,表明不同的生态地理
类型对报春花遗传结构的差异具有很大的影响
作用。
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偏花报春的组间定位在不同的分类系统中有所
差异。Sm ith和 Forrest[ 10 ]将其归入钟花报春组 , R ie2
hards[ 11 ]将其归入灯台报春组中 ;朱慧芬等 [ 12 ]从染
色体特征出发 ,认为其应归入灯台报春组。本研究
聚类结果可以看出 ,虽然与偏花报春聚在一起的既
有钟花报春组植物 ,也有灯台报春组植物 ,但在
RAPD标记水平上偏花报春更倾向于灯台报春组。
报春花属植物的染色体基数变化较大 [ 13 - 14 ] ,由
于 RAPD技术是以基因组 DNA为模板 ,因此供试材
料间基因组的差异 ,可能会对结果产生影响。今后
的研究应立足采用分子标记技术 ,并结合形态学特
征、地理环境及气候类型等因素 ,更深入地探讨报春
花种间的基因系统发育关系。
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