全 文 ：林业科学研究 ２０１２，２５（２）：２５４ ２６０
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１２）０２０２５４０７
白桦 ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）转录因子基因的
分离及其表达
张 妍，刘 瀛，孙丰宾，戴 超，刘雪梅
（东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 １５００４０）
收稿日期：２０１１０７２６
基金项目：黑龙江省自然科学基金（Ｃ２０１０４０）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（ＤＬ０９ＣＡ０６）
作者简介：张 妍 （１９８６—），女，黑龙江哈尔滨人。硕士研究生，主要从事植物发育方面的研究。Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｙａｎｌｏｖｅｙｏｕｂｅｓｔ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者： 刘雪梅（１９７２—），女，山东郓城人。副教授，博士，主要从事植物发育与分子生物学方面的研究。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｘｕｅｍｅｉ＠ｎｅｆｕ．
ｅｄｕ．ｃｎ
关键词：白桦；ＡＰ２；转录表达；ｑＲＴＰＣＲ；花发育
中图分类号：Ｓ７１８．４６ 文献标识码：Ａ
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＰＥＴＡＬＡ２Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ＦａｃｔｏｒＧｅｎｅｉｎＢｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌａ
ＺＨＡＮＧＹａｎ，ＬＩＵＹｉｎｇ，ＳＵＮＦｅｎｇｂｉｎ，ＤＡＩＣｈａｏ，ＬＩＵＸｕｅｍｅｉ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡＰ２ｇｅｎｅｉｓａｋｅｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｐｌａｎｔｓ．ＴｈｅｆｕｌｃＤＮＡｏｆＡＰ２
ｇｅｎｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＢｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌａＳｕｋ．ｂｙｍｅｔｈｏｄｓｏｆｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ
ＰＣＲ）ａｎｄ５’ａｎｄ３’ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）．ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＡＰ２ｇｅｎｅｃｏｎｔａｉｎｓａｎｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ１５５４ｂｐｅｎｃｏｄｉｎｇ５１７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＢｐＡＰ２ｉｓ
５６．７４ｋＤａａｎｄｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｉｓ６．３４．ＴｈｅＡＰ２ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｔｅｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｄｏｍａｉｎｓｗｅｒｅ
ｃｏｎｆｉｒｍｅｄｉｎｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｓｏｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｇｅｎｅｗａｓｎａｍｅｄａｓＢｐＡＰ２，ａｎｄｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄｉｎＧｅｎＢａｎｋｗｉｔｈａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒＪＮ２４７４０８．Ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｈａｒｅｄ５１％ ７７％ ｏｆｉｄｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈｏｔｈｅｒｔｗｅｌｖｅｐｌａｎｔｓｐｅ
ｃｉｅｓ，ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｉｄｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（７７％）ａｎｄｍｉｎｉｍｕｍｉｄｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈＰｉｎｕｓｔｈｕｎｂｅｒｇｉ（５１％）．
Ａｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆａｌｔｈｅｔｈｉｒｔｅｅｎｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ．
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｐＡＰ２ｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｑＲＴＰＣＲｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｐｅｒｉｏｄｓｉｎＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌａ．Ｒｅ
ｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｐＡＰ２ｗａｓｍｏｒｅｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｓｔｈａｎｉｎｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｏｒｇａｎｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｑｕａｎｔｉｔｙ
ｍｏｒｅｈｉｇｈｌｙｉｎｙｏｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓｔｈａｎｉｎｍａｔｕｒｅｔｉｓｓｕｅｓ．ＩｔｉｎｆｅｒｅｄｔｈａｔＢｐＡＰ２ｔｒａｎｓｆａｃｔｏｒｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｓａｎｄｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃｔｉｓｓｕｅｓｉｎＢｅｔｕｌａ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｎａｔｕｒａｌｍａｌｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｂｎｏｒｍａｌ
ｍｕｔａｎｔｏｆＢ．ｐｌａｔｙｐｈｙｌａｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｐＡＰ２．ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｐＡＰ２ｇｅｎｅｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｌｙｉｎｆｅｍａｌｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓ，ｗｈｉｌｅｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｍａｌｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓ，ｙｏｕｎｇｌｅａｖｅｓａｎｄｙｏｕｎｇ
ｓｈｏｏｔｓ，ｗｈｉｃｈｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｈａｔＢｐＡＰ２ｓｈｏｕｌｄｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｇｅｎｅｓ，ａｎｄｎｏｔｏｎｌｙ
ｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｓ，ｂｕｔａｌｓｏｐｌａｙｓｏｍｅｒｏｌｅｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌａ；ＡＰ２；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｑＲＴＰＣＲ；ｆｌｏｗｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
第２期 张 妍等：白桦ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）转录因子基因的分离及其表达
白桦（ＢｅｔｕｌａｐｌａｔｙｐｈｙｌａＳｕｋ．）是我国常见阔叶
树种，用途广泛。其花单性，雌雄花均为不完全花，
只有两轮花器官，雌雄同株，其雌雄花发育特殊，同
年生雌雄花异熟，花期不遇，且雄花发育存在越冬宿
存现象［１］。这些不同于模式植物两性花的特征，预
示着单性花发育的特殊性，具有重要的研究价值。
虽然在白桦雌雄花发育的细胞学研究和分子机理研
究方面已有少数报道［２－４］，但还缺乏深入系统的研
究。对于该物种花器官发育的重要基因的挖掘及其
功能研究具有重要意义。
ＡＰ２基因作为成花器官的Ａ类基因参与花分生
组织特性建立、花器官特性的特化以及调控。ＡＰ２
基因编码 ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ转录因子家族，此类转录因
子家族成员的主要特征是都含有至少一个 ＡＰ２结
合域，由６０ ７０个左右的氨基酸组成，且高度保
守，起到识别 ＤＮＡ并与之结合的作用［５］。早在
１９９４年，ＪｏｆｕｋｕＫ．Ｄｉａｎｅ研究小组首先发现 ＡＰ２除
了在整个拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）
的花发育过程中所有４轮花组织和器官中有所表达
外，同时在非花组织———茎和营养叶部位表达［６］，
而另一物种矮牵牛ＰｈＡｐ２Ａ基因是拟南芥 ＡＰ２基因
的同源进化产物，ＭａｅｓＴａｍａｒａ等发现，ＰｈＡｐ２Ａ在
花序分生组织和花蕾的初期阶段已开始表达，在花
瓣的发育整个过程和幼嫩的心皮中都有较强的表
达［７］。因此，了解ＡＰ２基因的功能对于研究花发育
的机理非常重要。
本研究以白桦作为研究对象，分离了白桦
ＢｐＡＰ２基因的全长ｃＤＮＡ，并分析了它在不同组织和
发育阶段的转录表达水平，并检测了该基因在白桦
雄花序突变体中各组织的表达情况，初步推测其功
能，为以后系统深入研究 ＢｐＡＰ２基因的生物学功能
提供帮助和基础。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
２０１０年采自东北林业大学实验林场２０年生白
桦，由于白桦生殖发育周期比较长，并根据其雌雄花
的细胞学发育特征为依据［１］，因此雌花序于５月２８
日至７月１５日，每１２天取材１次；雄花序于７月１５
日至９月１日，每８ １１天取材１次。各组织如雌
花花柄、幼叶、幼叶柄、成熟叶、成熟叶柄、幼茎、老茎
（老茎用刀片刮取发育的次生木质部）取自７月１５
日；另于７月１７日取白桦雄花突变体和野生型的雌
花、雄花、幼叶、幼茎组织，经过液氮速冻后放入－８０
℃冰箱储存。ＡＰ２基因片段选自本研究小组所构建
的抑制消减杂交文库的ＥＳＴｓ［８］。
１．２ 总ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成
将叶片用液氮充分研磨后，加入７００μＬ冰浴缓
冲液（１．４ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣｌ，０．１ｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＣｌｐＨ
值８．０，０．０２５ｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡｐＨ值８．０）冰上放置
１０ｍｉｎ，４℃，１２０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 ２ｍｉｎ后去上
清，然后采用 ＣＴＡＢ法和 ＬｉＣｌ沉淀法提取总
ＲＮＡ［９］。其余部位直接采用ＣＴＡＢ法提取总ＲＮＡ。
各白桦组织的总 ＲＮＡ经 ＤＮａｓｅＩ（ＭＢＩ公司）消
化除去ＤＮＡ，并用 ＲＮＡ清洁纯化试剂盒（北京盖宁
金诺生物技术有限责任公司）纯化回收，０．８％琼脂
糖凝胶电泳检测，紫外分光光度计检测其纯度及
浓度。
以５μｇＲＮＡ为初始材料，反转录体系：５μｇ
ＲＮＡ，４．３μＬＯｌｉｇｏ（ｄＴ）（２０μｍｏｌ·Ｌ－１），ｄｄＨ２Ｏ
补足１２．５μＬ，６５℃，５ｍｉｎ，再加入４μＬ５×Ｂｕｆｅｒ，
０．５μＬＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，２μＬｄＮＴＰ，３μＬ反转
录酶，４２℃，２ｈ，７０℃，１０ｍｉｎ终止反应。进行 ｃＤ
ＮＡ链的合成。
１．３ 白桦 ＡＰ２基因 ５’和 ３’末端 ｃＤＮＡ的扩增
（ＲＡＣＥ）
取２０１０年５月２８日的雌花做模板，ＡＰ２基因
５’端的扩增序列按５’ＦｕｌＲＡＣＥＫｉｔ（ＴａＫａＲａ）说明
书进行操作，其５’ＲＡＣＥ的特异引物 ＧＳＰ１和 ＧＳＰ２
如表１所示。
３’ＲＡＣＥ的反转录体系为：总ＲＮＡ４．５μＬ，Ｏｌｉ
ｇｏ（ｄＴ）（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）１．５μＬ，７０℃ １０ｍｉｎ，冰浴
１５ｍｉｎ，加入 ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）２．５μＬ，ＲＴ
Ｂｕｆｅｒ（５×）５μＬ，ＲＴａｃｅ１μＬ，ＤＥＰＣＨ２Ｏ１０．５μＬ，
４２℃恒温反应１ｈ，反转录产物－２０℃保存备用。
设计３’ＲＡＣＥ的特异引物 ＧＳＰ１和 ＧＳＰ２，引物
序列如表 １。３’ＲＡＣＥＯｕｔｅｒＰＣＲ反应体系：模板
ｃＤＮＡ１μＬ，Ｂｕｆｅｒ２．５μＬ，Ｍｇ２＋ ２μＬ，ｄＮＴＰ（１０
ｍｍｏｌ· －１）０．５μＬ，Ｔａｑ酶０．１２５μＬ，３’ＲＡＣＥＯｕｔｅｒ
Ｐｒｉｍｅｒ１．２５μＬ，３’ＲＡＣＥＧＳＰ１１．２５μＬ，去离子水
补足总体积２５μＬ。３’ＲＡＣＥＯｕｔｅｒＰＣＲ反应条件：
９４℃３ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，６１℃３０ｓ，７２℃，１ｍｉｎ３０
ｓ，共２０个循环，７２℃延伸，１０ｍｉｎ。３’ＲＡＣＥＩｎｎｅｒ
ＰＣＲ反应体系与 ３’ＲＡＣＥＯｕｔｅｒＰＣＲ反应体系一
样，两引物分别为３’ＲＡＣＥＩｎｎｅｒＰｒｉｍｅｒ和３’ＲＡＣＥ
ＧＳＰ２。３’ＲＡＣＥＩｎｎｅｒＰＣＲ反应条件：９４℃ ３ｍｉｎ，
５５２
林 业 科 学 研 究 第２５卷
９４℃ ３０ｓ，５７℃３０ｓ，７２℃，１ｍｉｎ３０ｓ，共３０个
循环，７２℃延伸，１０ｍｉｎ。
分别将５’和３’ＲＡＣＥＩｎｎｅｒＰＣＲ产物进行琼脂
糖凝胶电泳，回收后连接到 ｐＭＤ１８Ｔ载体上，并转
化ＤＨ５α感受态细胞，由北京六合华大基因科技股
份有限公司测序。
表１ ５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ克隆引物序列
引物名称 引物序列（５’→３’）
５’ＲＡＣＥＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒ ＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＡ
５’ＲＡＣＥＩｎｎｅｒＰｒｉｍｅｒ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＧＡＴＧ
５’ＲＡＣＥＧＳＰ１ ＡＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＡＧＡＴＴＧＣＴＣ
５’ＲＡＣＥＧＳＰ２ ＣＴＧＴＴＴＣＡＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＡＧＴＣ
３’ＲＡＣＥＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒ ＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
３’ＲＡＣＥＩｎｎｅｒＰｒｉｍｅｒ ＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＡＣＴＡＧＴＧ
３’ＲＡＣＥＧＳＰ１ ＧＧＴＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡＣＡＴＡＴＧＧＧ
３’ＲＡＣＥＧＳＰ２ ＡＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧ
１．４ 白桦ＡＰ２基因全长ｃＤＮＡ的获得与序列分析
将测序结果利用 ＮＣＢＩ网站中的 ＢＬＡＳＴｎ程序
进行比对，同时通过 ＤＮＡＳｔａｒ软件将以上 ｃＤＮＡ片
段进行拼接获得ｃＤＮＡ全长序列。以其两端序列设
计特异引物扩增全长，并测序鉴定。用 ＢＬＡＳＴｘ程
序进行序列同源性搜索，并用 ＤＮＡＭＡＮ和 ＭＥＧＡ
４．０软件进行多序列比对并构建其系统进化树。用
ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件计算推导的蛋白质分子量、理论等
电点。
１．５ 半定量ＲＴＰＣＲ
以白桦肌动蛋白 Ａｃｔｉｎ基因作为内参基因［１０］，
根据已有的获得的白桦 ＡＰ２基因序列，利用 Ｐｒｉｍｅｒ
５．０设计特异引物，由北京华大生物公司合成，引物
序列如表２。
表２ Ａｃｔｉｎ和ＡＰ２引物序列
项目 引物
Ａｃｔｉｎ Ｕｐ：ＣＡＴＣＴＣＴＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧ
Ｄｏｗｎ：ＡＧＡＴＣＣＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＣＧ
ＡＰ２ Ｕｐ：ＧＣＡＡＧＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧ
Ｄｏｗｎ：ＴＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣ
将白桦各组织的反转录产物稀释 ２０倍作为
ＰＣＲ模板，ＰＣＲ反应体系：２μＬｃＤＮＡ，１．５μＬ正向
引物（１０μｍｏｌ·Ｌ－１），１．５μＬ反向引物（１０μｍｏｌ
·Ｌ－１），０．５μＬｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１），２．５μＬ
１０×Ｂｕｆｅｒ，２μＬＭｇＣｌ２，０．１５μＬＴａｑ酶（５Ｕ·μＬ
－１），用ｄｄＨ２Ｏ补足２５μＬ总体积。反应条件：９５
℃ ５ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃，３０ｓ，共３０
个循环，７２℃延伸，１０ｍｉｎ。２％琼脂糖凝胶电泳检
测，使用 ＧＥＮＥ全自动凝胶成像分析仪（ＳＹＮ
ＧＥＮＥ）照相。
１．６ ｑＲＴＰＣＲ
以白桦肌动蛋白Ａｃｔｉｎ基因作为内参基因，采用
ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ荧光染料（东
洋坊）进行 ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ反应，体系如下：ｃＤＮＡ２
μＬ，ＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬ，正向引物 （１０μｍｏｌ·Ｌ－１）
１μＬ，反向引物（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）１μＬ，用ｄｄＨ２Ｏ补
足总体积至 ２０μＬ。ＰＣＲ反应在荧光定量 ＰＣＲ仪
ＯｐｔｉｃｏｎＭｏｎｉｔｏｒⅡ上（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＤＮＡＥｎｇｉｎｅＯＰＴＩ
ＣＯＮ ＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍｓ）完成，程序为９５℃预变性
１ｍｉｎ３０ｓ，９５℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延
伸３０ｓ，７９℃１ｓ，读板。４０次循环。依文献［１１］进
行数据处理。
２ 结果与分析
２．１ 白桦ＡＰ２基因全长ｃＤＮＡ的克隆及序列分析
通过ＤＮＡＳｔａｒ软件进行拼接获得ｃＤＮＡ全长序
列，以其编码区两端序列设计特异引物扩增全长，并
测序鉴定（图１）。白桦ＡＰ２基因全长ｃＤＮＡ序列为
２１５４ｂｐ，５’非翻译区为４３２ｂｐ，３’非翻译区为１６８
ｂｐ，开放阅读框为１５５４ｂｐ，编码５１７个氨基酸，命
名为 ＢｐＡＰ２，并 在 ＧｅｎＢａｎｋ注 册，登 录 号 为
ＪＮ２４７４０８。预测编码蛋白的分子量为５６．７４ｋＤａ，理
论等电点为６．３４，此蛋白为一酸性蛋白。
Ｍ：ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００，１：５’ＲＡＣＥ扩增结果，２：３’ＲＡＣＥ
扩增结果，３：ＯＲＦ扩增结果
图１ 白桦ＢｐＡＰ２ｃＤＮＡ全长扩增
筛选出其它 １２种植物 ＡＰ２基因的序列，用
ＤＮＡＭＡＮ和 ＭＥＧＡ４．０进行比较分析，发现白桦与
拟南芥、蓖麻、毛果杨、节节麦、烟草的相似性高达
６５２
第２期 张 妍等：白桦ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）转录因子基因的分离及其表达
７０％以上，与葡萄、柑桔枳、苹果、矮牵牛、甘蓝型油
菜的亲缘关系相似性在６２％以上，与豌豆和黑松的
相似性较低，分别为５８％和５１％。
将白桦 ＢｐＡＰ２基因预测的氨基酸序列与其它
１２种植物ＡＰ２基因的氨基酸序列比较并构建进化
树（图２），发现毛果杨与蓖麻聚为一类，在进化上显
示亲缘关系最近，并与白桦、葡萄、苹果、矮牵牛、柑
桔枳、豌豆聚为一类，这为推测 ＢｐＡＰ２的功能提供
一定的线索；拟南芥与甘蓝型油菜聚为一类，然后再
同以上类群聚合在一起，最后与黑松、烟草、节节麦
聚在一起归于一类。其中节节麦在聚类中显示其进
化属较远分枝。
ＮＰ＿１９５４１０．１：拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．），ＡＤＵ０４４９９：甘蓝型油菜（ＢｒａｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．），ＡＣＧ６３７０７．１：柑桔枳（Ｃｉｔｒｕｓ
ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅＬ．），ＡＤＥ４１１３３．１：苹果（Ｍａｌｕｓ×ｄｏｍｅｓｔｉｃａ），ＡＡＤ３９４３９．１：矮牵牛（Ｐｅｔｕｎｉａ×ｈｙｂｒｉｄａ），ＡＡＫ１４３２６．１：豌豆
（ＰｉｓｕｍｓａｔｉｕｍＬｉｎｎ．），ＢＡＤ１６６０３．１：黑松（ＰｉｎｕｓｔｈｕｎｂｅｒｇｉＰａｒｌ．），ＸＰ＿００２３１０７１５．１：毛果杨（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ
Ｔｏｒ．ｅｔＧｒｏｙ），ＡＣＯ５２５０８．１：葡萄（ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＬ．），ＡＢＹ５３１０４：节节麦（ＡｅｇｉｌｏｐｓｔａｕｓｃｈｉＣｏｓｓ．），
ＡＣＹ３０４３５：烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．），ＸＰ＿００２５３４３９９．１：蓖麻（ＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓＬ．）。
图２ 不同物种ＡＰ２基因的系统进化关系
２．２ 白桦ＢｐＡＰ２基因的转录表达特征
以白桦肌动蛋白Ａｃｔｉｎ基因作为内参基因，利用
半定量及 ｑＲＴＰＣＲ方法对 ＢｐＡＰ２基因进行雌雄花
不同发育阶段的转录表达分析。结果表明，ＢｐＡＰ２
基因在白桦各个发育阶段中均有表达（图３．ＡＣ），
但表达量有差异（图３．Ｂ，Ｃ）。６月初至７月中旬是
雌花序胚胎发育的重要阶段，ＢｐＡＰ２在胚胎发育早
期的表达量较高，并逐渐增强，６月末其表达量达到
最高，但在胚胎发育后期表达量明显降低（图４）。７
月至９月是雄花序发育的重要阶段，在最初的减数
分裂时期（７月１５日—８月１４日）表达量较高，并呈
较小的降低趋势，然而在减数分裂完成后，单核小孢
子发育时期（８月２３日—９月１日）表达量较低，但
在９月初其表达量却出乎意料地上升（图５）。可以
看出，ＢｐＡＰ２基因可能参与雌雄花各阶段的发育。
Ａ：雌花序，５月２８日至７月１５日，每１２天取１次样；Ｂ：雄花序，７月１５日至９月１日，每８ １１天取１次样；Ｃ：７月１５日的雌花
序（ＦＩ）、雄花序（ＭＩ）、雌花花柄（ＦＦＨ）、幼叶（ＹＬ）、幼叶柄（ＹＰ）、成熟叶片（ＭＬ）、成熟叶柄（ＭＰ）、幼茎（ＹＳ）、成熟茎（ＭＳ）
图３ 白桦不同时期不同组织ＡＰ２ｍＲＮＡ水平的表达分析
７５２
林 业 科 学 研 究 第２５卷
图４ 白桦ＢｐＡＰ２基因在雌花序发育中的表达
图５ 白桦ＢｐＡＰ２基因在雄花序中的表达
另外，检测了ＢｐＡＰ２基因在不同组织中的表达
量差异。结果显示，不同组织中 ＢｐＡＰ２的表达量有
明显差异。在雌雄花的表达量较高，且在雄花序中
表达量最高，而在其它多数营养组织中表达较低（图
３，图６）。另外，在幼嫩组织中有较强表达，如幼叶
和幼茎高于成熟叶片和茎。但在叶柄中，却是成熟
叶柄高于幼嫩叶柄（图６）。这些结果表明：ＢｐＡＰ２
基因在各组织中均有不同程度的表达，推测该基因
参与各组织的发育，但其表达机制及调控发育的模
式在不同组织中有所差异。
７月１５日的雌花序（ＦＩ）、雄花序（ＭＩ）、雌花花柄（ＦＦＨ）、幼叶（ＹＬ）、
幼叶柄（ＹＰ）、幼茎（ＹＳ）、成熟叶（ＭＬ）、成熟叶柄（ＭＰ）、成熟茎（ＭＳ）
图６ 白桦不同组织ＢｐＡＰ２的转录表达特征
为了初步研究 ＢｐＡＰ２基因的功能，利用 ｑＲＴ
ＰＣＲ技术对野生型（ＷＴ）白桦和雄花序突变体（Ｍ）
进行该基因的表达比较（图７），该基因在突变植株
的雄花序、幼叶和幼茎中均为下调表达，在雌花序中
明显上调表达，而且在雌雄花序中的表达量和变化
幅度较大，说明ＢｐＡＰ２基因在雌雄花发育中具有重
要作用，但同时，它在突变体营养器官中表达受到抑
制，可能影响了其转录调控作用。
７月１７日的雄花（ＭＩ）、雌花（ＦＩ）、幼叶（ＹＬ）、幼茎（ＹＳ）
图７ 白桦ＢｐＡＰ２基因在野生型和突变型中的转录水平分析
３ 讨论
ＡＰ２基因作为花器官的Ａ类基因，是植物花发
育中一类重要的参与因子，参与植物生长、发育和
多种生理生化反应的信号转导［１２－１３］。本研究发现
白桦的ＢｐＡＰ２基因在花器官中的表达比其它组织
较高（图６），且发育初期高于后期，推测ＢｐＡＰ２基因
在花器官发育中起重要作用。但该基因在各营养组
织中有较大的表达差异，说明 ＢｐＡＰ２不是花器官特
异表达的基因，也参与营养器官的发育。在其它植
物中，ＡＰ２基因也有类似情况。周盛梅等［１４］分离了
苹果的ＭＡＰ２Ａ基因，发现 ＭＡＰ２Ａ在苹果的多种组
织中表达，例如花芽、萼片、花瓣、雌雄蕊、子房和叶
片，但在幼果中检测不到 ＭＡＰ２Ａ基因的表达，说明
ＭＡＰ２Ａ基因不仅调节花器官的发育，也参与营养组
织的调控。王晨等［１５］从葡萄中分离出 ＶｖＡＰ２基
因，试验证明ＶｖＡＰ２在花序和花中的表达明显高于
叶和茎，说明ＶｖＡＰ２对葡萄的营养与生殖器官的发
育具有不同的作用。
另外，白桦ＢｐＡＰ２基因在幼嫩组织（叶片和茎）
中的表达要高于成熟组织（叶片和茎）（图６），估计
该基因在分生组织发育中具有重要作用。ＭａｅｓＴａ
ｍａｒａ等［７］发现矮牵牛中的 ＰｈＡｐ２Ａ在幼嫩器官原基
中的表达均一，信号较强；随着器官成熟，在苞叶、萼
片、花瓣、子房壁等器官外层中的表达强度逐渐降
８５２
第２期 张 妍等：白桦ＡＰＥＴＡＬＡ２（ＡＰ２）转录因子基因的分离及其表达
低，直到消失。值得注意的是，ＢｐＡＰ２基因在幼嫩组
织中，叶柄中的表达量均低于叶片和茎，但成熟组织
中却均高于叶片和茎（图６），暗示着叶柄作为叶片
和茎的疏导通路，对该基因在这两种组织中的表达
起着一定的调节功能。
突变体是研究基因功能的理想材料，已找到天
然的白桦雄花序发育突变体，该突变体的雄花序明
显异常，表现为着生部位不同，发育迟缓，形态长且
细，花药初期为绿色，花药及雄配子体发育晚，小孢
子发育异常，在越冬后败育，不能散粉［１６］。分析了
ＢｐＡＰ２基因在该突变体与野生型不同组织中转录水
平的表达量，其结果预示 ＢｐＡＰ２基因在雌花发育中
起着重要作用，在突变体的雄花、幼叶及幼茎中表达
受到抑制。２００４年ＳｈｉｇｙｏＭｉｋａｏ［１７］从裸子植物黑松
中分离出 ＡＰ２的同系物 ＰｔＡＰ２Ｌ１和 ＰｔＡＰ２Ｌ２，发现
它们在花器官发育中起重要作用，ＰｔＡＰ２Ｌ１在雌球
花的整个发育阶段都有表达且表达强度高于雄球花
和营养叶片，而ＰｔＡＰ２Ｌ２在雌雄球花中均有表达，在
叶片中也有微量表达。植物 ＡＰ２转录因子的这种
多重功能在拟南芥中也有报道，拟南芥的 ＡＰ２基因
与胚、胚乳、种皮［１８］和雌蕊［６，１９］发育有关，并使雄蕊
数目减少［６］及萼片转化叶结构［２０］。
除模式植物拟南芥外，研究者们在其它物种中
对ＡＰ２基因也进行了一些研究。ＪｉｎｇＺｈｕａｎｇ等［１２］
从玉米中分离得到ＡＰ２ｌｉｋｅ基因，并在玉米的１８种
组织中检测ＡＰ２基因的表达，其中颖组织的表达水
平最高，而糊粉层中并没有 ＡＰ２基因的表达。Ｏｓ
ＡＰ２ＬＰ基因在水稻中优先在根、穗、成熟胚中表达，
但在胚胎发育和幼穗中起重要的作用［２１］。ＯｓＡＰ２１
基因在花和根中有高表达，在芽和叶中有微弱表达，
其转录物在成熟的花粉中也有出现［２２］。
需要指出的是，由于白桦雌雄花的结构特征限
制，选择雌雄花序进行ＢｐＡＰ２基因的ｑＲＴＰＣＲ表达
分析，尽管反映了在花序中的真实表达，但其中的花
序苞片会多少影响ＢｐＡＰ２基因在花器官（雌蕊和心
皮）中的真实表达，因此，后续研究有必要进行花器
官不同组织的定位表达和更为精准的转基因功能
研究。
由于ＡＰ２转录因子可通过不同方式与多类基
因形成一定的相互作用，比如ＡＰ２与 ＡＰ１是协同叠
加作用［２３］、ＡＰ２与 ＬＦＹ是相互正调作用、ＡＰ２与
ＴＦＬ是相互负调作用［２４－２５］、ＡＰ２与 ＡＧ是拮抗作
用［２０，２６］等，这些都在花发育过程中组成了复杂的调
控网络，影响着花发育的各个环节［１９］。因此，在研
究ＡＰ２在花发育中的作用时，应该同时关注这些基
因的表达及所控制的表型变化。
更为重要的是，作为植物花发育的一个关键基
因，ＡＰ２基因的生物学功能还有待于更系统深入的
研究，今后不仅仅在两性花植物中开展，如果选择单
性花植物或不完全花树种进行研究，将会更全面地
揭示该基因的功能及调节机制，这将是我们今后关
注和探索的重点。
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