全 文 ：林业科学研究 2006, 19( 2): 253~ 256
Forest R esearch
文章编号: 10011498( 2006) 02025304
光叶楮叶片和叶柄再生体系的建立
郁萌萌 1, 2, 施国新 1, 吕群丹 2, 杨 磊 2, 唐仁杰 2, 张洪霞2
( 1.南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210097; 2.中国科学院上海植物生理生态研究所,上海 200032)
关键词: 光叶楮;组织培养; 快繁;
中图分类号: S722 3 文献标识码: A
收稿日期: 20050520
基金项目: 国家自然科学基金 (NNSFC: 30471411)
作者简介: 郁萌萌 ( 1980 ) ,女,硕士研究生,研究方向:植物分子遗传
In vitro Culture and ShootRegeneration from Leaves and
Petioles ofBroussonetia papyrifera
YU M eng m eng 1, 2, SH I Guox in 1, LV Qundan2, YANG Lei2, TANG R enjie2, ZHANG H ong xia2*
( 1. Col lege of Life Sciences, Nanj ing Norm alUn iversity, Nan jing 210097, J iangsu, Ch ina;
2. Shanghai In stitute of P lan t Physiology and Eco logy, Ch inese Academ y of Sciences, Shanghai 200032, Ch ina)
Abstract: In this study, an efficient regenerat ion system ofBroussonetia papyrifera was established. U sing leaf disks and
pet io le fragm ents as explants, M S m edia supplem ented w ith different concentrations of BA and NAA were investigated for
shoot induction. Then regenerated shootswere transferred toMS m ed ium containing 0~ 0. 6m g L- 1 NAA to induce roots.
A BA /NAA comb ination of 2. 5/0. 1(mg L- 1 ) produced the highest percentage of regeneration w ith petio le explants and
of 1. 5/ 0. 05(mg L- 1 ) w ith leaf explants. T he optmi almedium for rooting wasM S m ed ium supplem ented w ith 0. 05m g
L- 1 NAA.
K ey words: papermu lberry; tissue cu lture; plant regenerat ion
光叶楮 (B roussonetia papyrif era ( L. ) V en.t ) ,
速生阔叶树种,落叶乔木, 属桑科 (M oracea) ,构树属
(B roussonetia )。该树种适应性极强, 耐盐碱、干旱,
生长周期短,且伐后可以萌生,是近年来从日本引进
的制浆造纸专用树种。光叶楮的树皮可生产特种
纸;树干可制纸和纤维板; 树叶可作饲料, 当年的生
物产量可达到 22. 5 t hm- 2。它不仅具有极高的经
济价值,而且还是一种可用于环境绿化和保持水土
的优良树种。
目前光叶楮苗木的大量需求主要靠常规的无性
扦插繁殖得以满足,但由于其材料来源不足,扦插成
活率不高,且费时费工,难以满足当前大面积栽培及
推广光叶楮优良品种的需要。李际红等 [ 1 ]采用母株
基部的茎段作外植体,对其进行了组培快繁的研究,
孙天洲等 [ 2]通过对光叶楮顶芽离体培养, 探索了其
快繁及生根的最佳培养条件。但是这些研究多集中
在光叶楮组织快繁方面。如何以叶片和叶柄为外植
体建立光叶楮高效再生体系, 目前国内外均未见报
道。Bhatnagar[ 5]与 Kapur [ 6] 等曾对桑树 (Morus a lba
L. )叶片与叶柄的分化作了系统的研究。本文从光
叶楮的叶片与叶柄外植体着手, 经过大量试验, 筛选
出各阶段的最佳培养条件, 解决了光叶楮分化率低,
增殖缓慢,生根困难等问题,不仅为实现其快速无性
繁殖、扩大种源生产、保存优良品种提供了一种行之
有效的方法, 更重要的是,为光叶楮的遗传转化及转
基因品种改良打下了坚实的实验基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试材料为光叶楮组培苗, 叶片和叶柄取自
林 业 科 学 研 究 第 19卷
MS
[ 4]培养基上生长 30 d的组培苗。
1. 2 培养方法
以 MS为基本培养基,琼脂粉 8 g L- 1, 蔗糖 20
g L- 1, 添加不同组合的植物激素, 调节 pH值至
58。将叶片切割成 5 mm见方的小块 (图 3A ) , 叶
柄切成 5 mm的小段 (图 3C ) ,接种于附加不同激素
组合的分化培养基中, 每天光照 16 h, 光照强度为
2 000~ 2 500 1x, 温度 25~ 28 ! , 每两周更换一次
培养基。当芽苗长至 1~ 2 cm时,置 MS培养基上延
长生长至 3 cm左右, 转移到生根培养基中, 2~ 3周
从茎基部分化出根,长成完整植株。开瓶炼苗 1周,
洗净根部培养基,移栽到经灭菌的营养土盆中, 30 d
后长成大苗。每次实验选取 40个左右的外植体, 重
复 3次。
2 结果与分析
2. 1 BA、NAA的不同组合对叶片、叶柄分化的影响
预试验中,我们曾选用 Zt、TDZ、BA比较促进分
化的效果,结果表明 BA对光叶楮叶片、叶柄外植体
的再生有较好的效果。这与前人的 BA可以有效促
进木本植物茎段外植体的分化 [ 7 ]的观点一致。因此
本实验在 MS培养基中添加不同浓度的 BA、NAA组
合,进一步探索分化配方。
将叶片、叶柄外植体接种到各分化培养基中, 培
养 30 d后, 对萌发不定芽数进行统计, 结果见表 1。
运用 SAS软件的 PROC FREQ程序分析数据, 结果
表明 BA和 NAA的不同浓度组合与叶片、叶柄分化
率之间存在显著的相关性。 (p < 0. 000 1)
表 1 各种分化培养基对叶片叶柄
不定芽再生的影响 ( 30 d)
激素 / (m g L- 1 )
BA NAA
叶片外植体
接种个数 再生率 /%
叶柄外植体
接种个数 再生率 /%
1. 0 0. 02 39 2. 3 42 7. 1
1. 0 0. 05 42 16. 1 29 34. 5
1. 5 0. 02 48 1. 7 37 8. 5
1. 5 0. 05 44 36. 4 33 87. 9
1. 5 0. 1 45 7. 2 21 4. 8
2. 0 0. 02 43 8. 2 37 14. 9
2. 0 0. 05 43 13. 5 35 62. 9
2. 0 0. 1 50 10. 4 41 41. 5
2. 0 0. 2 36 23. 3 40 70
2. 5 0. 02 40 2. 5 41 0
2. 5 0. 05 46 13. 5 30 66. 7
2. 5 0. 1 46 12 43 93
2. 5 0. 2 35 30. 2 40 70
3. 0 0. 02 40 3. 4 43 0
3. 0 0. 05 41 18. 6 30 56. 7
3. 0 0. 1 48 22. 2 41 63. 4
叶片最佳分化培养基为 MS+ BA 1. 5 mg L- 1
+ NAA 0. 05 mg L- 1, 此时的最高分化率达
364%。叶片外植体接种于分化培养基上 20 d左
右,组块边缘伤口处可见少而小的绿色愈伤组织, 约
30 d后, 有绿色芽点生成,逐渐分化出芽。每个叶片
外植体一般只能分化出一个芽 (图 3B)。叶柄外植
体的再生能力明显强于叶片: 当 BA 2. 5 mg L- 1,
NAA 0. 1 mg L- 1时,叶柄的分化率高达 93%。叶
柄接种两周左右,两端切口处可见绿色愈伤组织, 3
周左右愈伤组织中分化出小芽, 4周时芽的分化达
到高峰 (图 3D )。一般叶柄两端均可分化出芽, 每个
再生叶柄分化芽数为 1~ 4个不等。
2. 2 硝酸银对外植体褐化的影响
外植体褐化是木本植物组织培养过程中容易出
现的问题。外植体的褐化, 除了会导致自身死亡外,
还向培养基中分泌褐色物质, 影响其它外植体的分
化。防止外植体的褐化是木本植物组织培养成功的
关键之一。本试验参照钟名其等 [ 3]的研究结果, 采
用硝酸银为抗酚类氧化剂, 添加至培养基中, 培养
20 d后观察外植体的褐化率。结果如下 (见图 1):
图 1 硝酸银对外植体褐化的影响
从图 1看出: 在培养基中加入适量的硝酸银可
以显著地减少光叶楮叶片、叶柄外植体的褐化。然
而,不同的外植体对硝酸银的敏感程度不同:叶片的
最佳浓度在 2 mg L- 1, 叶柄最佳浓度在 1 mg
L
- 1。这可能是由于叶片本身褐化程度较叶柄严重,
因此需加入的硝酸银浓度也较叶柄的高些。但在硝
酸银浓度过高时,无论叶片、叶柄, 均表现出严重褐
化死亡、再生率大大降低的现象。这可能是因为高
浓度的银离子对外植体产生了重金属胁迫, 从而影
响了外植体的分化与发育。
2. 3 MS、1 /2M S中添加不同浓度的 NAA对植株
生根的影响
将长势较为一致的高约 3 cm左右的试管苗切
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第 2期 郁萌萌等:光叶楮叶片和叶柄再生体系的建立
下,接种到分别以 MS、1 /2M S为基本培养基,添加不
同浓度 NAA的生根培养基中。实验结果见图 2。
图 2 MS、1 /2MS中添加不同浓度 NAA对植株生根的影响
较低水平的 NAA 能有效促进根的发育。
0 05~ 0. 1 mg L- 1的 NAA约一周时间就能诱
导根突萌发 (图 3E ) , 且所生的根分布均匀, 侧根
发达。而高浓度的 NAA非但不能有效促进根的
发育, 反而对其有抑制作用。若 NAA浓度很低,
如 0~ 0. 02 mg L- 1, 虽然所生的根愈伤很少, 但
根的始萌发时间偏长, 分布不均, 且根细长。另
一方面, 较低浓度的无机盐水平也有利于根的形
成。在各种 NAA的浓度下, 1 /2M S培养基的生根
效果均明显优于 M S培养基。 1 /2M S培养基上不
仅光叶楮幼苗生根率较高, 而且生根时间平均短
于 MS培养基 4 ~ 6 d, 根长而粗壮, 这可能与高浓
度的无机盐对根发生的抑制作用有关。综合两
方面的因素, 在 1 /2M S培养基中添加 0. 05 mg
L
- 1
NAA, 生根效果最佳。
图 3 A叶片外植外置于分化培养基上; B30 d后从叶柄边缘分化出不定芽; C叶柄外植体置于分化培养基上;
D30 d后从叶柄两端分化出不定芽; E无根小苗在生根培养基中 15 d后开始生根; F移栽至花盆中 30 d后
2. 4 试管苗炼苗移栽
当试管苗长至 5 cm左右,并有数条根时, 即可
进行炼苗。打开瓶盖炼苗一周左右, 将生根试管苗
小心地从培养瓶中取出,用水洗净根部残留的培养
基,栽入经灭菌的营养土盆中 (图 3F)。
试管生根苗在移栽前需要一个开瓶炼苗的过
程,锻炼后植株成活率高,长势较好。光叶楮试管苗
在过渡移栽中需要注意缓和蒸腾过速与增强光照与
温度的矛盾。不同光照和温度条件下的锻炼对试管
苗的形态有明显的影响。强光高温 ( 3 500 lx, 28
! )下试管苗根系发达,幼茎组织充实,叶片大而绿,
植株挺拔有活力;而弱光低温 ( 2 000 lx, 15 ! )下的
试管苗根系生长较慢, 茎较幼嫩,叶片不发达, 植株
生活力较差。试管苗根系大小, 叶片的光合能力以
及维管组织的发育与充实程度与其对外界环境适应
能力密切相关, 适当的强光高温锻炼后的试管苗自
身抗性增强, 保护组织完善,成活率高达 91. 6% , 而
未经锻炼的试管苗从培养室的培养条件下直接过渡
移栽,成活率仅为 48. 4%。
3 讨论
以叶片、叶柄为外植体进行组织培养,经短时间
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林 业 科 学 研 究 第 19卷
的愈伤化直接分化出芽,这是一条便捷的再生途径。
实验中发现,相同的激素配比, 对叶片和叶柄不
定芽的诱导存在很大的差异。无论从不定芽萌发所
需时间,还是再生率看,叶柄的再生能力明显比叶片
强,这可能与叶片和叶柄的易褐化程度不同及二者
的内源激素含量、利用能力存在差异有关。在 BA
1. 5~ 3. 0mg L- 1, NAA 0. 05~ 0. 2mg L- 1的浓度
范围内,均能诱导叶柄产生不定芽。尤其在 BA 2. 5
mg L- 1, NAA 0. 1 mg L- 1时再生率达 93%, 所生
的芽均为丛生芽。
叶片外植体一般只能分化一个芽, 但所生的芽
非常健壮,生命力旺盛,这可能与叶片外植体与培养
基之间接触面积较大、营养吸收更充分有关。此外,
虽然叶片外植体的再生率较低, 最高仅为 36. 4% ,
但因其叶片较大,取材方便,亦不失为一种良好的组
培材料。
本研究建立了光叶楮叶柄、叶片的高效再生系
统。并探索了硝酸银在减轻光叶楮外植体褐化方面
的作用。该技术体系的建立不仅有助于我们实现光
叶楮大规模种植的产业化, 同时也为将外源基因导
入该树种, 进行分子育种方面的研究, 实现其种质
资源的改良打下了坚实的基础。
参考文献:
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