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林业科学研究　2006, 19 (6) : 713～717
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2006) 0620713205
杨树内生真菌的分离和拮抗生防菌的筛选
袁秀英 , 白红霞 , 白玉明 , 呼达古拉 , 刘俊霞
(内蒙古农业大学林学院 ,内蒙古 呼和浩特　010019)
摘要 :从健康杨树植株的叶 (芽 )、皮、枝中分离获得 154株内生真菌 ,经形态观察分类鉴定归属于 3个目、5个科、13
个属中。利用两点对峙培养拮抗试验、孢子萌发试验和人工接种试验 ,从中筛选杨树烂皮病病原菌的拮抗菌。试验
结果表明所获内生真菌 (4属 )菌株对病原菌菌丝生长和孢子萌发均存在不同程度的抑制作用 ,其中 ,青霉属真菌
( Penicillium sp. )的菌株拮抗效果表现最明显。青霉菌可迅速对病原菌菌落包围、覆盖 ,从而使植物病原菌生长受
到抑制 ,孢子萌发试验中 , 3 d的培养滤液就可对病原菌孢子萌发产生抑制作用 ,表现出一定的生防潜能。
关键词 :杨树 ;内生真菌 ;拮抗作用 ;生物防治
中图分类号 : S718181 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006208204
基金项目 : 内蒙古自然科学基金项目 (200308020305)
作者简介 : 袁秀英 (1954—) ,女 ,内蒙古巴彦淖尔市人 ,教授 ,主要从事森林病害方面的研究 1a4301433@public. hh. nm. cn
Isola tion of Endophytes and Screen of Antagon istic Stra ins in Poplar Trees
YUAN X iu2ying, BA I Hong2xia, BA I Yu2m ing, HU 2Dagula, L IU Jun2xia
( Forestry College of InnerMongolia Agricultural University, Huhehot 010019, InnerMongolia, China)
Abstract: In a survey of endophytic fungi associated with Populus spp. in Huhhot, InnerMengolia, 154 fungal strains
were isolated from leaves( bud) , teguments and branches. The strainswere classified into 13 different genera based on
their morphological characteristics. The authous tested the antagonistic action of the 154 endophytic fungi on the
pathogen, Cytospora sp. with the dual culture, germ ination of spores and inoculation experiments. The results showed
that all endophytic fungi tested can inhibite, in some content, mycelium growth and spore germ ination of Cytospora
sp. respectively. The strains of Penicillium sp. had the strongest antifungal effictiveness on the pathogen. In the antago2
nistic test, the colonial growth of Cytospora sp. was comp ressed and covered by the fast mycelial growth of Penicillium
sp. So the development of Cytospora sp. was inhibited . In spore germ ination experiment, the filtrate from Penicillium
sp. cultivated in liquid for three days also inhibited the growth of Cytospora sp. Therefore, the strain of Penicillium
sp. could have a potential capability for biological control.
Key word: Populus; endophytic fungi; isolation; screen; biological control
内生真菌 ( endophyte或 endophytic fungi)是指
生活在植物体内或在其生活史的一定阶段处于植
物体内的一类真菌 [ 1, 2 ] 。由于内生真菌在植物体
内自主的分裂繁殖和传递的特性 ,且专一性很强 ,
除了对其宿主植物及取食或感染宿主植物的生物
起作用外 ,对其它生物没有直接影响的特点 ,使之
有可能成为生物防治中有潜力的微生物农药和增
产菌。内生真菌可增强宿主对一些病原真菌和腐
生真菌的抵抗能力 [ 1 ] ,因此分离并利用植物内生
真菌来控制植物病害进而保护植物的研究日益增
多 ,也取得了一些研究成果。目前国内有很多关于
内生真菌的研究报道 [ 1 ] ,但很少见到杨树相关内
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
容的报道。就此作者对杨树内生真菌的分离、鉴定
及拮抗菌筛选进行了研究 ,现予以报道。
1　材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 植物样品来源 　2003年 4—5月从呼和浩
特市市区采集健康的杨树植株 ,进行内生真菌的
分离。
1. 1. 2 杨树烂皮病病原菌来源 　2003年 4—5月
从呼和浩特市市区采集杨树烂皮病标本 ,进行烂皮
病病原菌的分离、鉴定 ,并获得病原菌壳囊孢属 (Cy2
tospora sp. )的纯培养。
1. 1. 3 培养基 　PDA培养基 (马铃薯琼脂葡萄糖
培养基 ) +青霉素 (80 u·mL - 1 )
PD培养基 (马铃薯葡萄糖培养基 ) +青霉素
(80 u·mL - 1 )
1. 2 方法
1. 2. 1 杨树内生真菌的分离与纯化 取健康杨树
的叶 (芽 )、皮、枝 ,用自来水冲洗干净、晾干水分后 ,
将皮、枝切成 2 cm左右的小段 ,采用下述方法进行
表面消毒 : 75%酒精处理 1～4 m in,无菌水冲洗 , 0.
1%升汞液处理 3～15 m in (根据分离部位决定时间
长短 ) ,无菌水冲洗 3～5次 ,取最后 1次无菌水洗液
涂于平板上 ,在恒温培养箱中 28 ℃培养 3～4 d,观
察有无菌落产生 ,若发现皿中无菌落生成 ,则证明该
材料表面消毒彻底 ,否则 ,不能使用。将上述处理过
的植物材料分别在无菌条件下切割成 0. 2 cm ×0. 2
cm的长段 (片 )接种于 PDA培养基上 ,置 28 ℃恒温
培养箱中培养 3～7 d,根据菌落形态、颜色等挑取不
同菌落 ,按常规方法纯化后保存 [ 3～6 ]。
1. 2. 2 杨树内生真菌的分类鉴定 从纯化培养数
日的菌落上挑取子实体或菌丝并连同分生孢子梗和
分生孢子制成玻片 , 置于光学显微镜下观察并
鉴定 [ 7～9 ]。
1. 2. 3 拮抗菌的筛选 采用两点对峙培养法 ,选
取 3种优势内生真菌进行活化后 ,切取培养 5 d同
质等量的内生真菌和病原菌的菌丝块接种于 PDA
平板上距中心 2 cm处同一直线的两点上 ,同时设接
种病原菌的为对照 ,每处理 4个重复 ,于 25 ℃恒温
培养 ,并观察、测量内生真菌的菌落直径、病原菌的
菌落直径以及只接病原菌的对照直径 [ 10, 12 ]。
1. 2. 4 内生真菌培养滤液对病原菌分生孢子萌发
的影响 将一定量活化的 4种内生真菌菌株 ,于无
菌条件下接种于 80 mL的 PD培养基中 ,于恒温箱中
25 ℃静止培养 3、7、14、21 d,将培养液离心后取上
清液备用。于清洁无菌的凹面载玻片的凹陷穴中 ,
滴加 0. 2 mL的培养滤液 ,室温下晾干后再加入用杨
树皮煎汁配成的病菌孢子悬浮液 0. 1 mL,孢子浓度
为每视野 (10 ×16) 20～30个 ,并设不加内生真菌培
养滤液为对照 , 25 ℃温箱内培养 , 14 h后检查孢子
萌发率 [ 6, 11, 13 ]。
1. 2. 5 室内人工接种试验 野外采集的杨树枝
条 ,剪成 20 cm左右的长段 ,按顺序摆好 ,顶端封蜡 ,
在 1 /14的漂白粉溶液中消毒 4 ～5 m in,取出用纱
布包好 ;风干后用杨树皮煎汁配制内生真菌和病原
菌的孢子悬浮液 ,进行烧伤接种 [ 14 ]。处理组合 : (1)
先接内生真菌 , 3 d后 ,接种病原菌 ; (2)先接种病原
菌 , 3 d后 ,接种内生真菌 ; (3)将内生真菌分别与病
原菌的孢子混合接种。接种后用脱脂棉包扎蘸水保
湿放入玻璃瓶内水培 , 7 d后解除保湿。以接种枝条
出现病原菌子实体的早晚作为发病程度的分级
标准 [ 11 ]。
2　结果与分析
211　杨树内生真菌的类群
从杨树中共分离获得内生真菌 154株 ,经显微形
态观察将其中的 116株分类鉴定为 3个目、5个科、13
个属 ,有 38株因未产孢待鉴定。其中青霉属菌 ( Peni2
cillium spp. )为优势种群 ,占总数的 40. 9%;其次为曲
霉属菌 (Aspergillus spp. ) ,占总数的 22. 7%。
2. 2 内生真菌在杨树不同部位的分布
从表 1、2可以看出 ,从杨树分离获得 154株内
生真菌中 ,叶 (芽 )部分布 48株 , 7个属 ;皮部分布 53
株 , 8个属 ;枝部分布 53株 , 5个属。各部位都有青
霉属、曲霉属、链格孢属 (A lternaria sp. )真菌分布 ,
且都以青霉属真菌为优势种群。而毛壳菌属
( Chaetom ium sp. )、刺 杯 毛 孢 属 ( D inem asporium
sp. )、匐柄霉属 (S tem phylium sp. )真菌只在叶 (芽 )
上有分布 ; 头孢属 ( Cephalosporium sp. )、丛梗孢属
(M onilia sp. )、木霉属 ( Trichoderm a sp. )、壳囊孢属
(Cytospora sp. )真菌只在皮上有分布 ; 葡萄孢属
(B otry tis sp. )、梨形孢属 ( Pyricu laria sp. )真菌只在
枝上有分布 ,说明杨树的一些内生真菌对宿主具有
一定的选择性。杨树叶 (芽 )、皮、枝三个部位内生
真菌在数量、种群分布方面有很大的差异 ,这表明杨
树内生真菌的数量和种群呈现多样性特点。
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第 6期 袁秀英等 :杨树内生真菌的分离和拮抗生防菌的筛选
表 1 杨树内生真菌种类
分离
部位 菌种名称
菌株
数
分离
部位 菌种名称
菌株
数
分离
部位 菌种名称
菌株
数
叶 青霉属 21 皮 青霉属 20 枝 青霉属 22
(芽 ) 曲霉属 14 曲霉属 12 曲霉属 9
链格孢属 2 链格孢属 1 葡萄孢属 2
粉孢霉属 1 粉孢霉属 1 梨形孢属 1
匐柄霉属 1 头孢属 1 链格孢属 1
刺杯毛孢属 1 丛梗孢属 1 (没长孢子 ) 18
毛壳菌属 1 木霉属 1
(没长孢子 ) 7 壳囊孢属 3
(没长孢子 ) 13
表 2　不同部位真菌菌株比较
部位
菌株数 /
株
涉及属数 /
个
占总菌株
数的比 /%
涉及属占总属
数的比 /%
叶 (芽 ) 48 7 31. 2 53. 8
皮 53 8 34. 4 61. 5
枝 53 5 34. 4 38. 5
(总计 ) 154 — 100 —
2. 3 对峙培养结果
将一些内生真菌分别与病原菌作对峙培养试
验 ,其生长曲线见图 1。从图中可以看出 :青霉属真
注 : DO———对照直径、DC———Cytospora sp. 直径、DP———Penicillium sp. 直径、DAS———A spergillus sp. 直径、
DA l———A lternaria sp. 直径、C———Cytospora sp. 、P———Penicillium sp. 、A s———Aspergillus sp. 、A l———A lternaria sp.
图 1 内生真菌对杨树烂皮病菌拮抗作用
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菌生长明显快于病原菌 , 3 d时青霉属菌 ( P)与病原
菌相接触 ,约 4 d后 ,青霉属菌开始包围、覆盖病原
菌菌落 ,从而使植物病原菌生长受到抑制 ,菌落开始
逐渐萎缩 ,其生长直径明显低于对照直径 ,可见青霉
属菌对病原菌有明显的抑制作用 ; 3～4 d曲霉属菌
(A s)与病原菌相接触后 ,曲霉属菌仍在扩展营养空
间 ,对病原菌进行覆盖 ,使病原菌菌落直径明显低于
对照直径 ,可见曲霉属菌对病原菌具有较强抑制作
用 ; 3～4 d链格孢属菌 (A l)与病原菌菌落相接触
后 ,形成了明显的分界线 ,病原菌的生长空间受到限
制后菌落不能继续扩展 ,其菌落直径小于对照直径 ,
可见链格孢属菌对病原菌也存在抑制作用。
2. 4 孢子萌发实验结果
在 25 ℃下培养 14 h后 ,镜检孢子萌发率结果
见表 3:用培养 3 d的培养滤液处理后只有青霉属菌
对孢子萌发有抑制作用 ;培养 7 d后各内生真菌的
培养滤液均能有效抑制病原菌的孢子萌发 ;培养 21
d时各内生真菌的培养滤液对病原菌孢子萌发抑制
作用增强 ,而用青霉属菌培养滤液处理后的萌发率
最低 ,比对照低 54. 9%。总之 ,经 4种内生真菌培养
滤液处理的和以无菌水作对照的病原菌孢子萌发率
存在显著差异 ,说明几种内生真菌培养滤液中存在
的代谢产物可明显抑制病原菌的孢子萌发 ,而在所
有内生真菌中青霉属菌的抑制效果最佳。
表 3 4种内生真菌培养滤液对病原菌
分生孢子萌发的影响
菌液
萌发率 /%
3 d 7 d 14 d 21 d
木霉属 66. 7 62. 9 37. 0 28. 4
青霉属 52. 8 34. 1 29. 5 15. 9
曲霉属 69. 0 61. 1 38. 1 28. 2
链格孢属 65. 4 61. 2 35. 7 28. 6
(对照 ) 57. 8 75. 4 73. 3 70. 8
2. 5 室内人工接种对杨树烂皮病的抑制作用
根据人工接种后的发病结果 (见表 4、5、6)可知 :先
接种内生真菌的拮抗效果最好 ,为 59. 3%～8512%;混
合接种的拮抗效果次之 ,为 44. 4%～5913%;后接内生
真菌的拮抗效果最差 ,为 14. 8% ～51. 9%。分析其原
因 ,先接内生真菌的 ,内生真菌孢子首先萌发侵入枝条 ,
优先占领宿主 ,抑制和阻碍病原菌的侵入 ,拮抗效果明
显 ;而混合接种和后接拮抗菌的 ,由于病菌和杨树的亲
和力较强 ,孢子萌发后菌丝在寄主上生长较快 ,使内生
真菌生长受抑制 ,拮抗效果差。
拮抗效果 =对照感病指数 -拮抗感病指数对照感病指数
×100%
表 4　先接内生真菌 , 3 d后接种病原菌拮抗效果
内生真菌 接种枝条数 /根
发病数 /根
32 d后 28～32 d 24～28 d 20～24 d 20 d前
总发病枝条
数 /根
发病率
/%
感病
指数
拮抗效果
/%
木霉属 10 0 1 1 0 2 4 40 27. 5 59. 3
青霉属 10 0 1 0 1 0 2 20 10. 0 85. 2
曲霉属 10 1 0 0 1 2 4 40 27. 5 59. 3
链格孢属 10 0 0 1 0 2 3 30 25. 0 63. 0
(对照 ) 10 1 0 2 1 5 9 90 67. 5 —
表 5 内生真菌与病原菌的孢子混合接种拮抗效果
内生真菌 接种枝条数 /根
发病数 /根
32 d后 28～32 d 24～28 d 20～24 d 20 d前
总发病枝条
数 /根
发病率
/%
感病
指数
拮抗效果
/%
木霉属 10 0 0 2 1 2 5 50 37. 5 44. 4
青霉属 10 0 1 1 0 2 4 40 27. 5 59. 3
曲霉属 10 0 1 1 0 2 4 40 27. 5 59. 3
链格孢属 10 0 1 0 1 2 4 40 30. 0 55. 6
(对照 ) 10 1 0 2 1 5 9 90 67. 5 —
表 6 先接种病原菌 , 3 d后接种内生真菌拮抗效果
内生真菌 接种枝条数 /根
发病数 /根
32 d后 28～32 d 24～28 d 20～24 d 20 d前
总发病枝条
数 /根
发病率
/%
感病
指数
拮抗效果
/%
木霉属 10 0 1 2 1 2 6 60 40 40. 7
青霉属 10 1 0 1 1 2 5 50 32. 5 51. 9
曲霉属 10 0 0 1 3 3 7 70 57. 5 14. 8
链格孢属 10 0 0 1 0 3 4 40 35. 0 48. 1
(对照 ) 10 1 0 2 1 5 9 90 67. 5 —
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第 6期 袁秀英等 :杨树内生真菌的分离和拮抗生防菌的筛选
3 结论与讨论
(1)杨树叶 (芽 )、皮、枝三个部位内生真菌在数
量、种群组成上存在着一定的差异 ,这可能与真菌的
习性、内生真菌具有一定的组织专一性 ,以及宿主杨
树不同部位的微环境 (如通气状况、酶和其他化学成
分 )和基质相关。
(2)从两点对峙培养、孢子萌发试验和人工接
种试验的结果可以看到青霉属的菌株对杨树烂皮病
菌的拮抗效果最好。青霉属真菌是一类分布极广的
真菌 ,在工业上、医药上应用都十分广泛 ,农业上已
有研究青霉属菌对水稻纹枯病菌 Pellicu laria sasakii
( Shirai) Ito、稻瘟霉菌 Pyricu la ria oryzae Cav1等抗生
作用的研究报道 ,可见在植物保护方面利用青霉属
真菌防治病虫害也是很有研究价值的。青霉属真菌
作为拮抗菌存在的优势首先是其生长速度快 ,具有
较强的营养竞争能力 ,能快速占领空间并对病原菌
进行包围和覆盖 ,从而使植物病原菌生长受到抑制 ;
其次 ,青霉属真菌代谢产物丰富 (可产生烯类抗生
素、酶类及多种有机化合物 ) ,这些物质会帮助青霉
在生存竞争中占据有利位置。因此 ,可对青霉属真
菌做进一步试验 ,研究其对病原菌的抑菌机理、拮抗
物质的产生、以及其在树干上存活的生态条件等 ,可
以为开发新的生防拮抗制剂打下基础。
(3)本研究的人工接种试验也说明了内生真菌
可以增强宿主对一些病原真菌和腐生真菌的抵抗能
力。这一结果与相关研究报道一致 [ 1, 15 ]。内生真菌
是植物体内习居的真菌类群 ,而非引进的生防因素 ,
在与宿主长期协同进化的过程中在生理生态上已经
彼此适应 ,因而具有较强的适生性 ,相对比较稳定 ,
易于在短期内形成种群优势 ,比引进的外来拮抗菌
有更强的竞争能力。另外 ,内生真菌对人体和生态
环境不会造成任何危害 ,是较为理想的生防菌剂。
所以 ,从内生真菌中进行生防菌的筛选更具有现实
意义。
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