全 文 ：书第 51 卷 第 3 期
2 0 1 5 年 3 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 3
Mar．，2 0 1 5
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20150319
收稿日期: 2014 － 06 － 10; 修回日期:2014 － 10 － 05。
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 31070603 ) ; 湖南省自然科学基金项目 ( 14JJ2104 ) ; 中南林业科技大学青年基金重点项目
(QJ2011008A)。
* 谭晓风为通讯作者。
油茶丙二酰单酰 CoA:ACP转酰基酶基因的克隆与原核表达 *
王建勇1 谭晓风1 陈鸿鹏2 曾艳玲1 龙洪旭1 梅芳芳3 刘 凯4
(1．中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 长沙 410004;
2．国家林业局桉树研究开发中心 湛江 524022; 3．华中师范大学生命科学学院 武汉 430079; 4．广西林业科学研究院 南宁 530001)
摘 要: 【目的】油茶种仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响，这些都严重影响和制约了油茶产业的快速发
展。丙二酰单酰 CoA:ACP 转酰酶是脂肪酸合成酶(FASⅡ)复合体的组成酶之一，在脂肪酸合成中起着装载作用，
它的酶促反应产物丙二酰单酰 ACP 是脂肪酸合成关键组成部分。开展该基因的功能研究，能为油茶的分子遗传育
种奠定基础。【方法】以油茶品种‘华硕’种子为材料，借助其种子转录组和表达谱数据库，通过 ＲACE 技术，克隆
丙二酰单酰 CoA:ACP 转酰酶基因并对该基因进行生物信息学分析。利用常规的酶切连接技术构建基因的原核表
达载体，并利用 α 酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性。【结果】丙二酰单酰 CoA:ACP 转酰酶
基因的全长 cDNA 1 867 bp，含有 1 131 bp 的开放读码框，编码 376 个氨基酸，具有 58 个氨基酸长度的叶绿体转运
肽，该基因被命名为 CoMCAT (GenBank 登录号 KJ910337)。在 malonyl-CoA 结合位点和 ACP 结合位点上分别存在
高度保守的基序“GQGXQ”和“GXSXG”。原核表达载体 pET30a-CoMCAT 在 BL21 (DE3)细胞中被成功地诱导表
达，目的重组蛋白分子量约为 40 kDa。酶活性分析表明，重组蛋白 CoMCAT 的最佳催化温度为30 ℃，最佳 pH 为
7. 0，比酶活性约为 2. 384 U·μg － 1。【结论】以本实验室构建的油茶转录组数据库为基础，首次克隆获得油茶 MCAT
基因的全长 cDNA 序列，构建其原核表达载体在宿主细胞 BL21(DE3)中成功诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进
行初步的酶活性分析。研究结果为今后进一步深入开展和揭示油茶 MCAT 基因在油脂合成的代谢过程中的作用
奠定基础。
关键词: 油茶; 丙二酰单酰 CoA:ACP 转酰酶; 基因克隆; 原核表达; 酶活性
中图分类号:S718. 46 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2015)03 － 0148 － 07
Cloning and Prokaryotic Expression of a Malonyl-CoA:ACP
Transacylase Gene from Camellia oleifera
Wang Jianyong 1 Tan Xiaofeng 1 Chen Hongpeng 2 Zeng Yanling 1 Long Hongxu 1 Mei Fangfang 3 Liu Kai 4
(1 ． Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Ministry of Education Key Laboratory of
Non-Wood Forest Product of State Forestry Administration Central South University of Forestry and Technology
Changsha 410004; 2 ． China Eucalypt Ｒesearch Centre Zhanjiang 524022; 3 ． College of Life Sciences，
Central China Normal University Wuhan 430079; 4 ． Guangxi Academy of Forestry Nanning 530001)
Abstract: 【Objective】 Camellia oleifera is one of the four famous woody plants for edible oil in China． Camellia oil is
a high quality and edible oil，mostly composed of unsaturated fatty acids (UFA)，such as oleic acid and linoleic acid，
and the average UFA content in Camellia oil is above 90% ． But oil content of oil-tea seeds is low and vulnerable to
adverse environmental conditions，restricting rapid development of the Camellia oil industry． Cloned pivotal genes from C．
oleifera can be used as a biotechnological alternative for improving the molecular breeding of C． oleifera． Malonyl-CoA:
ACP transacylase is one part of the fatty acid synthase ( FAS Ⅱ ) complex，which is responsible for transferring the
malonyl group from malonyl-CoA to the holo-acyl carrier protein (ACP) ． Malonyl-ACP，the product of this enzymatic
reaction，is the key building block for de novo fatty acid biosynthesis．【Method】Seeds of the variety C． oleifera
‘Huashuo’were used for ＲNA extraction，and a full-length cDNA of malonyl-CoA:ACP transacylase gene in seeds was
cloned using ＲACE technique． Transcriptome data and expression profiles of C． oleifera seeds were used for bioinformatics
analysis of the gene． Normal techniques of digestion and connection was used to construct prokaryotic expression vector，
and the α-ketoglutarate dehydrogenase ( KDH )-coupled assay system was used to detect the enzymatic activity of the
第 3 期 王建勇等: 油茶丙二酰单酰 CoA: ACP 转酰基酶基因的克隆与原核表达
expressed product．【Ｒesult】The cDNA of CoMCAT was 1 867 bp with an open reading frame of 1 131 bp encoding 376
amino acids． It was named as CoMCAT (GenBank accession number: KJ910337) ． Sequence analysis showed that the
protein encoded by CoMCAT had a chloroplast transit peptide of 58 amino acids and contained two highly conserved motifs
of‘GQGXQ’and‘GXSXG’which were respectively located on malonyl-CoA binding site and ACP binding site． The
BL21 (DE3) bacteria harboring pET30a-CoMCAT was induced to express the recombinant protein which was about 40
kDa． The enzymatic activity of the recombinant CoMCAT was 2. 384 U·μg － 1 under the optimum condition at 30 ℃ with
pH 7. 0．【Conclusion】 The molecular cloning of the CoMCAT gene and its bioinformatics analysis，and expression
characteristics in prokaryotic cells are first reported study of C． oleifera seeds． The results not only enriches the C． oleifera
gene bank of MCATs，but lays an essential foundation for further study of the gene function and molecular genetic breeding
in C． oleifera．
Key words: Camellia oleifera; malonyl-CoA:ACP transacylase; gene cloning; prokaryotic expression; enzymatic
activity
根据脂肪酸中 FAS 复合体的存在形式，生物体
中存在 2 种脂肪酸代谢系统( FASⅠ和 FASⅡ)，其
中 FAS 复合体以融合的形式存在于胞浆中的代谢
途径称之为 FASⅠ代谢途径，以独立的单功能的蛋
白形式存在的则称为 FASⅡ代谢途径 (Mehboob
et al．，2010; Izumizono et al．，2011)。丙二酰单酰
CoA:ACP 转酰酶 (Malonyl-CoA: ACP transacylase，
MCAT) 是由 MCAT 基因编码的一种巯基酶，是
FASⅡ脂肪酸代谢途径中的 FAS 复合体组成酶之
一，在脂肪酸合成途径中起装载作用。目前认为
MCAT 是通过 ping-pong bibi 机制把丙二酰团从丙
二酰单酰 CoA 上的硫酯连接部位转移到 ACP 的磷
酸泛酰巯基乙胺臂上，从而形成丙二酰单酰 ACP，
该过程是通过两步反应完成(White et al．，2005; Li
et al．，2007; Zhang et al．，2007; Arthur et al．，2009)。
MCAT 催化生成的丙二酰单酰 ACP 不仅是脂肪酸
合成过程中的核心物质，还是酮酯酰 ACP 合成酶
(KASⅠ /Ⅱ /Ⅲ)的底物，说明 MCAT 参与了脂肪酸
代谢过程(Prigge et al．，2003; Arthur et al．，2009)。
MCAT 可能还参与多聚酮的生物合成，因此 MCAT
被认为是脂肪酸和多聚酮 2 个代谢途径的结合点
(Hong et al．，2010a; 2010b; Zhou et al．，2010)。自
Verwoert 等 ( 1992 ) 首次从大肠杆菌 ( Escherichia
coli)中克隆到 MCAT 基因以来，已经陆续从细菌、顶
复门(Apicomplexa)原虫(Apicomplexa)和植物［如玉
米(Zea mays)、欧洲油菜 ( Brassica napus)、拟南芥
(Arabidopsis thaliana)和花生( Arachis hypogaea)］等
生物中发现了 MCAT 基因的存在 (孙铭飞等，
2011)。通过多重序列比对分析发现，这些基因所
编码的氨基酸序列具有较高的相似性，各物种之
间的同源性在 20% ～ 33% 之间。在结构上，不同
物种的 MCAT 也是极其相似的，每一个 MCAT 单
体具有 2 个亚结构域:N 端是由多个 β 折叠和 α
螺旋组成的大亚基结构域，C 端是一个类似于铁氧
还原 蛋 白 折 叠 的 小 亚 基 结 构 域 ( White et al．，
2005)。尽管低等的原核生物同真核生物在进化
关系上差异很大，但由于它们的脂肪酸代谢同属
于 FASⅡ代谢途径，通过同源重组互补置换试验证
实，不同物种之间的 MCAT 在结构和功能上是高
度相似的( Zhang et al．，1998; Simon et al．，1998;
Soto et al．，2002)。
油茶(Camellia oleifera)是我国重要的木本食用
油料树种，茶油主要由油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸
组成，其含量一般在 90% 以上，是一种优质食用油
(廖书娟等，2005; 胡芳名等，2006)。但是，油茶种
仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响，这些都严
重影响和制约了油茶产业的快速发展。现代分子生
物学技术(如基因工程育种)给油茶的利用与发展
开创了崭新的局面。对油茶优质基因的分离、克隆
及功能的研究对于油茶育种具有重要意义。本文以
本实验室构建的油茶转录组数据库为基础，首次克
隆获得油茶 MCAT 基因的全长 cDNA 序列，构建其
原核表达载体在宿主细胞 BL21(DE3)中成功诱导
表达目的蛋白，并对重组蛋白进行了初步的酶活性
分析，这些工作将为今后进一步深入开展和揭示油
茶 MCAT 基因在油脂合成的代谢过程的作用奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 油茶种子总 ＲNA 的提取及单链 cDNA 合成
以油茶优良品种‘华硕’(谭晓风等，2011)的 9 月
份近 成 熟 种 子 为 材 料，提 取 种 胚 总 ＲNA (见
Invitrogen ＲNA 提取试剂盒操作手册)，检测总 ＲNA
的纯度与浓度，并以此为模板反转录合成单链
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林 业 科 学 51 卷
cDNA［方法详见 3 ＲACE ( Invitrogen )，5 ＲACE
(Clontech)与 Fermentas 试剂盒说明书］。
1. 2 MCAT 基因的克隆与生物信息学分析
BLAST 比对后，根据初步确定的 MCAT Unigene 序
列，设计特异引物(表 1)，采用 ＲACE 技术，克隆油
茶 MCAT 基因。
表 1 基因克隆所用引物序列
Tab． 1 Primer sequence used in gene cloning
引物序列
Primer sequence (5—3)
Tm /℃
F0: GTCTTAGCTTGGGAGAATACACTGCTCT 61. 1
Ｒ0: CATGATTGATAGAGACAAAGATGTTCGT 56. 7
3GSP-F:AGCCCAACCAGGAGCTAATC 57. 4
5GSP-Ｒ:GCAAGAGCAGTGTATTCTCCCAAGC 62. 2
CDS-F:TCACTTCTTCACTCACCACTCTCG 60. 4
CDS-Ｒ: TTCAATCCAAGGACACAACCG 55. 85
Pe-F:CGGGGTACCATGACTTCTTCGCTCGTAGCTCC(下划线为 KpnⅠ酶切位点 KpnⅠrestriction site is underlined) 72. 7
Pe-Ｒ:CGCGGATCCTCAAGCACTAATATTCTCAATTTC(下划线为 BamH Ⅰ酶切位点 BamH Ⅰ restriction site is underlined) 70. 85
以油茶种胚的 cDNA 为模板，采用普通 Taq 酶
扩增 Unigene 和 ＲACE 序列(25 μL)，采用高保真酶
Pfu 扩增基因全长序列(50 μL)，反应体系参照各自
说明书。Touch Down PCＲ 循环扩增条件采用 95 ℃
预变性 5 min; 95 ℃ 变性 30 s，退火 30 s［退火温度
从高于( Tm + 4)℃开始，每 7 个循环依次降低退火
温度 2 ℃直至低于(Tm － 4)℃］，72 ℃延伸 1. 5 min;
72 ℃延伸 10 min; 4 ℃保存。PCＲ 产物回收、克隆、
转化，鉴定重组子并测序。利用本地和在线软件
Vector NTI 10. 3，GENDOC，ProtParam，TargetP 1. 1
Server，ProtScale，InterProScan，SOPMA 和 SWISS-
MODEL，预测分析基因的理化性质、结构与功能。
1. 3 基因的原核表达 以获得的全长克隆质粒为
模板，通过特异引物(表 1)扩增结合酶切连接构建
到原核表达载体 pET30a 的多克隆位点，将表达载
体质粒导入 BL21(DE3)，37 ℃培养至 OD600值约为
0. 5 ～ 0. 8 后，在 28 ℃和 IPTG 终浓度为 1 mmol·L － 1
的条件下诱导表达(诱导总时间为 12 h)，每隔 2 h
取菌液进行 SDS-PAGE(12% )分析。
1. 4 重组蛋白的酶活性测定 冷冻离心收集菌体，
用 0. 1 mol·L － 1 Tris-HCl(pH 7. 4)的缓冲液洗涤 2 次
后重 悬 于 Lysis Buffer ( 0. 1 mol·L － 1 Tris-HCl，
0. 6 mol·L － 1 NaCl，1. 0 mmol·L － 1 PSMF，5. 0 mg·
mL － 1溶菌酶，pH 7. 4)中，冰浴充分搅拌后，超声破
碎细胞(380 W，工作 1 s，停 2 s，工作 6 min)，离心
(12 000 r·min － 1，20 min，4 ℃ )后，上清液即为粗酶
液，Ni 柱纯化后进行 SDS-PAGE (12% ) 分析，并用
Brandford 方法进行浓度测定。采用 α 酮戊二酸脱
氢酶(KDH)偶联系统(Molnos et al．，2003)，测定重
组蛋白在不同 pH(4. 5—8. 5)和温度(15 ～ 45 ℃ )条
件下的酶活性，相同条件每个反应重复 3 次。酶活
性单位 U 定义为单位时间 ( min) 内生成 1 nmol
NADH 所用的酶量。
2 结果与分析
2. 1 CoMCAT 基因 cDNA 全长克隆与生物信息学
分析 通过 ＲACE 技术，获得全长为 1 867 bp 的目
的片段，5 UTＲ 和 3 UTＲ 分别为 93 bp 和 643 bp，
终止密码子后有 PolyA 尾巴结构，根据序列同源性
将其命名为 CoMCAT，GenBank 登录号 KJ910337。
该基因编码区为 1 131 bp，编码 376 个氨基酸，分
子量为 39. 98 kDa，理论等电点为 6. 84，带负电荷
残基(Asp + Glu)数为 42，带正电荷残基( Arg +
Lys)数 42，分子式为 C1771 H2846 N482 O542 S13，不稳定
指数 (Ⅱ) 为 28. 49，属于典型的稳定蛋白。整个
蛋白的疏水指数为 － 2. 256 ～ 2. 078，是亲水性蛋
白，没有比较明显的跨膜区。经 TargetP 1. 1 Server
软件预测，该蛋白具有 58 个氨基酸长度的叶绿体
转运肽 (图 1，Ⅲ )。CoMCAT 存有“GQGXQ”(图
1，Ⅰ)和“GXSXG”(图 1，Ⅱ) 2 个高度保守的基
序。高级结构预测显示:α 螺旋是 CoMCAT 的主
要结构元件，而不规则卷曲则散布于整个蛋白质
中，其中 α 螺旋结构 49. 73%，β 折叠 14. 10%，β
转角 5. 05% 和 无 规 则 卷 曲 31. 12% (图 2A ) ;
CoMCAT 与人类线粒体丙二酰转移酶 2C2N_A 序
列相 似 性 最 高 为 40. 39%，图 2B 为 预 测 的
CoMCAT 三维空间模型。
2. 2 CoMCAT 基因的原核表达 在 28 ℃条件和不
同诱导时间下，相比于未加诱导剂的菌株，诱导的宿
主菌株有 1 条清晰的分子量约为 40 kDa 的条带，随
着时间延长，目的条带颜色加深(图 3A)，说明如图
4 所构建的表达载体 pET30a-CoMCAT 是正确的; Ni
051
第 3 期 王建勇等: 油茶丙二酰单酰 CoA: ACP 转酰基酶基因的克隆与原核表达
图 1 CoMCAT 与其他植物 MCAT 蛋白质序列的多重比较
Fig． 1 Multiple comparisons between CoMCAT and other MCATs
1: 油茶 Camellia oleifera ( KJ910337 ) ; 2: 大豆 Glycine max( NP _001238312 ) ; 3: 番茄 Solanum lycopersicum ( XP _004228628 ) ; 4: 黄瓜
Cucumis sativus(XP_004145242) ; 5: 可可 Theobroma cacao( XP_007016988 ) ; 6: 辣椒 Capsicum annuum( ACF17665 ) ; 7: 烟草 Nicotiana
tabacum(AFE88235) ; 8: 马铃薯 Solanum tuberosum ( XP _006348452 ) ; 9: 花生 Arachis hypogaea ( ACJ07138 ) ． Ι: GQGXQ 基序 GQGXQ
motif; ΙΙ: GXSXG 基序 GXSXG motif; Ш: CoMCAT 的叶绿体转运肽序列 A chloroplast transit peptide of CoMCAT．
图 2 CoMCAT 蛋白质的结构预测
Fig． 2 Structure predictions of CoMCAT
A: 二级结构; B:三级结构。A: Secondary structure; B:3D structure．
柱纯化后，有条单一的分子量约为 40 kDa 的条带
(图 3B )，这同预测的分子量大小相一致，说明
CoMCAT 基 因 在 BL21 ( DE3 ) 中 得 到 了 表 达。
Brandford 方 法 测 定，蛋 白 纯 化 后 的 浓 度 约
为125 μg·mL － 1。
2. 3 CoMCAT 基因表达产物酶活性分析 不同温
度和 pH 条件下所表达 CoMCAT 酶活性分析见图 5，
当温度在 30 ℃ 和 pH 为 7. 0 时，该蛋白的活性最
高，且当二者超过最佳值之后，其活性均表现出急骤
下降，说明高温和偏碱性不利于 CoMCAT 的活性表
现。经计算，所获得的重组蛋白 CoMCAT 的比酶活
性约为 2. 384 U·μg － 1。
3 讨论
自 Serre 等(1994)报道了大肠杆菌 MCAT 的晶
体结构以来，目前已经解析了多种生物 MCAT 的晶
体结构(Keatinge-Clay et al．，2003; Li et al．，2007;
Zhang et al．，2007; Hong et al．，2010b)。同源比对
发现，CoMCAT 存在“GQGXQ”和“GXSXG”2 个高度
保守的基序，一个位于 malonyl-CoA 结合位点上，另
外一个位于 ACP 结合位点上，这同已报道的 MCAT
氨基酸序列特征相一致 ( Li et al．，2007; Zhang
151
林 业 科 学 51 卷
图 3 pET30a-CoMCAT 表达蛋白的 SDS-PAGE 分析
Fig． 3 SDS-PAGE analysis of MCAT protein expression in BL21(DE3) transformed with pET30a-CoMCAT
A:不同诱导时间的菌液蛋白检测(M:蛋白相对分子标量; 1:未经 IPTG 诱导的重组菌总蛋白; 2 － 7: IPTG 分别诱
导 2，4，6，8，10，12 h 重组菌总蛋白) ; B:纯化后的蛋白检测。
A: Detection of crude proteins in different time (M: Protein marker; 1: Total protein of BL21 ( DE3 ) ; 2 － 7: Crude
proteins of pET30a-CoMCAT induced for 2，4，6，8，10，12 hours) ; B: Detection of purified protein．
图 4 重组表达载体 pET30a-CoMCAT
Fig． 4 Ｒecombinant vector of pET30a-CoMCAT
et al．，2007); 通过结构信息分析证实，这 2 个基序
与 MCAT 的 催 化 功 能 密 切 相 关 ( Hong et al．，
2010b)。经在线软件预测 CoMCAT 蛋白序列具有
58 个氨基酸长度的叶绿体转运肽，这同已报道的
MCAT 基因序列的 5 端具有编码质体( plastid)靶向
的引导肽结论相一致 (孙铭飞等，2010; Goodman
et al．，2007)。该基因是从近成熟的种子中分离的，
通常种子的脂质合成部位是 plastid(分为白色体、有
色体和叶绿体，均由前质体发育分化而来)，根据油
茶‘华硕’种子的油脂合成规律(曾艳玲等，2014)，
该基因可能先在前质体中表达，然后才被转运至叶
绿体而发挥油脂合成作用。
在原核表达系统中，温度和 pH 是影响蛋白可
溶性和酶活性的最为明显因素 ( Srensen et al．，
2005)，不利的条件不仅会引起重组蛋白多肽的错
误折叠而形成包涵体结构［包涵体表达蛋白在复性
后几乎完全没有或仅有很低的活性 (孙铭飞等，
图 5 不同温度(A)和 pH(B)对重组蛋白
CoMCAT 酶活性的影响
Fig． 5 Effects of temperatures(A) and pH(B)
on enzymatic activity of recombinant CoMCAT
2010)］，还影响酶与底物的正确或高效的结合等而
影响酶的功能，这提示所表达的蛋白若用于研究其
结构或功能，需要探索和优化表达条件。本研究所
获得的重组蛋白 CoMCAT 的最佳催化功能条件为
30 ℃和 pH 7. 0，这为今后研究 MCAT 蛋白的功能奠
定了实验条件基础。目前，虽然 MCAT 的研究取得
了诸多的进展，但是必须看到的是这些成果主要集
251
第 3 期 王建勇等: 油茶丙二酰单酰 CoA: ACP 转酰基酶基因的克隆与原核表达
中于少数的原核生物和顶复门寄生虫上，在其他物
种上的研究几乎是一片空白。未来针对 MCAT 的
研究热点将主要集中在以下方面:由于原核生物、顶
复门原虫和大部分植物的 FASⅡ代谢酶在空间结构
和酶学特征上与高等动物的 FASⅠ代谢酶明显不
同，这可能为研究和开发抗病原体药物提供理想靶
向位点(Lu et al．，2008; Chan et al．，2010; Du et al．，
2010; Zhang et al．，2007)，而 MCAT 是 FASⅡ系统
的关键酶，对 MCAT 的研究，特别是 MCAT 在促进
丙二酰单酰 CoA 转化丙二酰单酰 ACP 的作用机制
的研究将会越来越成为抗菌、抗原虫及抗真菌药等
研究的焦点问题之一; 有研究证实，在大肠杆菌中
过量表达 MCAT 基因能提高脂肪酸的产量 ( Zhang
et al．，2012)，这为 MCAT 基因应用于油料作物的遗
传改良与育种指明了方向。
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(责任编辑 徐 红)
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