全 文 ：第 4 卷 第 3 期
1 9 9 1 年 6 }J
林 业 科 学 研 究
FO R E S T R E S E A R CI丁
、, 0 1 . 4 , N o . 3
J u n
. ,
1 9 9 1
松毛虫质型多角体病毒杀虫剂
杂菌含量检测及控制方法研究 .
高志和 陈昌洁 王志贤 陶 粮
(中国林业科学研 究院林业研 究所 )
摘耍 对松毛虫质型多角体病毒杀虫剂中的杂菌检洲表明 , 制荆中不含高等动物致病 菌 , 细
菌不再继续增殖 。 抑灭菌试验表明 , 适当浓度的洗必泰 、 洁尔灭 、 磺胺及苯甲酸钾等对制剂中 的
真菌有控制效果 。 用丙酮按 1 : 1处理离心沉淀物使制剂中的杂菌含量减少了 1 0 。倍 。 用等 量 过饱
和乳糖丙酮处理离心沉淀物可获得粉剂。 经测定 , 除叠氮钠处理的制剂外 , 其它处理在 毒力上与
对照无差异 。
关. 周 松毛虫 , 质型多角体病毒杀虫剂 , 杂菌 , 检测 , 控制
松毛虫质型多角体病毒杀虫剂 , 目前主要采用活虫复制 、 捣碎 、 过滤 、 差速离心的方法
提取 I’, 2 1 , 制成水悬液。 在保存过程中与粉剂不同[ 3一 ‘】, 它具备了水这一杂菌生长 的 必 要条
件 。 因此 , 检测储存过程中杂菌的增殖情况 , 研究并提出有效的控制措施 , 是防止杂菌对制
剂质量产生影响的关键 。 以往对微生物杀虫剂除要求不含高等动物致病菌外 , 总是限定所含
杂菌的可接受水平 L。] , 而未考虑杂菌是否继续增殖 。 本文以松毛虫质型多角体病毒杀虫剂为
材料 , 检测高等动物致病菌 、 杂菌含量及增殖情况 , 并提出了控制杂菌增殖的有效措施 。
1 材料和方法
1
.
1 制荆的制备
取接种后中肠变白的病虫 , (经腐熟)按 1 , 1加水捣碎 , 按 1 , 10 加水过滤。 3的 ~ 5 0 0 r p m 、
30 5 弃沉淀 , 4 0 0 0 r p m 、 15 m in 弃上清液 , 反复两次 , 沉淀悬浮于水中保存备用 。
1
.
2 致病菌的检浦
制剂接种于 PBP , 置 37 ℃培养 4 ~ 6 h , 同时直接分离于 5 . 5 麦康开和碱 性 琼脂平
板 , 培养2 4 h 。 从 PB P 取 0 . 1 、 1 m l转接于 R : 。 和 KW P , R : 。于4 2 ℃培养 Z o h , KW P
于 37 ℃培养24 h , 然后同上分离 。
1
.
3 杂菌含 t 及其增殖情况 , 抑灭菌荆对杂, 的效果检洲
选用多角体(c P B)含量为50 ~ 2 0 亿(适于每亩用量)为一个小包装的制剂 , 于 28 ℃ 放置
8 天检测杂菌含量 , 同时设对照 。 制剂中加各种抑灭菌剂 , 终浓度分别为。. 2 % 、 0 . 02 % 、
0
.
0 0 2 %叠氮钠 , 0 . 1 % 、 0 . 0 1 % 、 0 . 0 0 1 %磺胺 , 0 。 0 1 % 、 0 . 0 0 1 % 畜吉尔 灭 , 0 一 0 0 3 % 、
本文于 1 98 9年 8 月 7 日收到。
* 北京 市卫生防疫站路文彬先生协助致病菌的检洲 , 本院王贵成先生提供部分试 虫 , 特此致谢,
3 期 高志和等 : 松毛虫质型多角体病毒杀虫剂杂菌含量检测及控制方法研究
。. 0 03 %盐酸洗必泰 , 28 ℃放置15 天检测杂菌含量 , 同时设对照 。 样品经 T Z 二3 型 台式旋
转振荡器 16 0 r p m 、 30 m in , 按范秀容介绍的方法 [v] , 检测杂菌含量及抑灭菌效 果。 培养基
选用 SD A + Y 培养基(真菌)[ s1 和 肉汤蛋白陈培养基 (细菌 )。
为验证抑灭菌剂的效果 , 取自制 剂 分 离所得 、 增殖后悬浮均匀的真菌 , 加少量SD A + Y ,
再加各种抑灭菌剂 , 终浓度分别为 o 。 02 % 、 0 . 01 % 、 0 . 0 05 % 、 。. 0 02 %叠氮钠 , 0 . 01 % 、
0
。
0 0 5 %
、
0
.
0 02 5 %
、
0
。
0 0 1 %磺 胺 , 0 。 0 1 % 、 0 . 0 0 1 %洁 尔 灭 , 0 . 0 0 3 % 、 0 。 0 0 0 3 %盐
酸洗必泰 , 于28 ℃放置 8 天后检测含菌量 , 同时设对照 。 检测方法同上 。
1
.
4 感病幼虫中肠中杂菌基救的检侧
取病变典型的活虫中肠 , 经加工(研磨)后检测杂菌含量 。 方法同前 。
1
.
5 笨甲酸钾与成胶对杂菌效果比较
方法同前 。
1
.
6 丙酮处理对杂菌的影晌及对制荆性状的形晌
用。. 1 、 。. 3 5 m l丙酮分别处理离心沉淀物4 20 m g , 搅动15 、 30 m in , 检 测杂菌含量 ,
同时设对照 。 检测方法 同上 。参考王贵成等 [’] 的试验方法 , 用过饱和乳糖丙酮 (2 . 6 9 / 1 0 0 m l)
按体积湿重比为 1 , 1及。. 5 : 1处理离心沉淀物 , 过夜后观察制剂性状 , 同时设对照 。
1
.
7 抑灭菌荆对制荆毒力的影晌
1
.
7
.
1 供试昆虫 舞毒蛾(L , m an tl ia d宕sP al ) , 3 龄虫采自林间 , 经室内观察无死亡后作试
虫。其余为人工饲料饲养的舞毒蛾 , 适应取食天然饲料后作试虫。
1
.
7
。
2 病毒悬液 将各种处理的制剂稀释成 1 X 1 08及 1 x l护 CPB / m lo
1
.
7
.
3 感染程序 用1 / 10 0 。洗衣粉清洗大小一致的杨树叶 , 阴凉处风干 。 将各种处理的制
荆分别等量均匀地涂于叶面上 , 阴凉风干。 喂养饥饿24 h 的试虫。
1
.
7
.
4 检查方法 每天更换饲料 , 收集死虫 , 观察典型症状结合镜检确认 是 否 为 CPv 所
致 。 同时设对照 。
2 结果与分析
2
.
1 致病菌的检洲
在松毛虫质型多角体病毒杀虫剂中 , 未检测出与人有关的霍乱及副霍乱弧菌 、沙门氏菌 、
志贺氏菌 。 证明该制剂不含致病菌 。
2
.
2 杂菌增殖惰况及抑灭菌荆对杂菌的控制效果
在常温条件下 , 制剂中的细菌不再增殖(表 1 , 2 ) , 而真菌总数无 论 在28 ℃保 存 8 或
15 天 (表 1 一 3 ) , 还是在 4 ℃保存60 天(表 2 ) , 均有增多现象 。 文中所列的抑灭菌剂对制剂
中的真菌及高含量真菌均有控制效果(表 2 , 3 ) 。 抑灭菌试验结果表 明, 0 . 02 %叠 氮 钠 、
。. 01 %磺胺、 。。 0 1 %洁尔灭 、 o 。 003 %盐酸洗必泰均可抑灭制剂中的真菌 。 又经苯甲酸 钾
与磺胺比较发现 , 0 。 01 %苯甲酸钾对制剂中真菌的效果比。。 1 %磺胺好 , 两者只对处于代谢
活动状态下的某些生物有作用 , 故为理想的抑灭杂菌剂。 各种抑灭菌剂的使用浓度很低 , 几
乎不影响制剂的成本。
杂菌基数的检测结果为 , 当多角体含量为36 . l x 10s 个 / m l时 , 细菌含量为 1 2 4 0 个/ m l ,
真菌含量为 。。 由此可知, 制剂中的细菌含量 (细菌 / CPB )比加工前增加了1 0 0 0倍以上 , 制
2 82 林 业 科 学 研 究 4 卷
常通下翻荆中二的幼班悄况
病毒含t
衰 1
细 菌 真
处理项口
(Cp B / m L ) 适宜稀度 平均翻落数(个 / 皿 )
总 菌 数
( x 1 0 . 个/ m L ) 适宜稀度
平均苗落数
(个/ 皿 )
处 理 前
2 8 ℃/ s d
连0 X 1 0 .
4 0 x 1 0 8
1 0一
1 0一
7 2
.
3
4 3
.
0
3 6 2
2 1 5
10
一 1
1 0
一 l
3
.
5
9
.
5
菌 ¹
总 菌 数
( x 10 个 / m L )
17
.
5
47
.
5
¹ 于 S D A + Y 培养墓 增殖后 , 经虫体体表和添食松毛虫接种 , 未 发现有致病性 。
裹 2 28 ℃/ 15 d抑灭 . 荆对杂. 的效果
抑 灭蔺荆终浓度 病毒含址 细 , 真 菌¹
(% )
(C p B / m L) 适宜稀度 平均 , 落数(个 /皿 )
总 菌 我
( x 10 . 个 / m L ) 适宜稀度 平均菌落 数(个/ 皿 )
总 菌 数
( x 10 , 个/ m L)
0
.
2
0
.
02
0
.
0 0 2
0
,
1
0
.
01
0
.
0 0 1
处 理 前
对 照 1
对 照 2
32 X 10 a
3 2 X 10 .
32 x 1 0 .
3 2 X 10 .
3 2 x 10 .
32 X 1 0 a
32 x 10 ,
3 2 x 1O S
3 2 X 10 ,
10 一 ,
10 一 ,
10 一 5
6 2
.
0
6 9
.
1
5 4
.
0
31
.
0
3 4
.
7
2 7
.
0
10 一 1
10 一 2
10 一 3 28
.
0 140
10 一 ,
1 0一 ,
10 一 5
5 6
.
0
5 6
.
0
6 2
.
5
2 8
.
0
2 8
.
0
3 1
。
3
10 一 l
10 ‘ 盆
10 一 , 26 . 0
: 3
:
亚钠成据胺
:::: 1
4
.
3
30
.
2
10 一 l
10 一 2
10 一 3
4
.
5
35
.
5
5 O
0
.
225
17
,
8
25 0
5自」2860
¹ 除处理前及对照 1 外 , 其它样品又经冰箱保存60 天 。
裹 3 28 ’O /8 d抑灭. 荆对育含t 宾. 的效果
抑灭菌剂
终浓度
( % )
适宜
稀度
10 一 l
10 一 l
10 一 遥
10 ’ 2
10一
10 一 :
1 0一 2
1 0一 2
10 一 2
10 一 奋
1 0一
1 0 一 ‘
10一
10 一 ‘
10一
平 均菌落数
(个/皿 )
总 蔺 教
(个/ m L )
0
3
.
6 2 x 10 .
10 5 x 10 .
,Unl
.碑
0CUO
,自‘上Unn“
,‘山
沽 尔 灭
洗 必 泰
0
.
0 1
0
.
0 0 1
0
.
0 0 3
0
.
0 0 0 3
对 照 (2 8 ℃/ s d )
. 沉 纳
0
.
0 2
0
.
0 1
0
.
0 0 5
0
.
0 0 2
1 1 8 x 1o .
2 30 大 1 0 .
2 30 减 1 0 .
22 5 x 1 o .
口‘比Un.
.⋯品Jno6工b2月,4‘磺 胺 0 . 0 10 . 0 0 50 . 0 02 5
0
.
0 01
一勺八甘对 照 ( 28 ℃ / s d )
冰箱保存
4 4
.
1 3
。
2 2 3 x 1 0 .
4 5
.
0 x 1 0 .
剂中所检出的真菌为污染 、 增殖的结果。
2
.
3 丙翻对杂, 含 , 及翻荆性状的形晌
用丙酮处理制剂可降低杂菌含量 。 当体
积湿重比达 1 : 1时 , 不仅使全部真菌丧失 生
物活性 , 且使杂菌总量降低 3 个对数值 。 经
丙酮处理后 , 制剂中多角体与杂菌的数量比
值约为 1 . 4 x 10 4 , 这与某些粉剂相 当[, ’] 。
获得 1 0 亿多角体的丙酮用量为 l m l, 与 加
工等量多角体粉剂的丙酮损失量相当 [’J 。 增
加离心次数不能使杂菌含量减少 (表 4 ) 。 用
过饱和乳搪丙酮按体积湿重比 1 : l 处理离心
沉淀物 , 可获得粉剂 , 而用等量丙酮及1 /2 量
过饱和乳塘丙酮处理未能得到粉剂 (表 5 ) 。
2
.
4 活性洲定
生测结果表明 , 除叠氮钠外 , 未发现抑灭
菌剂对制剂毒力有影响(表 6 ) 。 比较表 2 、
3 中叠氮钠对杂菌的效果可看出 , 当样品中
3 期 高志和等 : 松毛虫质型多角体病毒杀虫剂杂菌含量检测及控制方法研究
含有病毒时 , 其对杂菌的效果不如样
之旁证。 因为叠氮钠作用于病毒后 ,
表 4
丙酮用量 病 毒
含 玺 湿 重
品中没有病毒时好 , 这可做为叠氮钠对病毒活力有影响
使其对杂菌的有效浓度有所减少 。
丙用对翻荆中杂, 的效果
细 菌 真 菌
(m l) (e P B / m l) (rn g / m l)
适宜
稀度
平均菌落数 总 菌 数 适宜 平均菌落数 总 菌 数
(个/ 皿) (K IO6 个/ m l) 稀度 (个/ 皿 ) (x l o 个 / m l)
C
.
1
0
.
3 5
对 照
离 心一次
4 0 义 1 0 8
40 X 1 08
40 X 1 0 5
4 0 X IO8
4 2 0
4 2 0
4 2 0
4 2 0
1 0
一 1 1
.
0 5
.
0
::〔: 5 8 ·96 9 . 勺
1 7 8
0 2 9
3 4 8
3 62
::刃
1 0一 7 2 3
3
.
0
3 5
1 5
。
0
1 7
.
5
表 5 过饱和乳摘丙砚 (过夜)对翻荆性状的影晌
制 剂 病 毒 含 量
处 理 方 法 性 状
(CPB / m l) (m g / m l)
过饱和 乳搪丙酮(体积) : 制荆(湿重) = 1 : 1
过饱和乳锗丙酮(体积) , 制剂(湿重 ) = 0 . 5 : 1
丙酮 (体积) , 制剂(湿重) 二 1 : 1
4 0 x 1 0 。
4 0 x 1 0 ,
4 0 X 1 0 8
粉 状
湿粘 、 结块
湿枯 、 结块
n甘‘Un乃‘2,自月任‘,4
表 G 各种样品对扭弃峨的活性侧定
抑灭菌荆终浓度
(% )
处理时间
(℃ / d )
供试 虫龄 接毒浓度 20 d 累计 L T 50虫数 死 亡 率
(头 ) (龄) ( CP B / m l) (% ) ( d )
处理时间
(℃/ d )
供试 虫龄 接毒浓度 20 d 累计
虫数 死 亡 率
(头) (龄 ) ( CPB / m l) ( % )
‘尔灭。·。‘ “8‘, “ 5 0 3 , X ‘。。 “。· ” , “·5 ,
J
, “‘。一“‘。 ‘5 5 初 “ ‘。? 5 3 · 3
盐成洗必泰0 · 0 0 3 “8 / 1 0 “。 “ 1 “ 1 0 “ ”6 · 5 1 8 ·8 9 {2 8长10 一4 / 4 0 1 5 “初 1 ‘ 1 0{ “o · 0对 _ _ ‘ 照 . 2 8“。 5 。 “ x ‘。’ 6。’。 ‘, ·8‘ }2 8‘, 0 一“‘。 ’5 5 初 ’x , 。{ e 。‘。烫笋铂。· 0 2 “8找1 5一4 / 3 6 5 5 0 ” 1 x 1 0{ 2 6 · 1 一 {2 8长15 一4 / 3 6 5 1 5 5 初 1 x 1 0 : 2 0 · 0硕服 0 · 1 “, / 15一 4 / 3 6 5 5 0 3 1 火 1 0 “ “3 · 0 1 7 ·6 9 }2 81 1 5 一4 / 3 6 5 1 5 5 初 1 又 1 0{ “6 · 7对 照 2 ,“ 5一“ 3 6 5 5 。 “ x ‘。“ 6 0 · , ‘8 ·3‘ }2, “ 5 一“3 6 5 ‘5 5 初 ‘ x ‘。‘ 右0 ·。健 虫 一 ‘6 3 一 0 一 } 一 1 5 5 初 一 o
3 讨 论
松毛虫质型多角体病毒杀虫剂中的细菌不再增殖属首次报道。 这表明, 细菌主要起破坏
昆虫组织 , 释放病毒的作用 , 因此不会影响制剂中病毒的质量 。 至于细菌总数略有减少 , 则
为自身消耗或环境不适所致 。 由于真菌能继续增殖 , 其必然以制剂中的成份为营养原 , 产生
代谢产物 。 因此 , 在制剂保存过程中有必要控制真菌增殖 。 对于微生物杀虫剂 , 特别是病毒
杀虫剂 , 只要不含高等动物致病菌 , 杂菌不增殖 , 就不必限定所含杂菌的可接受水平 。
用过饱和乳糖丙酮处理离心沉淀物 , 得到了粉剂 。 该法为制剂生 产提 供 了与 常规 方
法少“l不同的加工途径。 它比传统法多了离心步骤 , 但大大节约了丙酮 , 简化了处理 , 省 去
了回收程序 , 但制剂经丙酮处理后活性是否受影响有待测定 。
研 究
今 考 文 献
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,
L , 沉a n tr ia d is 尸。r , E n to m o 尸ha 夕a , 2 5 (i ) .
学一科一2 8 4 林 业
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D e te c tio n s o n the O the r M ic r o bia l C o
n ta m in a n ts in
the C P犷 In s e c tie id e fo r P in e C a te r Pilla r a o d
S tu d ie s o n the C o n tr o l M
e tho d s
G a o Z hih e Ch e n Ch a n g jie W a n g Z h ix ia n T a o L ia n g
(T 人e R 口: 心a r e h I n : tft“te o f F o r e str , C A F )
A b str ae t T h e r e s u lts o f d e te e tio n s o n the m ie r o b ia l e o n ta m in a n ts in
CPV a g e n t fo r Pin e C a te r Pilla r (D e 作d , 0 11用u s s p p . ) 3 h o w e d th a t th e r e w e r e
n o t e n te r ie Pa th o g e n ie m ie r o o r g a n ism s fo r h u m a n b e in g s in th e a g e n t
,
the
g e r m in th e a g e n t w a s n o t g e n e r a t iv e a n d th e fu n g u s in th e a g e n t e o u ld
b e e o n tr o lle d b y in h ib ito r s a n d d is in fe e t a n t只 Pr a e tie e d in the te s t
.
T he
m ic r o b ia l e o n ta m in a n ts in th e a g e n t w e r e d e e r e a s e d b y a th o u s a n d t im e s
w h e n th e Pe lle t o f t h e a g e n t w a s tr e a te d w ith a e e to n e
, v o lu m e / w e t
一
w e ig h t
二 l : 1 . A Po w d e r w a s e a s ily o bta in e d t h r o u g h t r e a tin g the Pe lle t o f t h e
a g e n t w ith s u Pe r s a tu r a te d
一
la e to s e
一
a e e to n e in th e r a tio o f 一: 1 . T h e r e s u lts
o f b io a ss a y sh o w e d th a t th e tr e a te d a n d u n t r e a te d a g e n t3 d id n o t in d ie a te
a n y e v id e n t d if fe r e n e e in Pa th o g e n ie ity e x e ePt th e s a m Ple t r e a te d w ith
so d iu m a z id e
.
K e y w o r d s Pin e Ca te rPilla r : CP V in se e tie id e ; o th e r m ie r o b ia l e o n t a m :
in a n ts ; d e t e e tio n ; c o n t ro l
-