全 文 ：思茅松毛虫肠道脂肪酶高产菌株的筛选
及其酶特性研究
*
龚秀会1，缪福俊2，3，王宏虬1，陈 剑2，3，卢芃源1，任 毅1
(1. 西南林业大学，云南 昆明 650224;2. 国家林业局重点开放性实验室云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室;
云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南 昆明 650201;3. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201)
摘要:从思茅松毛虫幼虫肠道中分离出 3 属 7 株产脂肪酶菌，以思茅松松节油为底物，筛选高产脂肪酶菌株，
测定脂肪酶活性，确定酶解特性，生长量和产酶特性。结果表明:以思茅松松节油和橄榄油为底物时，7 株产脂
肪酶菌均表现出不同的产脂肪酶活性，其中以菌株 D12 的产脂肪酶活性最高。以思茅松松节油为底物时，菌株
D12 的脂肪酶活力高达 4. 06 U·mL －1;菌株 D12 为中温型产碱性脂肪酶菌株，最适作用温度 40℃，最适 pH 值
为 8. 0;菌株 D12 经发酵至 60 h时，OD600值高达 0. 68，说明其生长量达到最大，在 48 h 左右时酶活力达到最
高，为 6. 6 U·mL －1。
关键词:思茅松毛虫;脂肪酶;高产;酶特性
中图分类号:Q 93;S 763. 42 + 1 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2013)03 － 0103 － 04
Screening for High Lipase-producing Bacteria Strains from Intestinal Canal
of Dendrolimus kikuchii and Properties of Lipases
GONG Xiu-hui1，MIAO Fu-jun2，3，WANG Hong-qiu1，CHEN Jian2，3，LU Peng-yuan1，ＲEN Yi1
(1. Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P. Ｒ. China;2. Yunnan Laboratory for Conservation of Ｒare，Endangered ＆
Endemic Forest Plants，Public Key Laboratory of the State Forestry Administration;Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and
Exploitation of Forest Plants，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China;3. Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China)
Abstract:Seven lipase-producing bacterial strains isolated from the intestinal canal of Dendrolimus kikuchii were
studied to screening for the strains with the promising ability of producing lipase． Taking turpentine oil of Pinus
kesiya var. langbianensis as the reaction substrate，the activities of the lipase were determined，growth of bacteria
and characteristics of lipase producing were identified． The results indicated that taking turpentine oil of Pinus
kesiya var. langbianensis and olive oil as the substrates，all seven strains showed the activities of lipase producing，
the ability of lipase produced by strain D12 was the highest． Taking turpentine oil of Pinus kesiya var． langbianen-
sis as the substrate，the activity of lipase produced by D12 reached 4. 06 U·mL －1 ． The experimental results
showed that D12 was a medium temperature alkaline lipase producing bacteria strain，with the optimum reaction
temperature and pH of 40℃ and 8. 0 respectively． At the fermentation time of 60 h，the OD600 of D12 was 0. 68，
which indicated highest growth increment of the strain． As far as the enzyme activity was concerned，the activity at
48 h was the highest，which was 6. 6 U·mL －1 ．
第 42 卷 第 3 期
2013 年 06 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 42 No. 3
Jun. 2013
* 收稿日期:2013 － 03 － 20
基金项目:西南林业大学大型仪器设备共享平台资助，云南省高等学校特色专业点建设项目 (特色专业生物技术，50116001)资助，
林木生物技术示范中心 (50116009)资助。
第一作者简介:龚秀会 (1978 －) ，女，云南曲靖人，实验师，主要从事生物技术方面的研究。
通讯作者简介:缪福俊 (1986 －) ，男，甘肃兰州人，研究实习员，硕士，主要从事微生物学和植物生物技术研究。
DOI:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2013.03.005
Key words:Dendrolimus kikuchii;lipase;high yield;enzyme characteristics
思茅松 (Pinus kesiya var. langbianensis)为材、
脂兼用树种，具有速生、优质、高产脂和生态适应
性强等特点，在云南省已大规模种植，其松脂产量
占云南省松脂产量的 80 %以上，为主要林业经济
树种［1 ～ 3］。思茅松毛虫 (Dendrolimus kikuchii)属
鳞翅目 (Lepidoptera)枯叶蛾科 (Lasiocampidae) ，
是我国最严重的森林害虫之一，对思茅松的材、脂
生长造成严重的影响。但从资源学的角度来看，松
毛虫是一类具有很大开发价值的资源，其肠道内寄
居着大量的细菌;正常的肠道细菌是昆虫寄主生长
发育、繁殖所必须的［4 ～ 6］。随着微生物鉴定技术和
胃肠道微生态理论的研究逐步深入，昆虫肠道微生
物的研究也进入了一个新的时期［7］。脂肪酶是一
类在油水界面将天然底物油脂降解为甘油和游离脂
肪酸的酶，广泛存在于动物、植物和微生物
中［8 ～ 10］。由于微生物脂肪酶比动植物脂肪酶作用
的温度和 pH 范围宽，易获得较高纯度酶制剂，适
合于工业上大规模生产［11］。目前国内外对思茅松
毛虫的研究主要集中在对其防治方面［12 ～ 14］，相关
产酶微生物资源研究主要是从土壤、淤泥中分离筛
选，而对思茅松毛虫的利用以及其肠道微生物的研
究还鲜见报道［15］。本项研究所用 7 株菌是从思茅
松毛虫幼虫肠道中分离得到，通过 16S rDNA 序列
测定，构建系统发育树，归为 3 个属。以这 7 株产
脂肪酶菌为试验材料，筛选高产脂肪酶菌株并研究
其相关酶学特性，为昆虫肠道产脂肪酶资源微生物
的深入研究提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 试验菌株
参试的 7株菌株是从思茅松毛虫幼虫肠道中分
离得到，其中 D2、D12、D19 为假单胞菌属(Pseudo-
monas spp.)，D7、D17为芽胞杆菌属(Bacillus spp.)，
D9、D16为克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)［16］。
1. 1. 2 培养基［17 ～ 18］
(1)活化培养基 (g·L －1) 牛肉膏 5. 0，蛋
白胨，橄榄油 20. 0 mL，琼脂 15. 0，pH 7. 0。
(2)种子培养基 LB 培养基。
(3)筛选培养基 (g·L －1) 酵母膏 5. 0，
(NH4)2SO4 5. 0，K2HPO4 2. 0，MgSO4·7H2O 0. 5，
NaCl 3. 0，橄榄油 20. 0 mL，思茅松松节油 20 mL，
pH值 7. 0。
(4)发酵培养基 (g·L －1) 酵母膏 5. 0，
(NH4)2SO4 5. 0，K2HPO4 2. 0，MgSO4·7H2O 0. 5，
NaCl 3. 0，思茅松松节油 20 mL，pH 8. 0。
1. 2 试验方法［19］
1. 2. 1 高产脂肪酶菌株筛选
将 7株菌株分别接种到活化培养基上进行活化
处理，挑取单菌落于种子培养基中培养 12 h，以接种
量 10 %于筛选培养液中培养，48 h后测定脂肪酶活
性。研究长期寄生于思茅松毛虫肠道内的脂肪酶产
生菌，以思茅松松节油为底物，橄榄油作对照底物
(脂肪酶产生菌分离的培养基多以橄榄油为底物)。
1. 2. 2 脂肪酶活力测定
采用醋酸铜比色法测定菌株的脂肪酶活力［20］。
1. 2. 3 高产菌株酶解特性、生长量、产酶特性确定
设置 5 个反应温度梯度 (25℃、30℃、35℃、
40℃、45 ℃)和 5 个 pH 梯度 (5. 0、6. 0、7. 0、
8. 0、9. 0) ，测定酶活力，确定最适宜温度;在确
定最适宜的温度条件下，确定最适宜 pH 值。菌株
D12 接种于发酵培养液中继续培养 24 h 后每隔 12
h检测 D12 生长量 (依据菌数越多，光密度越大的
原理，采用间接计数比浊法测定菌株生长量，利用
分光光度计在 OD600波长下测定培养液的吸收值)
和酶活力。
2 结果与分析
2. 1 高产脂肪酶菌株的筛选结果
橄榄油和思茅松松节油 2 种底物对 7 株菌株产
脂肪酶活力的影响见图 1。
从图 1 可知，7 株菌株对橄榄油和思茅松松节
油的水解活性不同，菌株在以思茅松松节油为底物
时酶活性大于橄榄油为对照底物时的酶活性，说明
从思茅松毛虫中分离的菌株对思茅松松脂松节油底
物具有专一性。以 2 种油为底物时，菌株的酶活力
均表现为假单胞菌属 (D2、D12、D19) ＞克雷伯
氏菌属 (D9、D16) ＞ 芽胞杆菌属 (D7、D17) ，
其中假单胞菌属中菌株 D12 的酶活力最大。以橄
榄油为底物时，酶活性达到 3. 85 U·mL －1;以思
茅松松节油为底物时，酶活性高达 4. 06 U·mL －1，
初步确定该菌株为高产脂肪酶菌株。
401 西 部 林 业 科 学 2013 年
图 1 橄榄油和思茅松松节油 2 种底物对 7 株
菌株产脂肪酶活力的影响
Fig. 1 Effects of two different substrates namely Turpentine in
Pinus kesiya var. langbianensis and olive oil on lipase
producing abilities of seven tested bacteria strains
2. 2 高产脂肪酶菌株 D12 的酶学性质分析
在酶学性质分析研究中，温度和 pH是其中最
重要的两项指标，酶对温度和 pH变化的响应也是最
敏感的。对温度的响应可以分为耐高温酶、中温酶
和耐低温酶 3 种，对 pH 的响应可分为酸性酶、中
性酶和碱性酶 3 种。高产脂肪酶菌株 D12 在不同
反应温度下的酶活力值见图 2a，菌株 D12 的最适
宜温度为 40℃，其酶活力达 4. 2 U·mL －1，且最
适温度前后变化幅度较大。在最适宜温度 40℃条
件下，不同 pH处理对菌株 D12 的酶活力影响见图
2b，在 pH值为 8. 0 时，酶活力高达 4. 0 U·mL －1，
说明菌株 D12 为中温产碱性脂肪酶菌。
2. 3 高产脂肪酶菌株生长及产酶特性
高产脂肪酶菌株 D12 在不同的培养时间检测
其 OD600值，从而来衡量 D12 的生物量。由图 3 可
以看出，菌株 D12 的生长量是随着培养时间的增
长而增加，在 60 h 时出现生长高峰，其 OD600值为
0. 68，然后趋于平衡，说明菌株 D12 在培养 60 h
左右时其生长量达到了最大值 (图 3a)。而在菌株
生长对数期，其脂肪酶活性随菌体生长量增加而上
升，到达 48 h 时表现出较高的酶活性，酶活力值
高达 6. 6 U·mL －1，随后缓慢下降 (图 3b) ，说明
在菌株生长对数期时，产脂肪酶能力较高，这为后
期菌株的诱变育种奠定了理论基础。
图 2 温度与 pH对高产脂肪酶菌株 D12 酶活力的影响
Fig. 2 Effects of temperature and pH on the enzyme activity of lipase produced by D12 strain
图 3 菌株 D12 生长量与产酶特性
Fig. 3 Growth and enzyme producing characteristics of D12 strain
501第 3 期 龚秀会等:思茅松毛虫肠道脂肪酶高产菌株的筛选及其酶特性研究
3 结语
从 7 株思茅松毛虫肠道产脂肪酶的菌株中筛选
出 1 株高产脂肪酶菌株 D12，以思茅松松节油为单
一底物时，表现出较高的脂肪酶活性，经过对该菌
株的生长、产酶最适条件和酶学特性研究，确定菌
株 D12 为中温产碱性脂肪酶菌，其最适宜温度为
40℃，最适 pH值为 8. 0。菌株 D12 经发酵至 60 h
时生长量达到最大 (OD600值为 0. 68) ，在 48 h 左
右时酶活力达到最高 (6. 6 U·mL －1) ，对该高产
菌株的相关生理机制还有待进一步的研究。
目前发现能产脂肪酶和用于工业生产的细菌有
28 个属，主要有伯克霍尔德氏菌属 (Burkholde-
ria)、无色杆菌属 (Photorhabdus)、芽胞杆菌属
(Bacillus)、色杆菌属 (Chromobacterium)、产碱菌
属 (Alcaligenes)、节杆菌属 (Arthrobacter)和假单
胞菌属 (Pseudomonas)7 个属的细菌［21］。本项研
究对 7 株思茅松毛虫肠道分离的产脂肪酶菌进行相
关酶学研究，从中筛选出 1 株中温产碱性脂肪酶菌
株 D12，属于假单胞菌属。在轻工食品、环保及疾
病治疗等能产脂肪酶的工业用细菌中缺少中温碱性
脂肪酶菌，致使脂肪酶的生产发展滞后，该株菌的
发现为相关资源微生物的开发提供了一个新的选
择。但该菌株的酶活力与已报道的高产酶菌株酶活
力［22］ (在最适产酶条件:葡萄糖 10. 0 g /L，蛋白
胨 6. 0 g /L，pH值 6. 0，发酵温度 42℃时培养 72 h
后最高酶活力高达 245 U·mL －1)还有很大的差
距，有待于进一步的实验研究。这 7 株产脂肪酶菌
以思茅松松节油为底物时，均表现出较强的脂肪酶
活性，对这 7 株菌株进行产酶条件优化或通过诱变
育种等手段，可进一步提高其产酶能力，有望用于
工业化生产。
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