全 文 ：第 4 卷 第 2 期
1 , 9 1 年 4 月
林业 科 学研 究
FO R E S T R E S E A R C H
V o l
.
4
,
N o
. 念
A P r
。 ,
1 9 9 1
秃 杉 的 组 织 培 养釜
成小飞 李文铀
(中国林业科学研究院林业研究所 )
摘要 取秃衫吸胀种子的胚 、 发育10 ~ 12 天和20 天左右的苗端作外植体 , 进行不定芽诱导 ,
结果表明: 不定芽诱导率明显不同 , 分别为 3 1 . 4 % 、 80 . 0 % 和 0 。 不定芽的发生率主要 取 决 于
外植体的发育时期 , 其次为B人浓度。 B A 的最适浓度为2 . 0 m g/ L 。 割取嫩 枝 插入1 /2 M S 十 IBA
1
.
0 ~ 2
.
o m g / L的生根培养基中, 生根率可达 80 % 以上 。 割取嫩枝后的基部转入 M S 十 1 . 。~ 2 . 。
m g / L BA + 。. 5 m g / L IA A 的培养基中 , 不定芽以每周期 3 ~ 5 倍的速度增加 。
关扭词 秃衫 , 组织培养 , 不定芽诱导 . 增殖
秃杉 (T a 细a n‘a flo : s￡a n a G a u s s en ) 属杉科台湾杉属 , 是国家一级保护树种 I, l。 秃杉既
是珍贵树种又是速生树种 。 目前秃杉主要是用种子繁殖 , 由于其结实期晚 、 结实量少 、 种子
发芽率低 , 加之秃杉自然分布区窄 , 近年来乱砍滥伐等原因造成秃杉林分减少 , 要扩大繁殖
栽培 , 就需解决苗木问题 。
自从 1 9 7 4年 G a u th e r e t首次在 p in u s p a lu st : 玄s 胚培养中获得完整植株后 , 有关针叶树种
通过组织培养获得完整植株的报道迅速增加工2一l , 其中 p 滚。、s , a d玄a : a 和 s e。: o ia s e彻己r o i; e ;
的微繁殖技术已应 用于大规模商业生产 。 对于种子稀少的珍贵树木和有性杂交获得的优良杂
种, 组织培养是一种很有潜力的微繁殖手段 。
本试验以秃杉苗端作外植体 , 成功地诱导了不定芽产生 , 并获得了较高的生根率 。
1 材料与方法
1
.
1 培养甚的配制
(1 ) 种子萌发培养基 : 6 . 5 9 / L 琼脂。
(2 ) 不定芽诱导培养基 (M : ) : 选用 M S 、 M CM (针叶树培养基)、 W hi te 和H 培养基为
基本培养基 [。, ’。] , 按 L : 。(4 3)正交设计 [川 , 分别加入0 . 0 5 ~ 一 0 m g / L IA A和 1 . 0一8 . o m g /L
BA
, 附加3 %蔗搪和6 . 0 9 / L 琼脂 。
(3 ) 不定芽生长培养基(M Z ) : 告M S 附加2 %蔗搪和 6 。5 9 / L 琼脂 。
(4 ) 不定芽增殖培养基 (M 3 ) : M S + 1 . 0一2 . 0 m g / L B A + o . s m g /L IA A , 附加3 %蔗
糖和 6 . 0 m g / L 琼脂。
(5) 生根培养基 (M ‘) : 专M S + 。. 5~ 4 . 0 m g / L IBA , 附加2 %蔗搪和6 。 5 g/ L 琼脂 。
本文于 1 3的年 8 月 2 3 日收到 。
* 该文属林业部攻关课题 “珍稀渐危树种 的萦殖 与保存 ”的一部分 。
1 4 B 林 业 科 学 研 究 4 卷
以上培养基的p H值均调至6 。 8 ~ 7 . 。,
1
.
2 培养条件及培养程序
接种后的培养基置于光照培养箱 内 ,
期为15 h 光照 , g h 黑暗 。 生根培养时 ,
培养程序 :
在0 . 8 k g / e m Z压力下消毒 2 0 m in 。
温度为 24 士 1 ℃ , 光照强度约为 1 S OO lx , 光 照周
光照较弱 , 约为8 0 ~ 1 0 O ix , 其余条件同上 。
淞 、多 吸 胀的胚 、l.种于 - ~ , ( 之 咙 . * 一 —‘“、,刃 切 田 「, ‘抽 入1S U一 G o d 墩枝丛嫩 ‘之旱_ ,占 ~ - 一 嫩 杜 入I,~ 一. . - . . ~ ~ . ~ ~ 口
5 0 ~ 6 0 d
小植株
|卜l一
秃杉种子采自贵州雷公山 。 挑选含饱满胚的种子 , 用60 ~ 70 ℃温水浸泡 3 一 4 h (自然
冷却 ) , 7 0 %酒精消毒 1 一 Z m in , 0 . 1 % H gG I: 加几滴吐温8 0浸泡 8 ~ i o m in , 无 菌水冲
洗 4 ~ 5 次 。 最后将种子接种于萌发培养基上 , 置于光照培养箱内发芽 。
分别取吸胀种子的胚 、 种子发芽 10 ~ 12 天和 20 天左右的苗端 (包括子叶 、 顶端和部 分 下
胚轴 ) , 接种于 M 、培养基上 , 进行不定芽诱导 。 30 天后 (图版 I 一1 , 2) , 将不定芽丛转入 M :
培养基 (一个月换一次新鲜培养基) 。当嫩枝伸长到 1 ~ 2 c m (约需50 ~ 60 天 (图版 I 一3 , 4) ,
割取嫩枝 , 插入 M : 培养基中 , 诱导生根 。 割剩后的基部切成约。. 5 c m 的小块 , 转入M 3培养
基 。 按以上方式 , 不断重复 , 每周期大约需 3 个月 。
嫩枝插入 M ‘培养基 50 ~ 60 天后 , 不定根长达 。. 5 ~ 1 . o c m (图 版 I 一 6 ) 。 将 培养瓶移
出培养箱 , 置于窗台上锻炼一个星期 , 然后将小植株从培养瓶中取出 , 在自来水下洗除培养
基 , 移植于花盆中 (基质为消毒过的林下腐殖质土) , 用塑料薄膜搜盖 , 以保持盆内湿度 , 1
~ 2 天浇水一次 。 10 天左右揭去塑料薄膜 , 约一个月后小植株恢复正常生长(图版 工一7) 。
2 试验结果
2
.
1 不同时期外位体上不定芽发生
外植体转入M : 培养基 30 天后 , 检查其不定芽发生 (表 1 ) 。 从表 1 可以看出, 外植体发育
衰 1 滋介对不同外位体不定芽发生率的形晌
不 同 外 殖 体 I八A 浓度 (m g / L ) BA 浓度(功 g / L ) 外植体数(个) 不定芽丛致 (个 ) 不 定芽发生率(% )
;;
61化08,1褐32目工n一“亡口no.且口自三组
种子吸胀后 的胚
种 子 发 芽
1 Oe 1 2 d
的 苗 端
1
.
0
2
.
0
4
.
0
4 6
4 8
4 2
6 5
.
1
8 0
.
0
6 9
.
1
八‘L6种子发芽20 d 的
苗 端
5 0
4 8
5心 :
.
::
心‘.,n己
2 期 成小飞等 : 秃杉的组织培养
时期不同, 不定芽发生率明显不同。 以种子发芽 10 ~ 12 天的苗端作外植体最好 , 最高不定芽
发生率为8 0 。 O % ; 以吸胀种子的胚作外植体 , 最高不定芽发生率仅为31 。 4 % ; 外植体 为 种
子发芽20 天的苗端时 , 基本上无不定芽形成 , 只有顶芽生长 。
从表 1 还可以看出 , 不同发育时期的外植体所需最适激素浓度不一样 , 吸胀后的胚最适
的B A 浓度为1 . o m g /L , 随着B A 浓度增加 , 不定芽发生率下降 , 部分不定芽出现玻璃化现
象 。 当 B A 浓度增加到4 。 o m 盯L时 , 外植体全部褐化死亡 。 10 ~ 12 天的苗端最适的 B A 浓度
为2 . O m g / L , 较前者高 , 这是因为与胚芽相比, 苗端已开始进入营养生长 , 要求较高浓 度
的外源激素作用 , 才能改变其发育方向。
2
。
2 不同激素浓度和培养基对不定芽发生的影晌 、
将发芽10 一 12 天的苗端 , 接入按几。(4 “)正交设计安排的M :培养基上 。 转入 M Z培养基 30
天后 , 检查外植体上不定芽的发生 , 结果见表 2 。
方差分析结果 (表 3 )表明 , 基本培养基类型和IA A 浓度对外植体不定芽发生无明显影响 ,
BA 浓度对不定芽的发生影响极显著 。在B A 四个浓度水平1 . 0 、 2 。 o 、 4 . 0和 8 . o m g / L 上 , 外
植体不定芽发生率分别为65 . 5 % 、 7 5 . 。% 、 5 5 。8 %和21 . 3 % 。 其中以BA 浓度为2 。。m g /L
表 2 不同滋索浓度和培养基类型对外植体不定芽发生的影晌
试验号 培 养 基 BA (m g / L ) IA A (m g / L ) 接种数(个) 不定芽丛数(个 ) 不定芽发生率(%)
63817024956293074肠61783501 . 心
2
.
0
4
.
0
8
.
0
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0
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.
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4 8
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。
5
表 3 方 差 分 析 结 果
方 差 来 源 由 度 离 差 平 方 和 均 方 F值
培 养 基
BA 浓 度
IA A浓度
剩 余
总 和
6
1 5
1 4 2
.
2 5
6 5 9 3
.
2 5
80
。
2 5
3 0 8
7 1 2 3
.
7 5
4 7
.
4 2
2 1 9 7
。
7 5
2 6
。
7 5
5 1
。
3 3
0
。
9 2
乙2 . 8 2二
0
。
5 2
F 。( 0
.
0 5 ) 二 4
.
F 。( 。
.
01 )
二 9 .
7 6
7 8
1 50 林 业 科 学 研 究 4 卷
时 , 不定芽发生率最高 。 基本培养基类型和 IA A 浓度虽然对外植体不定芽发生率无显 著 影
响 , 但在不同的培养基上和附加不同浓度的IA A , 外植体不定芽发生率也有所不同。 培养纂
中以M S培养基较好 , 其不定芽发生率为58 . 5 % , 在 M CM , H 和 W hi te 培养基上 , 不定芽
发生率分别为52 。 8 % 、 5 5 . 8 %和5 0 . 8 % 。 IA A浓度在0 。 s m g / L水平上较好 , 不定芽发生率
为5 7 . 8 % , 其他浓度水平 0 . 05 、 0 . 1和 1 . o m g / L上的不定芽发生率分别 为5 5 . 0 % 、 52 . 3 %
和52 . 0 % 。 以上试验结果表明 , 以 MS为墓本培养基 , 附加 2 . o m g/ L B A和。. s m g / L IA A ,
可获得较高的外植体不定芽发生率 。
2
。
3 不定芽的增殖
割取嫩枝 后 , 将基部转入 M : 培养基上 , 在激素 的作 用下 , 每个嫩枝的基部形成 3 一 5
个不定枝 (图版 I 一 5 ) 。 转入 M Z 培养墓上 , 不定芽生长约60 天后 , 嫩枝伸长 达 1 ~ , 2 c m 。
割取上部诱导其生根 , 割取的嫩枝数为前一次的 3 一 5 倍 , 割取后的基 部又转入 M : 培养丛
中。 经过三个周期的转换培养后 , 培养材料的不定芽发生能力没有减弱 。 如果一个外植体初
次培养发生 4 个不定芽 , 经 第二代增爪后 , 获得 12 ~ 20 个不定芽 , 第三代增殖后 , 不定芽数
增加到 36 ~ 1 0 个 。按理论推算每年可增危 4 代 , 那么一个外植体经一年培养后可获 得 150 ~
了0 0个或更多嫩枝 。
2
。
4 生根
割取嫩枝插入 M ‘培养墓50 天后的生根结果见 表 4 。 从该表看 , IBA 浓 度 为 0 . 5一 4 。 。
m g / L 时 , 嫩枝生根率均在 75 % 以上 , IBA 浓 度 为 1 。 O~ 2 . 0 m g / L 时 , 嫩 枝生根率高达
IB八浓度
(m g / I )
衰 4 嫩技生根结果
嫩 伎 数 生 根 数
(个 ) (个 )
生 根 率
(% )
:
.
:
8 0
71
9 l
4 0
6 0
5 9
7 9
3 0
75
.
0
83
.
1
86
.
8
75
.
Q
8 3
.
1 %一 8 6 . 8 % 。 从生根情况看 , IB A 浓度
为 0 . 5~ l 。0 m g / L 时 , 嫩枝 基部很少产 生
愈伤组织 , 生根条数一般为 1 ~ 3 根 。 随着
IB A 浓度增加 , 嫩枝基部逐渐产生愈伤组织 ,
IB A 浓度为 2 . 0 m g / L 时 , 一些嫩枝基部有
少量愈伤组织产生 , 生根条数多为 3 ~ 5 根 。
IB A 浓度增加到 4 . 0 m g / L 时 , 嫩枝基部产
生许多愈伤组织 , 根的生长受到抑制 , 生根率下降。 因此 , 从该试验结果看 , 在秃杉嫩枝生根
培养基中 , IBA 的最适浓度为 1 . 0 ~ 2 。 。m g / L 。
3 讨 论
以吸胀种子的胚 、 发芽后10 ~ 12 天和20 天的苗端作外植体 , 一其最高不定芽发生率分别为
31
.
4 %
、
8。 %和0 . 1 2 % , 其中以幼小苗端作外植体 , 其不定芽发生率明显地高 于 其 他 两
种 。 贺竹梅等曾以秃杉未萌发种子的胚作外植体, 胚芽端不定芽发生 率 为 3 % 〔’“l。 以上结
果说明 , 秃杉外植体上不定芽的诱导首先取决于外植体获取 时 期。 M ur as hi g el “J 指出 , 离
体诱导形态发生的成功与否的关键在于选择适合的外植体 。 A it k e n[ ’“}等也注 意 到了外植体
的选择对辐射松(Pi nu : : a d iat a) 不定芽形成的重要性 。 他们取萌发后种子的子叶作外植体 ,
其不定芽诱导能力要明显地 .拓于以吸胀种子的子叶作 外 植 体 的 诱 异 能 力 。 M ot t 〔‘刁{ 也 采
用 };寸样 方 法 米 捉 尚 p in u : 二o o tic o la 不定芽形J戈的能力 。 W e b b l‘6 ] 曾 报 道 , 在力11勒比松
2 期 成小飞等 : 秃衫的组织培养
(p io u : ‘a1 动ae a ) 胚培养中 , 种子在无激素培养基中预培一段时间 能加快不定芽的形成 , 增
加不定芽发生数量 。 此外 , A it k e立 等在辐射松子叶培养中还发现 , 外植体年龄相差几天 (5
~ 10 天 )能显著地影响子叶上不定芽发生的能力 。 这些都说明选择外植体适 合的发育时期是
至关重要的。 秃杉的试验结果也证明了上述报道具有普遍性 。
B o n ga
〔‘“l指出 , 在茎端发育的转变过程中 , 存在着很大的可塑性 。在茎端 , 发育方向有规
律性地变换 , 如叶原基或侧芽原基的形成 , 在每一转变过程中 , 分生组织中原存在的决定因素
哲时部分地消失 , 临时获得某种程度的器官发生能力 。 秃杉种子从休眠到幼叶发生过程 , 即
为从休眠状态到营养生长的转变过程 , 发芽 10 ~ 12 天的苗端即处于这个转变过程中。 这时的
苗端 已开始进入生长状态 , 幼叶原基还未形成或仅为几个未分化的分生细胞 ‘) , 在外源 激素
作用下 , 苗端或刚形成的幼叶原基 , 容易改变发育方向 , 形成不定芽 。 而种子萌发20 天左右
的苗端 , 幼叶已形成 , 苗端已完全进入营养生长状态 , 获得了某种决定因素 , 外源激素的诱
导 已不能改变其发育方向 , 外植体只能继续朝正常苗端方向发展 。
影响离体形态发生的第二个关键因素是选择适宜的培养条件 (包括培养基 、 外源激素) 。
试验结果表明 , 秃杉苗端培养对培养基要求不严 , 无论是以高浓度盐的M S 或MCM培养基 ,
还是以低浓度盐的 W h ite 或H培养基作基本培养基 , 对外植体不定芽发生均无明显影响 。 在
秃杉幼苗苗端培养中 , 决定不定芽发生的另一个关键因素是细胞分裂素 。对大多数树种来说 ,
细胞分裂素是离体器官发生必需的外源激素 , 细胞分裂素与生长素的适当配比通常决定器官
发生的类型 。 在许多针叶树培养中 , 仅附加细胞分裂素就可以诱导不定芽发生 , 如辐射松子
叶在仅加B A 的培养基上 , 就可以诱导分生组织形成和不定芽分化 , 在不加 B A 的培养基上 ,
子叶则按正常发育的方向发展I‘冶〕。 秃杉苗端培养情况与上述类似 , 外植 体只 有在加激素的
培养基上 , 不定芽才会产生 , 在不加激素的培养基上 , 苗端朝正常方向发育。 在加 BA 的培
养基上 , 附加一定浓度范围的IA A 对秃杉外植体不定芽发生无明显影响 , 这也说明影响不定
芽形成的主要外源激素是 BA 。 BA 一方面诱导不定芽形成 , 另一方面又抑制其生长 , 而且随
着B A 浓度的升高 , 抑制作用加强 。 因此 , 不定芽诱导形成后 , 外植体必须 转入无激素的培
养基 , 使不定芽生长 。
该试验对秃杉的组织培养获得了较大的繁殖系数和较高的生根率 。此外 , 秃杉不定芽起源
于分生组织细胞 , 不通过愈伤组织 ‘) , 获得的植株具有稳定的遗传性 , 能保持母本的遗传特性。
参 考 文 献
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12
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15 2 林 亚 料 学 研 克 4 卷
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B o st o n
,
1
*
3 1 2
.
T is s u e C u ltu r e o f T a io a n ia jl
o u s ia n a G a u S S e n
Ch e n g X ia o fe i L 1 W e n d ia n
(T h 。 R e s e a r e h J 。sr‘tu r。 o j F o r 。: Ir夕 C A F )
A bs tr a et T he em b ryo o f im b ib itio n a l s e e d
,
th e a Pe x o f 1 0~ 1 2 一 o r 2 0二
d a y三0 ld s e e d lin g (w h ic h in e lu d e d c o ty le d o n s , sh o o t a Pe x a n d Z~ 3 m m hyP-
o e o tyl s tu b ) w e r e u 3 e d a s e x Pla n ts to in d u e e the a d v e n tit io u s b u d s
。
T he
r e s u lt sh o w e d th a t th e Pe r e e n ta g e o f th e in d u e e d a d ve n tit io u s b u d s o f th e
3 e x P la n ts w e r e 3 1
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4 %
, 8 0 % a n d 0 r e sPe e t iv e ly
。
T h e P r o life r a tio n o f
a d ve n tit io u s b u d w a s fir s t ly d ePe n d o n th e d e v e lo Pm e n ta l s ta g e o f the
e x Pla n t
, a n d s e e o n d ly o n th e e o n e e n t ra tio n o f N 6
一
b e n z yl a d e n in e (BA )
.
T h e o Ptim u m e o n e e n t r a t io n o f BA fo r th e in d u e t io n o f a d v e n tit io u s b u d
w a 3 2
.
0 m g / L
。
T h e e lo n g a te d sh o o t s w e r e in e u b a te d in l / 2 M u r a sh ig e a n d
Sk o o g (M S ) m e d iu m su PPle m e n te d w ith 1
.
0~ 2
.
o m g / L IB A t o in d u e e e r o o
-
t in g
,
8 0 % o f th e sh o o ts w e r e r o o te d
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T he r e s id u a l b a s e s o f the sh o o ts
w e r e t r a n sfe r r e d to M S m e d iu m in th e p r e s e n e e o f 1
.
0一2 . o m g / L BA , a n d
3~ 5 a d v e n t itio u 3 b u d s w e r e r e罗 n e r a te d in e a c h ba s e 。
K ey w o rd s T a f班an fa fld u 3奋a n a : tis3 u e c u ltu r e ; a d v e n t itio u s b u d ; Pr o lif:
e r a tio l